Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para a realização de nocautes genéticos que são embrionários letais in vivo em tumores derivados de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, avaliando o efeito que o nocaute tem sobre o crescimento do tumor, proliferação, sobrevivência, migração, invasão e a transcrição in vitro e in vivo.

Este protocolo fornece um método in vivo alternativo para estudar o papel de crescimento tumoral de um gene letal embrionário nocaute. A vantagem deste método é que os nocautes genéticos que normalmente são letais embrionários podem ser realizados em tumores derivados de um modelo de camundongo geneticamente modificado para estudar sua perda de efeitos de função in vivo. Essa técnica pode ser aplicada a doenças que requerem o estudo do papel in vivo de genes essenciais embrionários inatingíveis dos modelos tradicionais de camundongos genes knockout.

A geração do modelo animal leva tempo e testes empíricos são necessários para determinar o MOI ideal para infecção adenoviral para garantir que a recombinação apropriada seja alcançada. Para começar, identifique o mouse com o genótipo desejado. Quando um rato portador de tumor atinge seu ponto final humano, eutanize o rato e use uma faca de bisturi estéril para remover o tumor.

Disseque o tumor em três seções em cortes no estilo pão de pão usando uma faca de bisturi para gerar os segmentos de tecido para a parafina de fixação formalina incorporando a geração de cultura de passagem precoce e o congelamento de flash para análises analíticas. Colora uma seção de tecido com hematoxilina e eosina de cinco micímetros de espessura com hematoxilina e eosina. Uma vez que um patologista confirme o tumor, realize a coloração imunohistoquímica para confirmar o diagnóstico do tumor.

Coloque o tecido tumoral de bainha de nervo periférico recém-coletado em 10 mililitros de PBS estéreis gelados no gelo, e depois transfira-o para uma área de trabalho estéril para estabelecer culturas de passagem precoce. Pique o tecido tumoral em pedaços de dois a quatro milímetros e triturar de oito a dez vezes em um prato de cultura de tecido tratado de 10 centímetros quadrados contendo 10 mililitros de meio de crescimento. Cultura esses tecidos em alta glicose DMEM-10 meio de crescimento complementado com 10 nanomolar neuregulin-1 beta e dois micromolar forskolin.

Semear as células tumorais de passagem precoce a uma densidade de 1,5 vezes 10 para a sexta células por um prato de cultura tecidual tratado de 10 milímetros contendo meio de crescimento DMEM-10. Após 12 a 16 horas, lave as culturas aderentes com dois a quatro mililitros de DPBS, e infecte as células com adenovírus em aproximadamente 400 unidades formadoras de placas por célula em 10 mililitros de DMEM sem soro. Após 48 horas da infecção, verifique brevemente as células para sinal EGFP em um microscópio de fluorescência para garantir uma infecção eficiente com aproximadamente 50 a 100% de células positivas, e então FACS classificar as células infectadas EGFP positivos.

Após a triagem facs, deixe as células se recuperarem em uma incubadora de cultura tecidual por pelo menos 24 a 48 horas, e depois preparar as células para análises in vitro baseadas em células ou enxerto in vivo. Confirme a exclusão de Erbb4 realizando PCR usando DNA genômico isolado de uma porção das células EGFP-positive classificadas. Realize os ensaios de proliferação ao longo dos próximos sete dias em células tumorais classificadas banhadas em uma placa de 96 poços usando um citômetro automatizado baseado em imagem.

Colora as células com ganchos e corantes de iodeto de propídio e capture as imagens das células usando um leitor de placas automatizado para contar o número de células vivas e mortas em cada poço. Isole o RNA total das células tumorais classificadas usando o método padrão defenol de guanidinium ácido e clorofórmio. Abra o software para executar o alinhamento de sequência de RNA seguindo as etapas específicas do programa usando as configurações padrão.

Selecione o método de análise, procure RNA e selecione o genoma de referência do mouse. Carregue o arquivo BED se fornecido um pelo núcleo de sequenciamento. Carregue os arquivos de sequenciamento FASTQ e atribua nomes de replicação exclusivos aos arquivos.

Grupo replique os arquivos FASTQ e designe os arquivos para um conjunto de réplica. Para a análise estatística e normalização identificar os sinais diferenciais de expressão genética com poder estatístico robusto, abra o software de análise e selecione os arquivos GFP FASTQ como o conjunto de dados de controle. Em seguida, selecione o DESeq2 como o método estatístico e de normalização e inicie a montagem e análise.

Use os conjuntos de dados de ontologia genética integrados às ferramentas de análise de enriquecimento funcional de acesso aberto para realizar a análise de enriquecimento funcional no DEG mediado estatisticamente significativo erbb4 para determinar o significado biológico e de caminho da perda genética de Erbb4. Injete as células tumorais no nervo ciático do camundongo anestesiado para avaliar o potencial de crescimento de aoenxerto in vivo em células pós-infectadas. Uma vez que o tumor atinja o tamanho necessário, disseca o tumor de um rato eutanizado em duas ou três seções, como demonstrado anteriormente.

Fixar uma seção de tecido em 4% Paraformaldeído durante a noite, e, em seguida, incorporar a seção fixa na parafina. Depois de fazer seções de cinco micrômetros de espessura do tecido FFPE, monte a seção sobre as lâminas e confirme a presença de células tumorais no tecido enxertado usando H&E e imunostaining como demonstrado anteriormente. Para confirmar in vivo Erbb4 diferenças de expressão entre as duas condições experimentais, colorique o tecido fixo de formalina, embutido em parafina com anticorpos específicos de Erbb4.

Foi analisada a transdução das células do tecido tumoral periférico maligno com adenovírus. As células expressas do EGFP foram detectadas por meio de microscopia de fluorescência, e o número total de células foi determinado por meio de microscopia de contraste de fase. Após a ablação genética mediada por Cre, dependendo da eficiência da transfecção, a genotipagem pcr mostrou um nocaute genético completo e uma população heterogênea de células induzidas e não induzidas em comparação com a transdução de controle.

A histopatologia característica encontrada nos aloenxertos ortotópicos de tecidos tumorais malignos da bainha do nervo periférico em comparação com os tumores derivados dos modelos animais geneticamente modificados originais demonstrou uma diferença na morfologia celular. A ablação de Erbb4 diminuiu a densidade celular e a proliferação celular em células adeno5-CMV-Cre-ablated controlam células transduzidas adeno5-CMV-GFP. A expressão de Erbb4 nas células tumorais transduzidas com o vírus adeno5-CMV-Cre, ou vírus EGFP, foi diminuída no resultado em adeno5-CMV-Cre transduziram aloenxertos em comparação com os tumores adeno5-CMV-EGFP tratados alox.

A densidade vascular foi avaliada por meio da detecção de imunoreatividade para CD31, e os resultados representativos mostraram uma densidade vascular significativamente reduzida em aloenxertos de células transduzidas adeno5-CMV-Cre em comparação com as células transduzidas adeno5-CMV-EGFP. Após a ablação genética, as células podem ser usadas para muitos tipos diferentes de ensaios baseados em células, como proliferação, migração, crescimento 3D ou alterações de microambiente, bem como para injeções ortotópicas in vivo.