Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Este método permite estudar formações de complexos proteicos que requerem co-expressão para amostras de teste eficientes, como a formação de heterodímeros. O principal potencial final deste método é explorar a co-expressão de proteínas estudadas diferencialmente marcadas usando combinações de vetores compatíveis para promover a montagem complexa eficiente, juntamente com o fluxo de trabalho e a escalabilidade eficientes em termos de tempo, permitindo o teste rápido de patches de múltiplas interações. Este método também pode ser usado para triagem rápida de condições ideais de expressão e purificação de proteínas.

A demonstração visual ajuda a executar corretamente as etapas críticas do protocolo, como a configuração de co-expressão, a interrupção da célula e as etapas subsequentes. Para começar, crescer Escherichia coli BL21 (DE3) cepa em Luria-Bertani, ou LB, meio a 37 graus Celsius para uma densidade óptica, ou OD, de 0,1 a 0,2. Centrifugar um mililitro da suspensão bacteriana durante um minuto a 9 000 G a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de transformação gelado, ou TB, e incube por 10 minutos no gelo. No final da incubação, centrifugar durante 30 segundos a 8 000 G a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão TB, 100 nanogramas de cada vetor e incube por 30 minutos no gelo.

Aqueça a 42 graus Celsius por 150 segundos, depois esfrie no gelo por um minuto. Em seguida, adicione um mililitro de meio LB sem antibióticos e incube a 37 graus Celsius por 90 minutos. Após a incubação, centrifugar e ressuspender o pellet em 100 microlitros de meio LB antes de banhar a suspensão em uma placa de ágar LB contendo 0,5% de glicose e antibióticos correspondentes.

Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, lave as células da placa com dois mililitros de meio LB em 50 mililitros de meio LB com antibióticos correspondentes. Adicionar íons metálicos ou outros cofatores conhecidos antes de armazenar uma alíquota com 20% de glicerol a menos 70 graus Celsius para experimentos subsequentes.

Crescer as células com uma rotação constante de 220 RPM a 37 graus Celsius para uma OD de 0,5 a 0,7. Arrefecer a cultura à temperatura ambiente e adicionar IPTG a uma concentração final de um milimol. Armazenar uma alíquota de 20 microlitros de suspensão celular como controle da amostra não induzida.

Incubar as células durante a noite a 220 RPM a 18 graus Celsius. No dia seguinte, divida a suspensão bacteriana em duas partes e armazene alíquotas de 20 microlitros para confirmar a expressão da proteína. Centrifugar a suspensão celular restante a 4 000 G durante 15 minutos.

Para o ensaio pulldown, ressuscite os pellets em um mililitro de tampão de lise gelada com inibidores de protease e agentes redutores adicionados imediatamente antes do experimento. Ajustar a composição tampão para as proteínas testadas. Interrompa as células por sonicação no gelo e armazene uma alíquota de 20 microlitros para eletroforese.

Centrifugar a 16.000 G por 30 minutos e coletar 20 microlitros do lisado clarificado para eletroforese. Equilibre a resina com um mililitro de tampão de lise gelado durante 10 minutos, depois centrifugar a 2 000 G durante 30 segundos e eliminar o sobrenadante. Adicione lisados celulares à resina e incube por 10 minutos a uma rotação constante de 15 RPM.

Em seguida, centrifugar e descartar o sobrenadante antes de coletar 20 microlitros da fração não ligada para análise. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem gelado e incube por um minuto. Novamente, centrifugar e descartar o sobrenadante.

Em seguida, realize duas lavagens longas com tampão de lavagem gelado. Após a segunda lavagem, eluir as proteínas ligadas com 50 microlitros do tampão de eluição em um agitador a 1.200 RPM a quatro graus Celsius por 10 minutos. Analisar as proteínas eluídas com eletroforese em gel de poliacrilamida SDS.

Estudos do domínio associado ao dedo de zinco, ou ZAD, homodimerização em proteína de ligação à maltose, ou MBP, e ensaios pulldown de 6xHistidina são mostrados aqui. A co-expressão de ZADs fundidos com MBP e Tioredoxina 6xHistidina, mostra boa e reprodutível atividade de homodimerização, aparecendo como uma banda adicional nos resultados do SDS-PAGE do ensaio pulldown MBP. Outro exemplo de uso do método para estudar a formação complexa alternativa é mostrado aqui.

No ensaio de co-expressão, o ENY2 marcado com 6xHistidine interagiu tanto com o Sgf11 marcado com GST quanto com o MBP-CTCF, mas nenhum GST-Sgf11 estava presente nos pulldowns do MBP e vice-versa. Uma comparação passo a passo dos intervalos de tempo necessários no fluxo de trabalho do ensaio pulldown convencional em comparação com o pulldown acoplado à co-expressão é mostrada aqui. Os resultados da utilização de ambas as técnicas para estudar a mesma interação entre o domínio BTB da proteína CP190 e o domínio C-terminal marcado com GST da proteína Drosophila CTCF são mostrados aqui.

A escolha correta do teste de afinidade e solubilidade, Tiorredoxina, GST ou MBP, é fundamental para a execução eficiente do ensaio. Outro passo crítico é a interrupção rápida e uniforme da célula. É altamente recomendável usar sondas sonicator de várias pontas.

Este método permite o estudo direto da formação de heterodímeros entre domínios proteicos que, de outra forma, formam homodímeros que não se dissociariam durante a incubação de proteínas purificadas no ensaio pulldown convencional.