Name: Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda métodos de baixo custo para medir expectativa de vida e saúde em Caenorhabditis elegans. Esta técnica utiliza sincronização por cloração e análise de movimentação para estudar envelhecimento.

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A G.G. é apoiada pela T32AG052374 e a R.H.S. é apoiada pelo R00AG065200 do Instituto Nacional de Envelhecimento. Agradecemos ao CGC (financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) pelas cepas.

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

A vida útil, mais simplesmente definida como a duração da vida, é um fenômeno binário claro na maioria dos organismos - ou um organismo está vivendo ou não. No entanto, a longevidade nem sempre se correlaciona com a saúde de um organismo. Por exemplo, modelos de hormose mitocondrial onde a exposição ao estresse mitocondrial aumenta drasticamente a vida útil são geralmente alguns dos animais mais longevos, mas apresentam crescimento atrofiado e diminuição da função metabólica37,54. Da mesma forma, animais com respostas hiperativas de estresse reticulum endoplasmático também apresentam certos comportamentos e fenótipos que podem ser correlacionados com a diminuição da saúde, apesar de terem melhorado drasticamente a homeostase proteica e a vidaútil 36,49. Finalmente, muitos paradigmas de longevidade em organismos modelo, incluindo aumento da função HSF-155, aumento da função XBP-156, e sinalização foxo alterada57 estão todos correlacionados com o aumento do risco de câncer, e é indiscutível que a vida útil prolongada não é benéfica se um organismo está em uma luta constante contra o câncer e outras doenças de saúde. Portanto, a longevidade não pode ser uma medida autônoma na biologia do envelhecimento.
Assim, o conceito de saúde tem sido um campo crescente na biologia do envelhecimento. A vida saudável, vagamente definida como o período de vida que se é saudável, é mais difícil de determinar do que a longevidade. No entanto, ao contrário da longevidade, o conceito de "saúde" é complicado, pois há muitas leituras diferentes para a saúde do organismo: no nível do organismo, há função/força muscular, função neuronal/cognitiva, saúde reprodutiva, etc.; no nível celular há homeostase proteica, homeostase lipídica, homeostase de glicose, metabolismo, etc. Em 2014, biólogos envelhecidos caracterizaram definitivamente marcas biológicas do envelhecimento com a definição estruturada de que deve ser algo que naturalmente se quebra durante o envelhecimento e pode ser alterado experimentalmente de tal forma que a exacerbação experimental deve acelerar o envelhecimento e a intervenção experimental deve retardar o envelhecimento. Essas nove marcas do envelhecimento incluem instabilidade genômica, atrito de telômeros, alterações epigenéticas, perda de homeostase proteica (proteostase), exaustão de células-tronco, sinalização intercelular alterada, disfunção mitocondrial, sensoriamento de nutrientes desregulamentado e senescência celular58. Desde então, inúmeros estudos argumentam que outros fatores devem ser incluídos, incluindo proteínas extracelulares e fisiologia sistêmica, como imunidade e inflamação59. Em última análise, a definição complexa de healthspan determina que a saúde do organismo seja medida usando múltiplos métodos diferentes.
Portanto, neste manuscrito, são apresentados múltiplos métodos para medir vários aspectos da saúde utilizando o modelo nematode, C. elegans. Nós dizemos comportamento locomotório usando ensaios de espancamento, saúde reprodutiva usando contagem de ovos e tamanho de ninhada, e sensibilidade ao estresse. De fato, o comportamento locomotório é um método padrão-ouro para medir a saúde, pois os organismos apresentam perda significativa de motilidade e movimento durante o envelhecimento51. A perda de comportamento locomotório pode ser atribuída a múltiplas marcas do envelhecimento, já que a função muscular em C. elegans depende da proteostaseadequada 60, disfunção mitocondrial61 e sinalização neurônio-muscular62. Embora este manuscrito se concentre em uma medição do comportamento locomotório, é importante notar que existem muitos outros métodos, incluindo motilidade de animais em uma placa de ágar sólido, resposta ao toque51 e ensaios de quimiotaxis63. No entanto, esses métodos geralmente requerem dispositivos de gravação mais sofisticados, uso de software de rastreamento de worms ou uso de produtos químicos caros, perigosos ou voláteis, todos os quais podem ser proibitivos em algumas configurações de pesquisa.
Além disso, ensaios para contagem de óvulos e tamanho de ninhadas são apresentados como um método de medição da saúde reprodutiva e como o método mais simples para medir a divisão celular em vermes adultos, uma vez que os vermes adultos são pós-místicos e apenas células germinativas e embriões sofrem divisão celular dentro de um verme adulto64. Como medida de divisão celular, a saúde reprodutiva pode ser relevante para as marcas de envelhecimento da senescência celular e exaustão das células-tronco. A saúde reprodutiva pode ser afetada por muitos fatores, incluindo infecção patogênica65 ou exposição ao estresse49, embora não haja correlação direta entre saúde reprodutiva e longevidade. Na verdade, alguns animais de longa duração apresentam uma diminuição significativa no tamanho da ninhada49, e é até possível que exista uma correlação inversa entre longevidade e tamanho de ninhada50. Este não é um fenômeno específico para C. elegans, pois efeitos prejudiciais da reprodução sobre a longevidade têm sido observados há muito tempo em humanos66, cãescompanheiros 67 e camundongos68. Ainda assim, fornecemos a contagem de óvulos e o tamanho da ninhada como um método confiável e de baixo custo para medir a saúde reprodutiva com a ressalva de que a saúde reprodutiva pode não se correlacionar com a longevidade ou a vida saudável.
Finalmente, os ensaios de sobrevivência são oferecidos como medida indireta da saúde do organismo. É importante ressaltar que as respostas ao estresse celular69 e o estresseer 35 diminuem rapidamente durante o processo de envelhecimento e têm relevância direta para a marca de envelhecimento da proteostase70,71. Em contraste, as respostas de estresse hiperativantes podem aumentar significativamente a vida útil, promovendo a resiliência ao estresse 35,37,38. Embora este estudo se concentre nos métodos de custo mais simples e mais baixos, existem um grande número de métodos alternativos para ensaios de resiliência ao estresse para termotolerância41 e estresse oxidativo66, cada um exigindo um conjunto diferente de equipamentos e consumíveis. Além de estudos simples de exposição a estressores, outros métodos fisiológicos podem ser realizados dependendo do acesso aos equipamentos. Por exemplo, um analisador de fluxo extracelular pode monitorar a função mitocondrial e a respiração celular73; Microscópios de dissecção fluorescente permitirão medições de repórteres transcricionais para ativação de resposta ao estresse20; e microscópios compostos ou confocal de alta resolução podem ser usados para medir a morfologia organela com sondas fluorescentes para mitocôndrias74, o regômulo endoplasmático75,76 e o citoesqueleto de actina77.
Como um conto de advertência final para medidas de longevidade, enquanto métodos químicos e genéticos para esterilizar vermes são oferecidos para diminuir significativamente o custo, é importante notar que ambos podem impactar diretamente a vida útil. Por exemplo, a exposição ao FUDR foi relatada anteriormente para impactar tanto a vida útil quanto a termotolerância45. E enquanto o mutante glp-4(bn2) em si não tem nenhum efeito direto sobre a vida útil, o crescimento a 25 °C é um leve estresse térmico33,34 e, portanto, pode impactar a vidaútil 2. Existem outros métodos para esterilizar C. elegans, incluindo a esterilidade mediada pela auxina78 ou mutantes deficientes de temperatura79. No entanto, todos os métodos possuem algumas ressalvas, e deve-se tomar cuidado para utilizar o ensaio menos prejudicial para as necessidades científicas de cada laboratório. Uma limitação final dos estudos de longevidade é a variabilidade potencial que pode ocorrer devido a baixos tamanhos amostrais ou simplesmente por um erro objetivo do pesquisador. Isso pode ser contornado à medida que novas tecnologias nascem em tecnologias automatizadas de vidaútil 80, mas novamente esses sistemas são caros e exigem alguns equipamentos e habilidades de engenharia e computação. Em última análise, a coleção de métodos aqui fornecidos é um conjunto confiável de ferramentas que podem ser rapidamente adaptadas e aprendidas em quase qualquer instituição e fornecer uma base sólida para a biologia do envelhecimento.

Desde a época da publicação de "A genética de Caenorhabditis elegans", um dos artigos mais influentes de Sydney Brenner em 1974, este verme microscópico tem sido considerado um excelente sistema modelo para estudar mistérios biológicos1. Em 1977, Michael R. Klass publicou o método para medir a vida útil de C. elegans e estabeleceu este sistema modelo para estudar o envelhecimento2. A investigação para entender a relação entre estresse e longevidade começou com a identificação de uma única mutação no gene da idade-1, o que resultou em uma extensão de vida útil em C. elegans3. Além disso, estudos contemporâneos identificaram outras mutações que aumentam a vida útil, que revelaram vermes mutantes de longa duração que exibem maior resistência ao estresse 4,5,6. Com suas muitas vantagens, incluindo uma vida útil curta, fácil manutenção, genoma completamente sequenciado contendo homologia a cerca de dois terços de todos os genes causadores de doenças humanas, disponibilidade e facilidade de usar bibliotecas de interferência de RNA (RNAi) e semelhança fisiológica com humanos 7,8,9, C. elegans foi rapidamente adotado como um modelo excepcional para o estresse e a biologia do envelhecimento.
Talvez as maiores utilidades de C. elegans sejam seu custo extremamente baixo de manutenção, facilidade de experimentação e a variedade de ferramentas genéticas disponíveis para estudos. C. elegans são tipicamente cultivados em um meio de ágar sólido com uma fonte de alimento E. coli. Duas cepas de E. coli comumente usadas são op50 padrão, uma cepa B que é talvez a10 mais usada, e HT115, uma cepa K-12 que é usada principalmente para experimentos RNAi11,12. A cepa HT115 K-12 carrega uma exclusão em RNAIII RNase, uma mutação que é essencial para os métodos RNAi, onde plasmídeos expressando dsRNA correspondentes aos genes C. elegans individuais são usados. Os vetores de alimentação dsRNA permitem um knockdown robusto de genes C. elegans sem a necessidade de cruzes complexas ou edição de genomas, pois as bactérias que carregam esses plasmídeos podem ser alimentadas diretamente com nematoides. Milhares desses vetores rnai bacterianos existem no fundo HT115, incluindo a biblioteca Vidal RNAi mais popular com >19.000 construções rnai individuais13 e a biblioteca Ahringer RNAi com 16.757 RNAi construtos14. No entanto, as dietas bacterianas OP50 e HT115 têm grandes diferenças no perfil metabólico, incluindo diferenças na Vitamina B1215,16. Portanto, recomenda-se realizar todos os experimentos em uma única fonte de bactérias, se possível, para evitar interações gene-diet que possam introduzir múltiplos fatores de confusão como descrito anteriormente 17,18,19. Devido à sua facilidade, os animais são mantidos em OP50 para todas as condições experimentais descritas aqui, mas todos os experimentos são realizados em HT115 como descrito anteriormente20. Resumidamente, os animais são mantidos em OP50 e transferidos para ht115 pós-sincronização (após branqueamento) para consistência entre experimentos RNAi vs. não-RNAi. Alternativamente, uma cepa OP50 competente rnai carregando uma exclusão semelhante de RNAIII RNase encontrada na cepa E. coli K12 HT115 também pode ser usada21.
Talvez uma grande limitação aos experimentos rnai em C. elegans é a preocupação da eficiência de knockdown. Embora a eficiência do knockdown possa ser validada via qPCR ou mancha ocidental, estes exigem equipamentos e reagentes caros e são limitados à análise em massa. Isso é ainda mais preocupante olhar para células específicas, como neurônios, que são refratários (menos sensíveis) ao RNAi. Embora a eficiência rnAi em células específicas possa ser aprimorada através da superexpressão do SID-1, a proteína transmembrana essencial para a absorção de dsRNA22, isso ainda está limitado aos padrões de expressão específicos do tipo celular dos promotores usados para essas construções, e, portanto, nocautes genéticos e mutações são os meios mais infalíveis de esgotar as funções genéticas. Além do knockdown mediado pela RNAi, os elegans C. também são altamente favoráveis à edição de genomas com estratégias baseadas em CRISPR 23,24,25 e sobreexpressão transgênica através de microinjeções, com a opção de integrar construções transgênicas por meio de irradiação ou integração baseada em transposon 26,27,28,29 . No entanto, esses métodos exigem equipamentos de microinjeção caros, e o alto custo da enzima guia RNAs ou Cas9 pode proibir esses métodos em instituições com financiamento limitado. Em vez disso, milhares de linhas transgênicas e mutantes estão prontamente disponíveis por alguns dólares, tanto no Centro genético de Caenorhabditis (CGC) quanto no National Bioresource Project (NBRP). O NBRP oferece mutantes isolados para um grande número de genes C. elegans, incluindo cepas mutantes publicadas e, portanto, verificadas, mutantes derivados de projetos piloto, e mutantes que ainda não foram caracterizados. Em contraste, o CGC é um depositário de linhas C. elegans publicadas e estabelecidas da comunidade de pesquisa. Ambos enviam cepas em todo o mundo a taxas muito razoáveis e oferecem uma grande variedade de opções para aqueles com capacidade limitada para sintetizar cepas internamente.
Aqui, é oferecida uma coleção de métodos curados, que provavelmente serão os métodos de menor custo para avaliar a vida útil e a vida útil em C. elegans. Todos os métodos aqui apresentados exigem equipamentos e suprimentos de baixo custo, e utilizam apenas cepas prontamente disponíveis do CGC. Talvez o mais proibitivo para ensaios de longevidade e sobrevivência em C. elegans é o custo das placas de Nematode Growth Media (NGM). Uma vez que C. elegans são hermafroditas e auto-fertilizar, ensaios padrão de sobrevivência exigem que animais adultos sejam continuamente afastados de sua descendência para evitar a contaminação da prole. Não só esse processo é demorado, como pode se tornar caro devido à necessidade de aproximadamente 100 placas por condição para executar um único ensaio de vida útil. Aqui, duas alternativas são fornecidas: utilização do mutante sem germinal sensível à temperatura, glp-4(bn2), ou esterilização química usando 5-fluoro-2'-desoxyuridina (FUDR). glp-4 codifica uma sitetase de rna de aminoacyl valyl, e o glp-4(bn2) sensível à temperatura são reprodutivamente deficientes a temperaturas restritivas devido à diminuição da tradução deproteínas 30,31. FUDR é um método robusto para esterilizar quimicamente C. elegans, impedindo a replicação do DNA, inibindo assim a reprodução32. Embora o FUDR possa ser proibitivamente caro para alguns laboratórios, apenas uma pequena quantidade é necessária para esterilizar quimicamente vermes, e sua estabilidade na forma de pó pode torná-lo viável para a maioria dos grupos. Utilizar o mutante glp-4(bn2) sensível à temperatura é certamente a opção mais barata, pois o único requisito é uma incubadora para deslocar os animais para os restritivos 25 °C; no entanto, deve-se notar que o crescimento a 25 °C pode causar leve estresse térmico33,34. Independentemente do método, o uso de animais estéreis pode diminuir significativamente os custos de consumíveis necessários para ensaios relacionados à idade.
Para estudar o envelhecimento, os ensaios padrão da vida útil são convencionais, pois paradigmas que alteram a longevidade têm impactos diretos no envelhecimento. No entanto, as medidas de saúde e tolerância ao estresse apresentam informações adicionais sobre a saúde do organismo. Aqui, são oferecidos diversos métodos para medir a saúde: 1) fecundidade como medida de saúde reprodutiva; 2) tamanho da ninhada como medida de saúde do desenvolvimento e viabilidade de descendentes colocados; e 3) comportamento locomotório como medida de função muscular e motilidade, ambos diretamente correlacionados com o envelhecimento. Além disso, são oferecidos ensaios de tolerância ao estresse: sobrevivência ao estresse er, estresse mitocondrial/oxidativo e sobrevivência do estresse térmico. De fato, animais com maior resistência ao estresseer 35,36, estresse mitocondrial37 e estresse térmico38 apresentam aumento da vida útil. O estresse do ER é aplicado expondo C. elegans à tunicamicina, que bloqueia a glicosição ligada a N e causa o acúmulo de proteínas desdobradas39. O estresse mitocondrial/oxidativo é induzido pela exposição ao paraquat, que induz a formação de superóxido especificamente nas mitocôndrias40. O estresse térmico é aplicado através da incubação de animais a 34-37 °C33,41. Todos os ensaios descritos aqui podem ser realizados com equipamentos e fundos mínimos, e oferecem uma variedade de ferramentas para estudar o envelhecimento em diversos grupos.

<table><tbody><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>para RNAi</td></tr><tr><td>Bacto</td><td>Agar VWR</td><td>90000-764</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>para RNAi</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>solvente para medicamentos</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>para LB</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>para placas NGM,</td></tr><tr><td>M9 Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>para estresse oxidativo/mitocondrial</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>para solução de lixívia</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>para M9</td></tr><tr><td>S7E Escopo de dissecação</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Microscópio de dissecação padrão</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>para placas NGM,</td></tr><tr><td>M9 Hipoclorito de sódio</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>para solução de alvejante</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>para</td></tr><tr><td>cloridrato de tetraciclina</td> M9 <td>VWR</td><td>97061-638</td><td>para RNAi</td></tr><tr><td>Tunicamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>para estresse ER</td></tr></tbody></table>

pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

A descoberta e desenvolvimento de Caenorhabditis elegans como organismo modelo foi influente na biologia, particularmente no campo do envelhecimento. Muitos estudos históricos e contemporâneos identificaram milhares de paradigmas que alteram a vida útil, incluindo mutações genéticas, expressão genética transgênica e hormesis, uma exposição benéfica e de baixo grau ao estresse. Com suas muitas vantagens, incluindo uma vida útil curta, manutenção fácil e de baixo custo, e genoma totalmente sequenciado com homologia a quase dois terços de todos os genes humanos, C. elegans foi rapidamente adotado como um modelo excepcional para o estresse e a biologia do envelhecimento. Aqui, vários métodos padronizados são pesquisados para medir a vida útil e a vida saudável que podem ser facilmente adaptados em quase qualquer ambiente de pesquisa, especialmente aqueles com equipamentos e fundos limitados. Destaca-se a incrível utilidade de C. elegans , destacando a capacidade de realizar análises genéticas poderosas na biologia do envelhecimento sem a necessidade de uma ampla infraestrutura. Por fim, são discutidas as limitações de cada análise e abordagens alternativas.

C. elegans são um excelente organismo modelo para pesquisas de envelhecimento devido a uma grande maioria dos mecanismos de envelhecimento sendo conservados com humanos. É importante ressaltar que eles têm um custo muito baixo em manutenção e experimentação com requisitos mínimos para equipamentos e consumíveis, tornando-os um cobiçado sistema de modelo para instituições com fundos limitados. Além disso, uma infinidade de ensaios simples com curvas de aprendizagem rasas faz deles um excelente sistema até mesmo para o investigador mais jovem com pouca ou nenhuma experiência. Todos esses fatores combinados com a poderosa genética de C. elegans , incluindo a facilidade de edição de genomas, milhares de mutantes disponíveis e animais transgênicos a custos nominais, e bibliotecas RNAi disponíveis para knockdown genético de praticamente todos os genes fazem deles um sistema ideal para instituições de graduação. Aqui, alguns dos métodos de menor custo para estudar o envelhecimento em C. elegans são pesquisados, focando principalmente em ensaios com equipamentos mínimos e custo consumível, bem como curvas de aprendizagem rasas. De fato, a totalidade dos protocolos e coleta de dados foi escrita/realizada por pesquisadores juniores com &lt;5 meses de experiência em pesquisa, em sua maioria estudantes de graduação.
Estudos de longevidade em C. elegans são muito simples devido à curta vida útil dos animais, variando de 14 a 20 dias. É importante ressaltar que os ensaios de vida são altamente padronizados e exigem apenas uma incubadora, um microscópio de dissecção padrão, uma picareta de verme padrão e consumíveis para a preparação de placas de NGM-ágar. Talvez o aspecto mais proibitivo de custos das medições de vida útil em C. elegans seja necessário consumíveis. Isso porque C. elegans são hermafroditas que se auto-fertilizam; portanto, os adultos que estão sendo rastreados para ensaios de longevidade precisam ser afastados da progênera diariamente. No entanto, os animais podem ser esterilizados expondo-os ao FUDR ou usando mutantes, como o mutante sem germinas sem temperatura glp-4(bn2) cultivado a 25 °C proibitivo para reduzir a quantidade de consumíveis necessários 30,31,32. Aqui, os ensaios de vida foram realizados com FUDR ou com os mutantes sem germina glp-4(bn2), que mostram resultados semelhantes às expectativas de vida padrão realizadas em animais não estéreis. Embora a vida útil do tipo selvagem não seja idêntica devido aos efeitos do FUDR45 ou ao crescimento a 25 °C na vidaútil 2, o animal de knockdown de curta duração hsf-1 mostra uma diminuição significativa na vida útil para todas as condições (Figura 1). hsf-1 codifica o fator de transcrição fator de choque térmico-1, que está envolvido na regulação da resposta ao estresse térmico, e seu knockdown resulta em uma diminuição significativa na vidaútil 38,46.
Embora a longevidade seja um fator importante a ser considerado na biologia do envelhecimento, muitas vezes, a longevidade não se correlaciona com o aumento da saúde, mesmo em C. elegans47. Assim, como abordagem complementar, oferecemos diversos métodos de medição da saúde do organismo, incluindo saúde reprodutiva, comportamento locomotório e resiliência ao estresse. A saúde reprodutiva pode ser medida de duas maneiras. Em primeiro lugar, as medidas da contagem de óvulos darão uma medição direta de quantos ovos são colocados por uma única hermafrodita auto-fertilizadora. No entanto, como os animais produzem mais oócitos do que espermatozoides, alguns óvulos não fertilizados que nunca produziriam prole viáveis também são colocados48. Portanto, para entender melhor a verdadeira capacidade reprodutiva de um animal, as medidas do tamanho da ninhada fornecem uma medida de quantos descendentes viáveis são produzidos. Muitas vezes, o aumento da resiliência ao estresse pode realmente diminuir a capacidade reprodutiva, potencialmente devido ao efeito inerente do estresse percebido na reprodução49. Da mesma forma, uma diminuição significativa no número de ovos colocados e no tamanho da ninhada é encontrada em animais de superexpressão hsf-1 em comparação com controles do tipo selvagem (Figura 2A,B). De fato, alguns animais de superexpressão hsf-1 apresentam total esterilidade, fornecendo evidências de que a saúde reprodutiva pode ser inversamente correlacionada com a longevidade.
Embora a saúde reprodutiva seja importante para a compreensão da saúde germinal, da meiose funcional e da capacidade reprodutiva, em geral, não há correlação direta entre longevidade e tamanho de ninhada50. Assim, como abordagem complementar, o comportamento locomotório é oferecido como um método padrão-ouro para avaliar a saúde de C. elegans durante o envelhecimento51. Existem muitos métodos para medir o comportamento locomotório, mas a maioria dos métodos requer câmeras sofisticadas, software de rastreamento ou produtos químicos caros. Em contraste, os ensaios de thrashing não exigem praticamente nenhum equipamento além do que um laboratório padrão C. elegans está equipado com: microscópio dissecando, picareta de vermes, pipeta e consumíveis para fazer placas de NGM-ágar. As taxas de desarmamento fornecem um método confiável para medir a vida saudável durante o envelhecimento, medida por uma diminuição significativa da surra em animais velhos em comparação com animais jovens (Figura 2C).
Finalmente, a sobrevivência aos ensaios de estresse é uma medida fisiológica adicional de resiliência. A capacidade de ativar as respostas ao estresse geralmente diminui durante o processo de envelhecimento, tornando os animais menos resistentes e mais sensíveis ao estresse. Assim, a resiliência do estresse pode ser usada como um proxy confiável para a saúde do organismo. Aqui, são oferecidos métodos para o levantamento da sensibilidade a 1) estresse do ER em resposta à exposição à túamamicina, agente químico que bloqueia a glicossição ligada a N e resulta no acúmulo de proteínas mal dobradas no ER; 2) estresse mitocondrial/oxidativo através da exposição ao paraquat, agente químico que induz a formação de superóxido em mitocôndrias; e 3) estresse térmico através da exposição a temperaturas elevadas. Para ensaios de tunicamicina e paraquat, a droga é incorporada na placa NGM-ágar durante a produção de placas. Para altas concentrações de tunicamicina, a prole geralmente não se desenvolve e, portanto, as técnicas de esterilização não precisam ser utilizadas. O protocolo aqui apresentado recomenda 25 ng/μL como concentração final de tunicamicina, mas para aqueles com fundos limitados, 10 ng/μL também mostra uma redução significativa na sobrevida (Figura 3A). Ambas as concentrações limitam o desenvolvimento de progêneses e, portanto, não são necessários métodos de esterilização, embora o controle do DMSO exija uma técnica de esterilização ou movimento de animais em novas placas. Isso porque a toxicidade da tunicamicina previne o desenvolvimento da prole, mas o DMSO é praticamente não tóxico, o que permite que a prole se desenvolva totalmente quando cultivada em túmica.
Para ensaios paraquat, uma técnica de esterilização ou movimento de animais é necessária, pois o tratamento paraquat não impede que a prole se desenvolva até a idade adulta. Altos níveis de paraquat (4 mM) reduzem significativamente a vida útil, enquanto os baixos níveis de paraquat (0,25 mM) aumentam a vida útil devido a um efeito hormético (Figura 3B), consistente com os resultados publicados anteriormente52. Finalmente, os ensaios de termotolerância requerem apenas uma incubadora que pode chegar a 30-37 °C, e não são necessários reagentes adicionais. A superexpressão do hsf-1 aumenta a termotolerância a 37 °C (Figura 3C) conforme publicado anteriormente53. No entanto, como outros mostraram anteriormente e a partir dos dados atuais, o grande problema com os ensaios de termotolerância é a sua variabilidade. Muitos fatores podem contribuir para a variabilidade dentro de ensaios de termotolerância, incluindo diferenças entre incubadoras e o tempo que os animais passam fora da incubadora enquanto pontuam termotolerância a cada hora. Para obter uma diretriz completa de termotolerância, consulte a referência 41.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig01.jpg"> Figura 1: Comparação de medidas de vida útil com e sem esterilização. (A) Tempo de vida de nematoides N2 de tipo selvagem cultivados em placas de NGM-ágar semeadas com vetor vazio (ev) ou bactérias hsf-1 RNAi a 20 °C. Os animais foram retirados da prole nos dias 1, 3, 5 e 7 da idade adulta. (B) Vida útil de nematoides N2 do tipo selvagem cultivados em placas NGM-ágar-FUDR semeadas com vetor vazio (ev) ou bactérias hsf-1 RNAi a 20 °C. Os animais foram cultivados até a idade adulta em placas padrão ev ou hsf-1 RNAi, e depois transferidos para placas fudr no primeiro dia da idade adulta. (C) Vida útil de animais mutantes glp-4(bn2) cultivados em placas de NGM-ágar semeadas com vetor vazio (ev) ou hsf-1 RNAi a 25 °C. Para todas as condições, os animais eram marcados para a morte a cada 2 dias até que todos os animais fossem registrados como mortos ou censurados. Animais com ensacamento, saliência ou explosão da vulva, ou aqueles que rastejavam pelos lados das placas e dessecados foram censurados. Todas as estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste Log-Rank Mantel-Cox e podem ser encontradas na Tabela 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig02.jpg"> Figura 2: Contagem de ovos, tamanho da ninhada e surra como medidas de saúde. (A) Ensaios de thrashing foram realizados em animais mutantes glp-4(bn2) cultivados em placas de NGM-ágar semeadas com vetor vazio a 25 °C no dia 1 (azul), dia 4 (vermelho) e dia 9 (verde). Thrashing foi pontuado em animais colocados em solução M9 em uma placa NGM-ágar, vídeo gravado usando uma câmera de smartphone padrão montado em uma ocular de um escopo de dissecação padrão, e surras pontuadas em câmera lenta para precisão. n = 15 animais por condição. (B) As contagens de ovos foram medidas em animais do tipo selvagem N2 (azul) e sur-5p::hsf-1 (vermelho). Os animais foram cultivados a 20 °C e movidos para placas frescas, e os ovos foram contados a cada 12 h. O número total de ovos colocados foi somado. n = 7 animais para tipo selvagem e 9 animais para sur-5p::hsf-1. (C) Os ensaios de ninhadas foram medidos nos mesmos animais que (B) onde os ovos foram cultivados a 20 °C por 2 dias para permitir a eclosão, e todos os ovos eclodidos foram contados. = p &lt; 0,001 calculados utilizando testes não paramétricos de Mann-Whitney. Cada ponto representa um único animal, e as linhas representam a faixa mediana e interquartil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig03.jpg"> Figura 3: Resiliência do estresse como proxy para a saúde do organismo. (A) Ensaio de sobrevivência de animais N2 cultivados na bactéria rnai vetor vazia a 20 °C. Os animais foram movidos para placas contendo 1% DMSO, 10 ng/μL tunicamycin (TM), ou 25 ng/μL TM no primeiro dia da idade adulta. (B) Ensaio de sobrevivência de animais N2 cultivados na bactéria rnai vetor vazia a 20 °C. Os animais foram cultivados a partir da escotilha em placas contendo água, 0,25 mM paraquat (PQ), ou 4 mM PQ. Para A-B, os animais eram marcados para a morte a cada 2 dias até que todos os animais fossem registrados como mortos ou censurados. Animais com ensacamento, saliência ou explosão da vulva, ou aqueles que rastejavam pelos lados das placas e dessecados foram censurados. Todas as estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste Log-Rank Mantel-Cox (Tabela 2). (C) Dados agrupados de todos os ensaios de termotolerância de 37 °C para animais N2 do tipo selvagem versus superexpressão de hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Os dados são representados como por cento vivos no tempo = 9h de um ensaio termotolerância, com cada linha representando um experimento combinado realizado no mesmo dia. Os animais foram cultivados na bactéria rnai vetor vazia a 20 °C e movidos para 37 °C no primeiro dia de idade adulta para ensaio. n = 60 animais por cepa por réplica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td colspan="3">Receita</td>
		</tr><tr><td>Solução alvejante</td>
			<td colspan="3">Hipoclorito de sódio de 1,8% (v/v), 0,375 M KOH</td>
		</tr><tr><td>Carbenicilina</td>
			<td colspan="3">Solução de estoque de 100 mg/mL (1000x) na água. Armazenar a 4 °C por até 6 meses ou -20 °C para armazenamento a longo prazo</td>
		</tr><tr><td>FUDR</td>
			<td colspan="3">Solução de 10 mg/mL na água. Armazenar a -20 °C.</td>
		</tr><tr><td>IPTG</td>
			<td colspan="3">Solução de 1 M na água.</td>
		</tr><tr><td>Caldo de Lysogeny (LB)</td>
			<td colspan="3">Neste protocolo, foi utilizada a LB comercial (ver Tabela de Materiais), mas todas as receitas padrão de LB caseiras usando Bacto-tryptone, extrato de levedura e NaCl são suficientes.</td>
		</tr><tr><td>Solução M9</td>
			<td colspan="3">22 mM KH2PO4 monobásico, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr><tr><td>Mídia de Crescimento de Nematoides (NGM)</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2, 5 μg/mL colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) ágar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>Placas NGM RNAi</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2, 5 μg/mL de colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicilina/ampicillina. Armazenar a 4° C no escuro por até 3 meses</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi DMSO</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">1 mM CaCl2, 5 μg/mL de colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicilina/ampicillina; 1% DMSO</td>
		</tr><tr><td>(controle para t tunicamycina)</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi TM</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2, 5 μg/mL de colesterol, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicilina/ampicillina; 1% DMSO, 25 ng/μL tunicamycin</td>
		</tr><tr><td>Paraquato</td>
			<td colspan="3">Solução de 400 mM na água – deve ser preparada fresca</td>
		</tr><tr><td>Tetraciclina</td>
			<td colspan="3">Solução de estoque de 10 mg/mL (500x) em 100% etanol. Armazenar a -20 °C</td>
		</tr><tr><td>Tunicamycin</td>
			<td colspan="3">Solução de estoque de 2,5 mg/mL em 100% DMSO. Armazene a -80 °C para armazenamento a longo prazo. Esta é uma solução de 100x (solução de trabalho de 25 ng/μL)</td>
		</tr></tbody></table>Mesa 1. Receitas de reagentes e mídia para protocolos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Painel figura correspondente</td>
			<td colspan="2">Tensão, Tratamento</td>
			<td>Vida útil mediana</td>
			<td># Mortes/# Total</td>
			<td>p-valor (Log-Rank)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1A</td>
			<td colspan="2">N2, vetor RNAi, 20 °C</td>
			<td>17</td>
			<td>74/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>65/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1B</td>
			<td colspan="2">N2, vetor RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>120/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>116/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1C</td>
			<td colspan="2">N2, glp-4(bn2), vetor RNAi, 25 °C</td>
			<td>13</td>
			<td>115/121</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C</td>
			<td>4</td>
			<td>120/120</td>
			<td>&lt; 0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2A</td>
			<td colspan="2">N2, vetor RNAi, 20 °C, 1% DMSO</td>
			<td>19</td>
			<td>85/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vetor RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunicamycin</td>
			<td>15</td>
			<td>109/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vetor RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamycin</td>
			<td>12</td>
			<td>117/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2B</td>
			<td colspan="2">N2, vetor RNAi, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>84/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vetor RNAi, 20 °C, 0,25 mM paraquat</td>
			<td>24</td>
			<td>91/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vetor RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat</td>
			<td>6</td>
			<td>50/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr></tbody></table>Mesa 2. Estatísticas para a vida útil e resiliência do estresse.

Caenorhabditis elegans servem como um excelente sistema de modelos com métodos robustos e de baixo custo para levantamento da vida saudável, vida útil e resiliência ao estresse.

Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Este protocolo apresenta os métodos de menor custo e tecnologia mais baixos para servir o envelhecimento em elegans marinhos. Um organismo modelo influente na biologia do envelhecimento. A maior vantagem desses métodos é a facilidade de implementação, utilizando equipamentos e materiais de baixo custo.Tornando-os favoráveis a qualquer pesquisador, independentemente da experiência ou do financiamento disponível. Como estudos antigos de envelhecimento, há variabilidade natural na saúde dentro das populações. Portanto, é essencial que os experimentos sejam realizados em animais saudáveis, bem alimentados e fortemente sincronizados.Para garantir a incapacidade de rip Comece a preparação de uma mídia de crescimento de nematoide de um litro ou placa de NGM auger. Adicione 2,5 gramas de tom de pep, 3,0 gramas de cloreto de sódio e 20 gramas de auger em um frasco de um litro com uma barra de mexida e adicione água destilada a um volume final de 970 mililitros. Esterilize a solução de NGM auger em um frasco de um litro usando uma autoclave padrão ou esterilizador de mídia.E deixe a solução mexer até esfriar a 60 a 75 graus Celsius. Enquanto a solução esfria, aqueça um banho de contas de 65 a 70 graus Celsius. Uma vez que a solução NGM auger esfria a 60 a 75 graus Celsius.Adicione os aditivos líquidos e deixe a solução se misturar completamente por cinco minutos. Em seguida, submergir o frasco em um banho de contas a 65 a 70 graus Celsius para evitar que a mídia se solidifique enquanto derrama na placa. Pipeta de 9 a 11 mililitros da solução em cada placa de 60 mililitros.Quando terminar, coloque a pipeta de volta na solução aquecida para manter a temperatura e para evitar que qualquer mídia se solidifique na pipeta. Repita o procedimento para todas as placas e deixe que as placas de NGM se solidifiquem durante a noite. Uma vez solidificado, use-os para semear placas com bactérias ou armazene as placas em recipientes selados por até três meses a quatro graus Celsius para sincronizar os vermes através do branqueamento.Colete os nematoides despejando uma pequena quantidade de solução M9 em uma placa contendo os vermes sem encher demais a placa de Petri. Em seguida, gire a solução M9 suavemente para soltar vermes dos gramados bacterianos. Em seguida, colete vermes gravid adultos em um tubo de 15 mililitros com uma pipeta sorológica.Evitando perfurar o auger com a ponta da pipeta. Pellule os animais por centr por 30 segundos a 1100 vezes G, e aspire o supernatante. Adicione cinco mililitros da solução de branqueamento recém-preparada para a pelota de verme, e verifique os vermes sob um microscópio dissecando a cada poucos minutos, juntamente com um tremor vigoroso intermitente até que todos os corpos de vermes adultos sejam dissolvidos e apenas ovos são deixados na mistura.Em seguida, pelota os ovos girando para baixo a mistura de alvejante de ovo por 30 segundos a 1100 vezes G e aspirar a solução de branqueamento. Em seguida, lave os ovos pelotados somando 15 mililitros de solução M9 e invertendo o tubo quatro ou cinco vezes para dispersar os ovos e a solução. Novamente, centrifufique o tubo por 30 segundos a 1100 vezes G para pelotar os ovos e aspirar a solução M9.Faça a lavagem quatro vezes para eliminar qualquer alvejante da mistura de ovos. Após a quarta lavagem centrífuga aspira a solução M9 de 100 microliters para dois mililitros, dependendo do número total de vermes branqueados. Agite bem os ovos para quebrar os aglomerados e garantir que os ovos estejam totalmente ressuspendidos na solução M9.Alternativamente, os animais podem ser L um preso por uma sincronização temporal mais apertada adicionando 10 a 12 mililitros de solução M9 à pelota de ovo em um tubo de crônica de 15 mililitros. Deixe os vermes girarem em um rotador por até 24 horas a 20 graus Celsius. Para aproximar o ovo ou l uma pipeta de concentração quatro microlitrais da mistura de ovos em uma placa NGM sentada com bactérias.Em seguida, conte e calcule os ovos presentes por microliter de mídia. Repita a contagem três ou quatro vezes para melhorar a aproximação, com base na placa de aproximação, no número apropriado de ovos ou L um animais presos na placa de NGM auger semeada com bactérias de escolha. Para medir o comportamento da locomotiva dos vermes através de espancamento.Mova um pequeno número de worms adultos do dia um de uma placa de NGM para 10 a 20 microliters de solução M9 sob um escopo de dissecação. Em seguida, concentre-se em um verme de cada vez e conte o número de vezes que o espécime muda de côncavo para formação convexa em 15 segundos. Use um contador de mão e um temporizador e repita o procedimento para 10 a 15 worms.Aduca os vermes até a idade desejada e repita as medidas de espancamento em todas as idades desejadas. Como visualizado, vermes mais velhos batem em velocidades significativamente mais lentas. Para medidas de quantidade e fertilidade.Em 10 a 15 vermes elegans caenorhabditis, desloque l quatro vermes em uma placa ngm auger separada semeada com bactérias de escolha. Permita que os animais cresçam durante a noite a 20 graus Celsius e certifique-se de que um lote recém-semeado de placas esteja pronto para o dia seguinte. Para medir a quantidade de ovos colocados por Caenorhabditis elegans transfira os vermes adultos para uma lâmina de NGM fresca semeada com essa bactéria saqueada a cada 12 a 24 horas por sete a oito dias ou até que os ovos não sejam mais visíveis e conte o número de ovos colocados nas placas.Para medir o tamanho da ninhada de Caenorhabditis elegans Transfira os vermes adultos para uma placa de NGM fresca semeada com bactérias a cada 12 a 24 horas, ou sete a oito dias ou até que a prole não seja mais visível. Mantenha todas as placas contendo ovos a 20 graus Celsius. Dois dias depois de transferir vermes.Conte a descendência desenvolvida na placa. Conte todos os vermes vivos e em desenvolvimento na fase L quatro ou antes para garantir que a geração F duas não confluna resultados. Remova todos os vermes da placa como são contados.Mantenha as placas por mais um a dois dias antes de pontuá-las novamente para garantir que quaisquer animais com eclosão ou desenvolvimento atrasados não sejam perdidos. O efeito do método de esterilização sobre a vida útil dos nematoides tipo N2 selvagem mostrou que as mudanças na vida útil dos vermes cultivados nas placas de NGM auger foram semelhantes às dos vermes cultivados nas placas ngm auger FUDR ou no glp quatro animais mutantes BN2 cultivados nas placas de NGM auger. O animal knockdown de curta duração do HSF mostrou um declínio significativo na vida útil de todas as condições.Uma diminuição substancial no número de ovos colocados e tamanho de ninhada foi encontrada no HSF um sobre animais de expressão em comparação com os controles do tipo selvagem. Alguns animais de HSF um sobre expressão apresentaram esterilidade completa indicando que a saúde reprodutiva pode ser inversamente correlacionada com a longevidade. A taxa de desarmamento forneceu um método confiável para medir a saúde durante o envelhecimento, medida por uma diminuição significativa da surra em animais velhos em comparação com os jovens.A sobrevida ao estresse são ensaios confiáveis para medir a saúde do organismo, a tunicamiciccin que causa estresse reticúlume resultou em uma redução da vida útil, independentemente da concentração em comparação com o controle do DMSO. Os altos níveis de paraquat encurtaram significativamente a vida útil, enquanto as baixas concentrações de paraquat aumentaram a vida útil devido ao efeito hormótico. Nos ensaios de tolerância termo, a expressão sobre a HSF aumentou a tolerância termo a 37 graus Celsius Para todos os experimentos de vida e envelhecimento.É importante lembrar que as técnicas de esterilização podem ter um efeito pleiotrópico na saúde do organismo, o que impacta os resultados. Existem muitas abordagens adicionais e complementares para medir o tempo de saúde se os equipamentos e a infraestrutura estiverem disponíveis, incluindo medições de transcrição, agregação de proteínas de tradução, organela, morfologia e funções metabólicas.

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Os micróbios intestinais podem impactar positiva ou negativamente a saúde de seu hospedeiro por meio de mecanismos específicos ou conservados. Caenorhabditis elegans é uma plataforma conveniente para rastrear esses micróbios. O presente protocolo descreve a triagem de alto rendimento de 48 isolados bacterianos quanto ao impacto na resistência ao estresse dos nematoides, usados como um proxy para a saúde dos vermes.

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo de nematoides individuais isolados em meios sólidos em dispositivos microfabricados de múltiplos poços. Essa abordagem permite que animais individuais sejam monitorados ao longo de suas vidas para uma variedade de fenótipos relacionados ao envelhecimento e à saúde, incluindo atividade, tamanho e forma corporal, geometria do movimento e sobrevivência.

Cultura de Longa Duração e Monitoramento de Caenorhabditis elegans Isolados em Meio Sólido em Dispositivos Multipoços

A plataforma de imagem "The Lifespan Machine" automatiza a observação ao longo da vida de grandes populações. Mostramos os passos necessários para realizar ensaios de expectativa de vida, resistência ao estresse, patogênese e envelhecimento comportamental. A qualidade e abrangência dos dados permitem estudar intervenções no envelhecimento, apesar da presença de variações biológicas e ambientais.

Ensaios de envelhecimento comportamental e expectativa de vida útil de alto rendimento usando a máquina de vida útil

Descrevemos um morbidostato configurável de baixo custo que permite a caracterização da resistência a antibióticos ajustando dinamicamente a concentração do medicamento. O dispositivo pode ser integrado a uma plataforma microfluídica multiplexada. A abordagem pode ser ampliada para estudos laboratoriais de resistência a antibióticos.

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Aqui, apresentamos um quadro para relacionar a restrição dietética de vasta gama de expectativa de vida e expressão gênica. Descrevemos os protocolos para a vasta gama de restrição dietética e para a imagem latente quantitativa da expressão do gene sob esse paradigma. Nós esboçamos mais análises computacionais para revelar subjacentes recursos de processamento de informações dos circuitos genéticos envolveram na detecção comida.

Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

Aprenda métodos de baixo custo para medir expectativa de vida e saúde em Caenorhabditis elegans. Esta técnica utiliza sincronização por cloração e análise de movimentação para estudar envelhecimento.

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