Name: Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a estudar genes letais embrionários em tumores de nervo periférico maligno usando modelos de camundongo geneticamente modificados. Este método permite analisar efeitos de perda de função in vivo em oncologia e neurociência.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e AVC (R01 NS048353, R01 NS109655), Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804), Departamento de Defesa (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 e W81XWH-15-1-0193) e The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 e 2015-05-007).

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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Os métodos detalhados aqui apresentados foram desenvolvidos utilizando-se um modelo GEM de MPNSTs. No entanto, se o tecido tumoral de interesse pode ser dispersado em células individuais, essas metodologias são facilmente adaptáveis para vários tipos de tumores surgidos em GEMs. É importante garantir que o alelo floxed não resulte em i) diminuição da sobrevida que pode dificultar a obtenção de camundongos suficientes para a triagem de tumores, ou ii) aumento da latência tumoral que pode dificultar a obtenção de camundong...

Antes das últimas duas décadas, o tratamento dos cânceres humanos dependia fortemente de radioterapia e agentes quimioterápicos que visavam rapidamente proliferar populações celulares, danificando o DNA ou inibindo a síntese de DNA. Embora essas abordagens tenham inibido o crescimento de células cancerosas, elas também tiveram efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais que proliferam rapidamente, como células epiteliais intestinais e células folículos capilares. Mais recentemente, a terapia oncológica começou a utilizar agentes quimioterápicos que visam precisamente proteínas dentro de vias de sinalização que são criticamente importantes para o crescimento da neoplasia de um paciente individual. Essa abordagem, comumente referida como "Medicina de Precisão", levou ao desenvolvimento de um repertório cada vez maior de anticorpos monoclonais e pequenos inibidores moleculares. Esses agentes efetivamente inibem a proliferação e a sobrevivência das células tumorais, evitando os efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais vistos com agentes quimioterápicos convencionais e radioterapia. Anticorpos monoclonais usados para o tratamento de cânceres humanos mais comumente visam moléculas de superfície celular, como receptores de fator de crescimento1 (por exemplo, a grande família de quinases receptoras de membrana) e moduladores de resposta imune2 (por exemplo, proteína de morte celular programada 1, liga-morte programada 1). Pequenos inibidores moleculares podem inibir proteínas da superfície celular ou proteínas de sinalização que estão localizadas intracelularmente3. No entanto, para efetivamente empregar esses novos agentes terapêuticos, deve-se estabelecer que um determinado câncer depende da molécula que está sendo alvo de um agente terapêutico candidato.
Embora esses novos agentes terapêuticos tenham efeitos mais focalizadas, muitos deles ainda inibem a ação de mais de uma proteína. Além disso, vários agentes com eficácia e especificidade variadas estão frequentemente disponíveis para atingir uma proteína específica. Consequentemente, durante investigações pré-clínicas, é prudente usar abordagens adicionais, como a ablação genética para validar uma proteína candidata como alvo terapêutico. Uma abordagem especialmente útil para validar uma proteína como alvo terapêutico é ablate o gene codificando a proteína candidata em um modelo animal geneticamente modificado que desenvolve o tipo específico de câncer de interesse. Essa abordagem pode ser relativamente simples se ratos com uma mutação nula (ou uma mutação natural, uma mutação nula geneticamente modificada [um "nocaute"], ou uma mutação nula introduzida por uma armadilha genética) estiverem disponíveis, e os camundongos forem viáveis até a idade adulta. Infelizmente, camundongos com uma mutação nula que atendem a esses critérios muitas vezes não estão disponíveis, tipicamente porque a mutação nula resulta em morte embrionária ou nos primeiros dias de vida pós-natal. Nesta circunstância, camundongos propensos a desenvolver o tipo de interesse tumoral podem, em vez disso, ser cruzados para camundongos nos quais segmentos-chave do gene de interesse são flanqueados por locais loxP ("floxed"), o que permite que o gene seja ablado introduzindo um transgene expressando Cre recombinase nas células tumorais (um nocaute condicional). Essa abordagem oferece várias vantagens. Primeiro, se um driver Cre estiver disponível que seja expresso no tumor, mas não no tipo celular que levou à morte em nocautes convencionais, essa abordagem pode potencialmente validar o alvo terapêutico do candidato. Em segundo lugar, a ablação do gene que codifica a proteína candidata em células tumorais, mas não em outros elementos intratumorais, como fibroblastos ou células imunes associadas ao tumor, permite ao pesquisador distinguir entre efeitos célula-autônomos e não-células-autônomas do alvo terapêutico. Finalmente, um driver Cre indutível de tamoxifen (CreERT2) permite que o investigador exclua o gene de interesse em diferentes estágios no desenvolvimento do tumor e defina a janela em que o agente terapêutico candidato é mais provável que seja eficaz.
Infelizmente, há também questões técnicas que podem limitar o uso de nocautes condicionais em tumores surgidos em modelos GEM. Por exemplo, um driver Cre que é expresso em células tumorais e evita a exclusão genética em células normais essenciais para a vida pode não estar disponível. Outra questão, que pode ser subestimada, é que os drivers Cre e CreERT2 muitas vezes variavelmente ablatam alelos floxed em camundongos, resultando em mosaico para a mutação nula em um câncer GEM. Quando isso ocorrer, as células tumorais nas quais o gene alvo não foi ablado continuarão a proliferar rapidamente, superculcendo as células tumorais com alelos ablados. O mosaicismo nas linhas de driver cre pode ocorrer devido à expressão cre não onipresente na linhagem direcionada e pela recombinação fracassada em células individuais independentes da expressão Cre4. Este é um fenômeno conhecido dos drivers Cre que é dependente do tipo celular e deve ser considerado durante o desenho experimental e interpretação de dados. O mosaico pode mascarar o efeito do nocaute e levar um investigador a concluir erroneamente que o gene de interesse não é essencial para a proliferação e/ou sobrevivência das células tumorais e, portanto, não é um alvo terapêutico válido.
Vários desses problemas foram encontrados em um estudo anterior que tentou determinar se o receptor tyrosine quinase erbB4 era um alvo terapêutico potencial nas células MPNST5. Nesses estudos, foram utilizados camundongos que expressam um transgene codificando o fator de crescimento gliano isoforme-β3 (GGFβ3) sob o controle do promotor zero de proteína de mielina específico da célula Schwann (camundongos P 0-GGFβ3). Os camundongos P 0-GGFβ3 desenvolvem neurofibromas plexiformes múltiplos que avançam para se tornarem MPNSTs através de um processo que recapitula os processos de patogênese neurofibroma e progressão neurofibroma-MPNST plexiforme observada em pacientes com a síndrome de susceptibilidade do tumor autossômico dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1)6. Quando atravessado para camundongos com uma mutação nula Trp53, o P 0-GGFβ3 resultante; Os camundongos Trp53+/- desenvolvem MPNSTs de novo como é visto no cis-Nf1+/-; Trp53+/- ratos.
Esses MPNSTs recapitulam a progressão das lesões grau II da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a OMS, observadas em humanos7. Emcamundongos P 0-GGFβ3, os MPNSTs surgem dentro de neurofibromas plexiformes pré-existentes no nervo trigêmeo (58%) e raízes do nervo dorsal espinhal (68%)7; os MPNSTs surgidos em P 0-GGFβ3; Os ratos Trp53+/- têm uma distribuição altamente semelhante. Em humanos, os MPNSTs mais comumente surgem no nervo ciático seguido pelo plexo braquial, raízes nervosas espinhais, vagus, femoral, mediana, plexo sacral, obturador popliteal e nervos tibiais e ulnar posteriores8. Esta distribuição de tumores nesses modelos GEM é um pouco diferente do que é visto em humanos. No entanto, os MPNSTs que surgem em P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Os camundongos trp53+/- são histologicamente idênticos aos MPNSTs humanos, carregam muitas das mesmas mutações vistas nos MPNSTs humanos e recapitulam o processo de progressão neurofibroma-MPNST observado em pacientes NF1. A geração de P 0-GGFβ3 ou P0-GGFβ3; Trp53+/- camundongos que eram Erbb4-/- não eram viáveis, pois camundongos com dois alelos nulos Erbb4 morrem no útero no dia embrionário 10,5 secundários a defeitos cardíacos9. Porque resgatar a expressão Erbb4 no coração introduzindo um transgene Erbb4 específico para o coração (cadeia pesada de α-miosina (MHC)-Erbb4) resulta em erbb4-/- camundongos10 viáveis, a geração de ratos com um complicado P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genótipo foi tentado.
No entanto, os acasalamentos não produziram camundongos nas razões mendelianas esperadas, indicando que o genótipo desejado era deletério. Portanto, a geração de P 0-GGFβ3; Trp53+/- ratos com alelos Erbb4 floxed11 e um driver CreERT2 foi tentado para permitir a exclusão de Erbb4 nos MPNSTs surgidos nestes ratos. Nesses animais, numerosas células tumorais com alelos Erbb4 intactos ainda estavam presentes (mosaico). O mosaico observado pode resultar da entrega ineficiente de tamoxifen, que resultou em diferenças na eficiência de recombinação dentro do tecido. A possibilidade de mecanismos compensatórios espontâneos poderia contribuir ainda mais para o mosaico na recombinação mediada pelo tamoxifen, ignorando a exigência de expressão de Erbb4. É viável que a perda de Trp53 torne as células tumorais suscetíveis a mutações espontâneas adicionais "permissivas" que possam confundir a interpretação dos dados. Como parecia provável que as células MPNST intactas Erbb4 mascarassem as consequências de ablar Erbb4 em outras células tumorais, essa abordagem foi abandonada.
Esses obstáculos levaram ao desenvolvimento de uma metodologia para ablação de células MPNST de passagem muito precoce usando um adenovírus expressando Cre recombinase e eGFP. Essas células podem ser separadas de células não infectadas usando FACS, o que reduz significativamente o mosaico para o gene Erbb4 ablado. Abaixo, são descritos os métodos utilizados para isso, juntamente com os métodos utilizados para avaliar os efeitos da ablação genética in vitro e in vivo. O protocolo a seguir é um exemplo de como produzir camundongos portadores de tumores que produzem tumores portadores de alelos floxados de genes letais embrionários de interesse para ex vivo excisão antes da avaliação de crescimento do tumor in vivo a allograft. Isso inclui uma descrição das abordagens usadas para analisar o efeito que a ablação de Erbb4 exerce sobre a proliferação de células tumorais, sobrevivência e expressão genética in vitro e proliferação, sobrevivência e angiogênese em alóxeris ortotópicos.

<table><tbody><tr>Núcleo do vetor de transferência de genes <td>Ad5CMV-eGFP</td><td>, Univ de Iowa</td><td>VVC-U de Iowa-4</td><td></td>Núcleo do</tr><tr>vetor de transferência<td>de genes Ad5CMVCre-eGFP</td><td>, Univ de Iowa</td><td>VVC-U de Iowa-1174</td><td></td></tr><tr><td>alexa 568 anticorpo secundário</td><td>Thermo / Fisher</td><td>GaR A11036</td><td></td></tr><tr><td>Software de código aberto de biocondutores para</td><td>bioinformática Bioconductor</td><td>http://www.bioconductor.org</td><td>ferramenta de análise estatística alternativa usada para a etapa 4.4</td></tr><tr><td>CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de imagem Celigo</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Stripper</td><td>Corning</td><td>25-056-Cl</td><td>mistura de quelantes</td></tr><tr><td>Kit de coloração DAB</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7800</td><td></td></tr><tr><td>DAVID (Banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada)</td><td>DAVID</td><td>https://david.ncifcrf.gov</td><td>software de análise de enriquecimento funcional usado para a etapa 4.5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq e Buffer (PCR de genotipagem)</td><td>Thermo/Fisher</td><td>EP0701 e K1072</td><td></td></tr><tr><td>anticorpos erbB4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-284</td><td></td></tr><tr><td>erbB4 anticorpos</td><td>Abcam</td><td>ab35374</td><td></td></tr><tr><td>erbB4 anticorpos</td><td>Millipore</td><td>HFR1: 05-1133</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GenomeSpace Ferramentas e fontes de dados</td><td>GenomeSpace</td><td>https://genomespace.org/support/tools/</td> <td>recurso geral para vários tipos de ferramentas de bioinformática de código aberto para a etapa 4.5</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005- </td><td></td>Cl</tr><tr><td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td><td>Gorilla</td><td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td><td>software de análise de enriquecimento funcional usado para a etapa 4.5</td></tr><tr><td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td><td>Broad Institute</td><td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td><td>software de análise de enriquecimento funcional usado para a etapa 4.5</td></tr><tr><td>HSD: Camundongos Athymic Nude-FOxn1nu</td><td>Envigo (anteriormente Harlan Labs)</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 (sequenciador de DNA de próxima geração)</td><td>Sequenciador de DNA Illumina</td><td>Hi Seq 2500</td><td>usado para a etapa 4.2</td></tr><tr><td>Lasergene: ArrayStar Análise de expressão e variante</td><td>do gene DNAStar LaserGene software</td><td>N/A</td><td>análise estatística e de normalização usada para a etapa 4.4</td></tr><tr><td>Lasergene: SeqMan NGen montagem</td> <td>de alinhamento de sequênciaalinhamento de software usado para a etapa 4.3</td> Alinhamento de software N<td>/A</td><td>usado para a etapa 4.3</td></tr><tr><td>Matrigel, matriz de membrana basal de baixo fator de crescimento</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NRG1-beta</td><td></td><td>Internamente Gerado pela SLC, também disponível comercialmente na R & D Systems(396-HB-050/CF).</td><td></td></tr><tr><td>Coloração Nuclear Hoeschst 33342</td><td>Thermo</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Classificação de Ontologia de Genes Panther</td><td>http://pantherdb.org</td><td></td><td>software de análise de enriquecimento funcional usado para a etapa 4.5</td></tr><tr><td>Partek (alinhador e analisador BWA)</td> <td>Partek, Ver 7</td><td>Alinhamento e estatística/normalização do software N/A usado para a etapa 4.3</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1:5&prime;-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 2: 250&thinsp; bp ErbB4 produto nulo e um 350&thinsp; bp Floxed ErbB4 produto;</td><td></td></tr><tr><td>Primer 2: 5&prime;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 2: 250&thinsp; bp ErbB4 produto nulo e um 350&thinsp; bp Floxed ErbB4 produto;</td><td></td></tr><tr><td> Primer 3: 5&prime;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3&prime; </td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 3: 350&thinsp; bp produto ErbB4 do tipo selvagem.</td><td></td></tr><tr><td>Propídio Iodo</td><td>Fisher</td><td>51-351-0</td><td></td></tr><tr><td>Proteom Profiler Matrizes de Fosfo-Quinase</td><td>R& D Systems</td><td>ARY003B</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de viabilidade celular bioluminescente</td><td>glo</td><td>Promega</td><td>G9712</td> em tempo real</tr><tr><td>ToppGene Suite ToppGene</td><td></td><td>https://toppgene.cchmc.org</td><td>software de análise de enriquecimento funcional usado para a etapa 4.5</td></tr><tr><td>Trizol (reagente à base de ácido-quanidinium-fenol e clorofórmio)</td><td></td>Kit de amplificação de sinal de tiramida <td>de 15596026</td><td></td>Invitrogen</tr><tr><td></td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL721001EA</td><td></td></tr></tbody></table>

definindo funções genéticas em tumorigênese por ex vivo ablaation of floxed alleles in maligna periférico nerve hemato tumor cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

O desenvolvimento de novas drogas que visam precisamente proteínas-chave em cânceres humanos está alterando fundamentalmente a terapêutica do câncer. No entanto, antes que essas drogas possam ser usadas, suas proteínas-alvo devem ser validadas como alvos terapêuticos em tipos específicos de câncer. Essa validação é frequentemente realizada derrubando o gene que codifica o alvo terapêutico candidato em um modelo de câncer de camundongo geneticamente modificado (GEM) e determinando que efeito isso tem no crescimento do tumor. Infelizmente, questões técnicas como a letalidade embrionária em nocautes convencionais e o mosaico em nocautes condicionalmente muitas vezes limitam essa abordagem. Para superar essas limitações, desenvolveu-se uma abordagem para ablação de um gene letal embrionário floxed de interesse em culturas de curto prazo de tumores malignos de bainha periférica (MPNSTs) gerados em um modelo GEM.
Este artigo descreve como estabelecer um modelo de camundongo com o genótipo apropriado, derivar culturas tumorais de curto prazo desses animais e, em seguida, ablate o gene letal embrionário floxed usando um vetor adenoviral que expressa Cre recombinase e proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP). Purificação de células transduzidas com adenovírus usando classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e a quantificação dos efeitos que a ablação genética exerce sobre a proliferação celular, viabilidade, o crescimento de andoenxertos transcritos e ortotópicos é então detalhado. Essas metodologias fornecem uma abordagem eficaz e generalizável para identificar e validar alvos terapêuticos in vitro e in vivo. Essas abordagens também fornecem uma fonte renovável de células derivadas de tumores de baixa passagem com artefatos de crescimento in vitro reduzidos. Isso permite que o papel biológico do gene-alvo seja estudado em diversos processos biológicos, como migração, invasão, metástase e comunicação intercelular mediada pelo secretome.

A Figura 4 ilustra um resultado típico obtido ao transdutor P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Células MPNST erbb4fl/fl com o adenovírus Ad5CMV-eGFP ou adenovírus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). As culturas são vistas com microscopia de fluorescência para identificar células expressas pelo eGFP e por microscopia de contraste de fase para determinar o número total de células presentes no mesmo campo em 10x (superior) e 40x (infer...

Aqui, apresentamos um protocolo para a realização de nocautes genéticos que são embrionários letais in vivo em tumores derivados de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, avaliando o efeito que o nocaute tem sobre o crescimento do tumor, proliferação, sobrevivência, migração, invasão e a transcrição in vitro e in vivo.

Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Este protocolo fornece um método in vivo alternativo para estudar o papel de crescimento tumoral de um gene letal embrionário nocaute. A vantagem deste método é que os nocautes genéticos que normalmente são letais embrionários podem ser realizados em tumores derivados de um modelo de camundongo geneticamente modificado para estudar sua perda de efeitos de função in vivo. Essa técnica pode ser aplicada a doenças que requerem o estudo do papel in vivo de genes essenciais embrionários inatingíveis dos modelos tradicionais de camundongos genes knockout.A geração do modelo animal leva tempo e testes empíricos são necessários para determinar o MOI ideal para infecção adenoviral para garantir que a recombinação apropriada seja alcançada. Para começar, identifique o mouse com o genótipo desejado. Quando um rato portador de tumor atinge seu ponto final humano, eutanize o rato e use uma faca de bisturi estéril para remover o tumor.Disseque o tumor em três seções em cortes no estilo pão de pão usando uma faca de bisturi para gerar os segmentos de tecido para a parafina de fixação formalina incorporando a geração de cultura de passagem precoce e o congelamento de flash para análises analíticas

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método para enxertia confiável luciferase marcadas humana maligna dos nervos periféricos células tumorais em bainha do nervo ciático de ratos imunodeficientes é descrito. A utilização de imagem de bioluminescência para demonstrar estabelecimento adequado de enxertos tumor e critérios para a segregação aleatória dos animais em grupos de estudo são também discutidos.

Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

A análise do clone de mosaico no epitélio do disco imaginal de Drosophila é um sistema modelo poderoso para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Aqui descrevemos um protocolo para induzir tumores em discos imaginários da asa de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e introduzir um método de diagnóstico para classificar os fenótipos do tumor.

Indução e diagnóstico de tumores em<em&gt; Drosophila</em&gt; Epitelio do disco imaginal

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Desenvolvemos uma metodologia para avaliar se neoplasias do sistema nervoso em camundongos geneticamente modificados recapitulam com precisão a patologia de suas contrapartes humanas. Aqui, aplicamos essas técnicas histológicas, critérios patológicos definidos e metodologias de cultura para neurofibromas e tumores malignos da bainha de nervos periféricos que surgem no modelo de camundongos P 0-GGFβ3.

Identificação, diagnóstico e classificação de tumores malignos da bainha do nervo periférico em modelos de camundongos geneticamente modificados

A neurofibromatose tipo 1 (NF1) leva a tumores benignos da bainha do nervo periférico (neurofibromas) que requerem um microambiente nervoso específico para o crescimento. Um modelo de xenoenxerto ortotópico otimizado foi desenvolvido, usando injeção intraneural de células humanas de Schwann em camundongos NSG. Este modelo recapitula neurofibromas humanos e fornece uma plataforma valiosa para avaliar estratégias terapêuticas.

Um Xenoenxerto Ortotópico do Nervo Ciático para Neurofibromatose Tipo 1

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

Baixo-campo (L-band, 1.2 GHz) ressonância paramagnética electrónica utilizando sondas de nitroxyl e trityl solúveis é demonstrada para avaliação dos parâmetros fisiologicamente importantes no microambiente do tumor em modelos do rato do cancro da mama.

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Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

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Aprenda a estudar genes letais embrionários em tumores de nervo periférico maligno usando modelos de camundongo geneticamente modificados. Este método permite analisar efeitos de perda de função in vivo em oncologia e neurociência.

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Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

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