Name: Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda o ensaio pulldown com co-expressão em Escherichia coli para estudar interações proteína-proteína desafiadoras. Este método permite a montagem eficiente de complexos proteicos heterodiméricos de forma rápida.

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Este trabalho foi apoiado pelos projetos da Fundação Russa de Ciência 19-74-30026 (desenvolvimento e validação de métodos) e 19-74-10099 (ensaios de interação proteína-proteína); e pelo Ministério da Ciência e Ensino Superior da Federação Russa - concessão 075-15-2019-1661 (análise de interações representativas proteína-proteína).

A representação esquemática do fluxo de trabalho do método é mostrada na Figura 1.
1. Co-transformação de E. coli
<ol><li>Preparar vetores de expressão para proteínas-alvo usando métodos de clonagem padrão. NOTA: Normalmente, um bom ponto de partida é usar vetores pGEX/pMAL convencionais com um gene de resistência à ampicilina e origem ColE1 para a expressão de proteínas marcadas com GST/MBP e um vetor compatível com origem p15A ou RSF e resistência à canamicina para expressar proteínas marcadas com 6xHis, em alguns casos combinadas com tioredoxina ou SUMO-tag para aumentar a solubilidade. Normalmente, várias combinações de tags precisam ser testadas antes do experimento. O método descrito em si é conveniente para testar em lote as condições de expressão das proteínas-alvo. É importante notar que a maioria das cepas Rosetta já contém o plasmídeo com origem p15A para expressar os tRNAs para códons raros; portanto, se o uso de tais cepas é uma opção possível, os plasmídeos p15A devem ser evitados. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes.<ol><li>Cultivar bactérias de uma estirpe apropriada em meio de Luria-Bertani (LB) a 37 °C para uma densidade óptica (OD) de 0,1-0,2. A cepa BL21(DE3) foi utilizada como exemplo neste estudo. NOTA: Recomenda-se o uso de células competentes recém-preparadas para alcançar uma cotransformação eficiente com dois vetores. Se mais de dois vetores precisarem ser cotransformados, é melhor transformá-los sequencialmente para alcançar uma boa eficiência de transformação. A eletroporação é uma boa alternativa.</li>
		<li>Centrifugar 1,0 ml da suspensão bacteriana durante 1 min a 9.000 x g a 4 °C e eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 0,5 mL de tampão de transformação de tampão gelado (TB) (MOPS de 10 mM [pH 6,7], KCl de 250 mM, MnCl2 de 55 mM e CaCl2 de 15 mM) e incube por 10 min no gelo.</li>
		<li>Centrifugar durante 30 s a 8.000 x g a 4 °C e eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 100 μL de tampão TB, adicione 100 ng de cada vetor e incube por 30 minutos no gelo. Transforme separadamente vetores únicos para estudar o comportamento das proteínas sem co-expressão. Além disso, co-transformam vetores de expressão em pares com vetores de co-expressão vazios para controles de vinculação não específicos. NOTA: Nos exemplos fornecidos neste estudo, vetores pGEX/pMAL com cDNAs correspondentes fundidos a cDNAs GST/MBP foram usados em combinação com vetores derivados de pACYC compatíveis com domínios de proteína parceira codificadores de cDNA fundidos ao cDNA com cDNA de tioredoxina cDNA.</li>
		<li>Aqueça a 42 °C durante 150 s e, em seguida, arrepie durante 1 min no gelo.</li>
		<li>Adicionar 1 ml de meio LB líquido sem antibióticos e incubar a 37 °C durante 90 min. Placa em placas de ágar LB contendo 0,5% de glicose e antibióticos correspondentes (as concentrações comuns são: 50 mg/L de ampicilina; 20 mg/L de canamicina; 50 mg/L de estreptomicina; 35 mg/L de cloranfenicol). Incubar as placas durante a noite a 37 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expressão
<ol><li>Lavar as células da placa com 2 mL de meio LB líquido em 50 mL de LB media com antibióticos correspondentes (as concentrações comuns são: 50mg/L de ampicilina; 20 mg/L de canamicina; 50 mg/L de estreptomicina; 35 mg/L de cloranfenicol). Adicione íons metálicos ou outros cofatores conhecidos (nos exemplos fornecidos neste estudo, 0,2 mM ZnCl2 foi adicionado ao meio). Conservar uma alíquota com 20% de glicerol a -70 °C para uma repetição subsequente da experiência. NOTA: Recomenda-se lavar várias colônias diretamente da placa para excluir a possibilidade de má expressão em um único clone isolado devido a eventos ocasionais de recombinação entre dois plasmídeos.</li>
	<li>Cultivar as células com uma rotação constante de 220 rpm a 37 °C a uma OD de 0,5-0,7, arrefecer até à temperatura ambiente (RT) e adicionar isopropilo β-D-1-thiogalactopiranóside (IPTG) a 1 mM. Armazenar uma alíquota de 20 μL de suspensão celular como controlo da amostra não induzida.</li>
	<li>Incubar as células com uma rotação constante de 220 rpm a 18 °C durante a noite. NOTA: O tempo e a temperatura ideais de incubação podem variar; 18 °C durante a noite funciona melhor para a maioria das proteínas e é aconselhável ser tentado por padrão. Reduza o tempo de incubação para 2-3 h se for observada uma forte ligação não específica.</li>
	<li>Divida a suspensão bacteriana em duas partes (ou mais se mais de duas etiquetas diferentes foram usadas) e armazene uma alíquota de 20 μL da suspensão celular para confirmar a expressão da proteína. Centrífuga a 4.000 x g por 15 min. NOTA: Ponto de pausa: os pellets bacterianos podem ser armazenados a -70 °C durante pelo menos 6 meses.</li>
</ol>3. Ensaio suspenso
NOTA: Os procedimentos detalhados são descritos para proteínas marcadas com 6xHis ou MBP/GST. Todos os procedimentos são realizados a 4°C.
<ol><li>Ressussuscite os pellets bacterianos em 1 mL de tampão de lise gelada com inibidores de protease e agentes redutores (ver abaixo) adicionados imediatamente antes do experimento. Evite o ditiotreitol (TDT) ao usar resinas quelantes de metal, uma vez que retira os íons metálicos. Ajustar a composição tampão para as proteínas testadas. As receitas comuns de tampões de lise encontradas adequadas para a maioria das proteínas são:<ol><li>6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol, 5 mM de beta-mercaptoetanol, 1 mM de fenilmetilsfulfonilfluoreto (PMSF) e uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Pulldown GST ou MBP: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol, 5 mM de TDT, 1 mM PMSF e uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Perturbe as células por sonicação no gelo. Armazenar uma alíquota de 20 μl para eletroforese. NOTA: Normalmente, são necessários 20-25 pulsos de 5 s com intervalos de 15 s com potência de saída de 20 W por amostra. O poder de sonicação apropriado deve ser ajustado para cada instrumento para evitar o superaquecimento e garantir a interrupção total da célula. Para obter um melhor desempenho, é altamente recomendável usar sondas sonicatoras de várias pontas de alto rendimento.</li>
	<li>Centrífuga a 20.000 x g por 30 min. Coletar 20 μL do lisado clarificado para posterior análise SDS-PAGE.</li>
	<li>Equilibrar a resina (50 μL para cada amostra) com 1 mL de tampão de lise gelada por 10 min, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar lisados celulares (concentração de proteína total: 20-50 mg/mL) à resina, incubar por 10 min a uma rotação constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante. Coletar 20 μL da fração não ligada para análise SDS-PAGE subsequente.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de lavagem gelada e incube por 1 min. Centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante. As receitas comuns para amortecedores de lavagem são:<ol><li>6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol e 5 mM de beta-mercaptoetanol.</li>
		<li>Pulldown GST ou MBP: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol e 5 mM de TDT.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize duas lavagens longas: adicione 1 mL de tampão de lavagem gelado, incube por 10-30 min com uma rotação constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de lavagem gelada, incube por 1 min, centrifuga a 2.000 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Eluir as proteínas ligadas com 50 μL do tampão de eluição em um agitador a 1.200 rpm por 10 min. As receitas comuns de buffers de eluição são:<ol><li>6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM imidazol e 5 mM beta-mercaptoetanol.</li>
		<li>GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutationa (ajustado para pH 7,5 com Tris básico) e 5 mM TDT.</li>
		<li>MBP-pulldown: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM de maltose e 5 mM de TDT.</li>
	</ol></li>
	<li>Analise as proteínas eluídas com SDS-PAGE. NOTA: A percentagem de acrilamida deve ser ajustada ao tamanho das proteínas. Nos exemplos fornecidos neste estudo, foram utilizados géis de acrilamida a 12%, funcionando em tampão tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM de glicina, 0,1% SDS) em tensão constante de 180 V. Os géis foram corados por ebulição em azul de Coomassie a 0,2% R250, ácido acético a 10% e isopropanol a 30%, e descorados por ebulição em ácido acético a 10%. A quantidade de proteína carregada não deve ser igual, uma vez que várias quantidades de proteínas que interagem podem ser puxadas para baixo em diferentes experimentos.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
<li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+dimerization%2C+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li>
<li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li>
<li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602(2022).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755(2021).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li>
<li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li>
<li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316(2016).</li>
<li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mediator+head+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li>
<li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li>
<li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li>
<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
<li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+ferritin%3A+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li>
<li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li>
<li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li>
<li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

O método descrito permite o teste de interações proteína-proteína que não podem ser eficientemente montadas in vitro e requerem co-expressão. O método é uma das poucas abordagens adequadas para o estudo de proteínas heterodimerizantes, que também são capazes de homodimerização, uma vez que, quando purificadas separadamente, essas proteínas formam homodímeros estáveis que, na maioria das vezes, não conseguem dissociar e reassociar durante o experimento 3,11</su...

O pulldown convencional é amplamente utilizado para estudar as interações proteína-proteína1. No entanto, as proteínas purificadas muitas vezes não interagem efetivamente in vitro2,3, e algumas delas são insolúveis sem seu parceiro de ligação 4,5. Tais proteínas podem necessitar de montagem co-translacional ou da presença de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Outra limitação do pulldown convencional é o teste de possível atividade de heteromultimerização entre domínios que podem existir como homooligômeros estáveis montados co-translacionalmente 8,10, pois muitos deles não conseguem dissociar e reassociar in vitro durante o tempo de incubação. A co-expressão mostrou-se útil na superação de tais problemas 3,11. A co-expressão usando vetores compatíveis em bactérias foi utilizada com sucesso para purificar grandes complexos macromoleculares multi-subunidades, incluindo o complexo repressivo policomb PRC212, o módulo de cabeça mediador da RNA polimerase II13, a placa de base do bacteriófago T4 14, o módulo 15,16 da desubiquitinilase do complexo SAGA 15,16 e a ferritina 17. As origens de replicação comumente usadas para coexpressão são ColE1, p15A18, CloDF1319 e RSF20. No sistema de expressão Duet comercialmente disponível, essas origens são combinadas com diferentes genes de resistência a antibióticos e convenientes múltiplos locais de clonagem para produzir vetores policistrônicos, permitindo a expressão de até oito proteínas. Essas origens têm diferentes números de cópia e podem ser usadas em combinações variadas para alcançar níveis de expressão equilibrados de proteínas-alvo21. Para testar as interações proteína-proteína, várias tags de afinidade são usadas; os mais comuns são 6xHistidina, glutationa-S-transferase (GST) e proteína ligadora de maltose (MBP), cada uma das quais tem uma afinidade específica com a resina correspondente. GST e MBP também aumentam a solubilidade e a estabilidade das proteínas marcadas22.
Vários métodos envolvendo a co-expressão de proteínas em células eucarióticas também foram desenvolvidos, o mais proeminente dos quais é o ensaio híbrido de levedura dupla (Y2H)23. O ensaio Y2H é barato, fácil e permite o teste de múltiplas interações; no entanto, seu fluxo de trabalho leva mais de 1 semana para ser concluído. Há também alguns ensaios baseados em células de mamíferos menos utilizados, por exemplo, ensaio fluorescente de dois híbridos (F2H)24 e ensaio de interação proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)25. O ensaio F2H é relativamente rápido, permitindo observar interações proteicas em seu ambiente celular nativo, mas envolve o uso de equipamentos de imagem caros. Todos esses métodos têm uma vantagem sobre a expressão procariótica, proporcionando a tradução eucariótica nativa e o ambiente de dobramento; no entanto, eles detectam a interação indiretamente, seja por ativação transcricional ou por transferência de energia fluorescente, que muitas vezes produz artefatos. Além disso, as células eucarióticas podem conter outros parceiros de interação de proteínas de interesse, o que pode interferir no teste de interações binárias entre proteínas de eucariotas superiores.
O presente estudo descreve um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas seguido de técnicas convencionais de pulldown. O método permite estudar as interações entre proteínas-alvo que requerem co-expressão. É mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, permitindo o teste em lote de vários alvos, o que o torna vantajoso na maioria dos casos. A co-expressão usando vetores compatíveis é mais conveniente do que a co-expressão policistrônica, uma vez que não requer uma etapa de clonagem trabalhosa.

<table><tbody><tr><td>Sonda de 8 ELEMENTOS</td><td>Sonics</td><td>630-0586</td><td>As sondas sonicadoras de 8 elementos de alto rendimento Agar</td></tr><tr><td></td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilose</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>Resina para purificação de proteínas marcadas com MBP</td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (canamicina); A0839 (ampicilina)</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa agarose</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>Resina para purificação de proteínas marcadas com GST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>Resina para purificação de proteínas marcadas com 6xHis</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>AppliChem</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>AppliChem</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>Vetor para co-expressão de proteínas com origem de replicação p15A</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td><td>Vetor para co-expressão de proteínas com origem de replicação CloDF13</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Coquetel VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>Inibidor de Protease Coquetel</td></tr><tr><td>pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>Vetor para co-expressão de proteínas com origem de replicação RSF</td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Processador</td> líquido ultrassônico ZnCl<td></td>2AppliChem A6285 do sonicator Sonics CV334 de AppliChem A2264 <td></td></tr><tr><td></td><td>VC505</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio pulldown juntamente com co-expressão em células de bactérias como uma ferramenta eficiente em tempo para testar interações desafiadoras proteína-proteína

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown é um ensaio de interação proteína-proteína fácil e amplamente utilizado. No entanto, tem limitações no estudo de complexos proteicos que não se reúnem efetivamente in vitro. Tais complexos podem exigir montagem co-translacional e a presença de chaperonas moleculares; ou formam oligômeros estáveis que não podem dissociar e reassociar in vitro ou são instáveis sem um parceiro de ligação. Para superar esses problemas, é possível utilizar um método baseado na co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas utilizando um conjunto de vetores compatíveis seguidos pelas técnicas convencionais de pulldown. O fluxo de trabalho é mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, porque não possui as etapas demoradas de purificação separada de proteínas que interagem e sua incubação seguinte. Outra vantagem é uma maior reprodutibilidade devido a um número significativamente menor de etapas e um menor período de tempo em que as proteínas que existem dentro do ambiente in vitro são expostas à proteólise e oxidação. O método foi aplicado com sucesso para estudar uma série de interações proteína-proteína quando outras técnicas in vitro foram consideradas inadequadas. O método pode ser usado para testar em lote as interações proteína-proteína. Resultados representativos são mostrados para estudos de interações entre o domínio BTB e proteínas intrinsecamente desordenadas, e de heterodímeros de domínios associados ao dedo de zinco.

O método descrito foi utilizado rotineiramente com muitos alvos diferentes. Apresentamos aqui alguns resultados representativos que provavelmente não podem ser obtidos usando técnicas convencionais de pulldown. O primeiro é o estudo da dimerização específica do ZAD (domínio associado ao dedo do zinco)11. As ZADs formam dímeros estáveis e específicos, com heterodímeros possíveis apenas entre domínios intimamente relacionados dentro de grupos parálogos. Os dímeros formados por esses domínios são est...

Aqui, descrevemos um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas usando um conjunto de vetores compatíveis, seguido pelas técnicas convencionais de pulldown para estudar complexos proteicos que não podem se montar in vitro.

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Este método permite estudar formações de complexos proteicos que requerem co-expressão para amostras de teste eficientes, como a formação de heterodímeros. O principal potencial final deste método é explorar a co-expressão de proteínas estudadas diferencialmente marcadas usando combinações de vetores compatíveis para promover a montagem complexa eficiente, juntamente com o fluxo de trabalho e a escalabilidade eficientes em termos de tempo, permitindo o teste rápido de patches de múltiplas interações. Este método também pode ser usado para triagem rápida de condições ideais de expressão e purificação de proteínas.A demonstração visual ajuda a executar corretamente as etapas críticas do protocolo, como a configuração de co-expressão, a interrupção da célula e as etapas subsequentes. Para começar, crescer Escherichia coli BL21 (DE3) cepa em Luria-Bertani, ou LB, meio a 37 graus Celsius para uma densidade óptica, ou OD, de 0,1 a 0,2. Centrifugar um mililitro da suspensão bacteriana durante um minuto a 9 000 G a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de transformação gelado, ou TB, e incube por 10 minutos no gelo. No final da incubação, centrifugar durante 30 segundos a 8 000 G a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão TB, 100 nanogramas de cada vetor e incube por 30 minutos no gelo.Aqueça a 42 graus Celsius por 150 segundos, depois esfrie no gelo por um minuto. Em seguida, adicione um mililitro de meio LB sem antibióticos e incube a 37 graus Celsius por 90 minutos. Após a incubação, centrifugar e ressuspender o pellet em 100 microlitros de meio LB antes de banhar a suspensão em uma placa de ágar LB contendo 0,5% de glicose e antibióticos correspondentes.Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, lave as células da placa com dois mililitros de meio LB em 50 mililitros de meio LB com antibióticos correspondentes. Adicionar íons metálicos ou outros cofatores conhecidos antes de armazenar uma alíquota com 20% de glicerol a menos 70 graus Celsius para experimentos subsequentes.Crescer as células com uma rotação constante de 220 RPM a 37 graus Celsius para uma OD de 0,5 a 0,7. Arrefecer a cultura à temperatura ambiente e adicionar IPTG a uma concentração final de um milimol. Armazenar uma alíquota de 20 microlitros de suspensão celular como controle da amostra não induzida.Incubar as células durante a noite a 220 RPM a 18 graus Celsius. No dia seguinte, divida a suspensão bacteriana em duas partes e armazene alíquotas de 20 microlitros para confirmar a expressão da proteína. Centrifugar a suspensão celular restante a 4 000 G durante 15 minutos.Para o ensaio pulldown, ressuscite os pellets em um mililitro de tampão de lise gelada com inibidores de protease e agentes redutores adicionados imediatamente antes do experimento. Ajustar a composição tampão para as proteínas testadas. Interrompa as células por sonicação no gelo e armazene uma alíquota de 20 microlitros para eletroforese.Centrifugar a 16.000 G por 30 minutos e coletar 20 microlitros do lisado clarificado para eletroforese. Equilibre a resina com um mililitro de tampão de lise gelado durante 10 minutos, depois centrifugar a 2 000 G durante 30 segundos e eliminar o sobrenadante. Adicione lisados celulares à resina e incube por 10 minutos a uma rotação constante de 15 RPM.Em seguida, centrifugar e descartar o sobrenadante antes de coletar 20 microlitros da fração não ligada para análise. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem gelado e incube por um minuto. Novamente, centrifugar e descartar o sobrenadante.Em seguida, realize duas lavagens longas com tampão de lavagem gelado. Após a segunda lavagem, eluir as proteínas ligadas com 50 microlitros do tampão de eluição em um agitador a 1.200 RPM a quatro graus Celsius por 10 minutos. Analisar as proteínas eluídas com eletroforese em gel de poliacrilamida SDS.Estudos do domínio associado ao dedo de zinco, ou ZAD, homodimerização em proteína de ligação à maltose, ou MBP, e ensaios pulldown de 6xHistidina são mostrados aqui. A co-expressão de ZADs fundidos com MBP e Tioredoxina 6xHistidina, mostra boa e reprodutível atividade de homodimerização, aparecendo como uma banda adicional nos resultados do SDS-PAGE do ensaio pulldown MBP. Outro exemplo de uso do método para estudar a formação complexa alternativa é mostrado aqui.No ensaio de co-expressão, o ENY2 marcado com 6xHistidine interagiu tanto com o Sgf11 marcado com GST quanto com o MBP-CTCF, mas nenhum GST-Sgf11 estava presente nos pulldowns do MBP e vice-versa. Uma comparação passo a passo dos intervalos de tempo necessários no fluxo de trabalho do ensaio pulldown convencional em comparação com o pulldown acoplado à co-expressão é mostrada aqui. Os resultados da utilização de ambas as técnicas para estudar a mesma interação entre o domínio BTB da proteína CP190 e o domínio C-terminal marcado com GST da proteína Drosophila CTCF são mostrados aqui.A escolha correta do teste de afinidade e solubilidade, Tiorredoxina, GST ou MBP, é fundamental para a execução eficiente do ensaio. Outro passo crítico é a interrupção rápida e uniforme da célula. É altamente recomendável usar sondas sonicator de várias pontas.Este método permite o estudo direto da formação de heterodímeros entre domínios proteicos que, de outra forma, formam homodímeros que não se dissociariam durante a incubação de proteínas purificadas no ensaio pulldown convencional.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Interação proteína-proteína testes é indispensável para dissecção de funcionalidade da proteína. Aqui, nós apresentamos...

Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro</em

Neste vídeo, demonstramos o ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado - um ensaio de proximidade baseado em esferas. Ele utiliza grânulos aceptores e doadores de tamanho homogêneo, imobilizados com duas proteínas que tendem a interagir para rastrear pequenas moléculas potenciais que inibem as interações proteicas.

Ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificada: um ensaio de proximidade baseado em esferas para rastrear pequenas moléculas que inibem as interações proteína-proteína

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

Este artigo ilustra o uso de marcação de rádio de perseguição de pulso em combinação com fotocrosslinking específico do local para monitorar as interações entre uma proteína de interesse e outros fatores em E. coli. Ao contrário dos métodos tradicionais de reticulação química, essa abordagem gera "instantâneos" de alta resolução de uma via de montagem ordenada em uma célula viva.

Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

As interações entre proteínas são fundamentais para todos os processos celulares. Usando bioluminescência Transferência de Energia de Ressonância, a interacção entre um par de proteínas podem ser monitoradas em células vivas e em tempo real. Além disso, os efeitos das mutações potencialmente patogénicos pode ser avaliada.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

As proteínas interagem entre si e essas interações determinam em grande parte suas funções. Os parceiros de interação proteica podem ser identificados em alto rendimento in vivo usando um ensaio de aptidão de levedura baseado no ensaio de complementação de fragmentos de proteína diidrofolato redutase (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

A co-expressão de proteínas é uma alternativa poderosa para a reconstituição in vitro de complexos proteicos e auxilia na realização de testes bioquímicos e genéticos in vivo. Aqui relatamos o uso da co-expressão de proteínas em Escherichia coli para obter complexos proteicos e ajustar a frequência de mutação das células.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

Este manuscrito descreve um procedimento experimental de fácil e rápido para determinar interações da proteína-proteína, baseadas na medição da atividade de luciferase.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

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Aprenda o ensaio pulldown com co-expressão em Escherichia coli para estudar interações proteína-proteína desafiadoras. Este método permite a montagem eficiente de complexos proteicos heterodiméricos de forma rápida.

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

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