Análise em Tempo Real da Bioenergética em Células Epiteliais Pigmentares Pigmentares Humanas Primárias Usando Respirometria de Alta Resolução

Interrogar perfis bioenergéticos em tempo real de oxfos e glicólise está emergindo como um fator-chave na caracterização da saúde e função do EPR. A respirometria de alta resolução permite uma maneira eficiente de comparar o estado metabólico de PSE normal e doente. Esta técnica tem a vantagem da exploração simultânea de oxfos e glicólise através de uma medida da taxa de consumo de oxigênio, OCR e taxa de acidificação extracelular, ECAR.

As células RPE são células altamente metabolicamente ativas e são uma das primeiras células a degenerar durante a DMRI. Compreender sua função metabólica e mitocondrial, torna possível o desenvolvimento de novas drogas. Para começar, adicione 100 microlitros por poço da suspensão celular no meio RPE humano a uma concentração final de 20.000 células por 100 microlitros em cada poço.

E garantir deixar os poços de quatro cantos vazios. Pipete para cima e para baixo várias vezes para garantir uma suspensão de célula homogênea, usando uma pipeta multicanal para facilidade e consistência. Adicione 100 microlitros de mídia apenas aos quatro poços de canto vazios para correção de fundo.

Deixe a placa de cultura celular à temperatura ambiente por uma hora para ajudar a minimizar os efeitos de borda. Em seguida, coloque-o na incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e umedecido. Após a incubação durante a noite, examine as células sob o microscópio para verificar sua morfologia e nível de pigmentação antes de mudar o meio.

Nos dias de exame subsequentes, certifique-se de que as células sejam confluentes com uma morfologia característica semelhante a um paralelepípedo e adquiram pigmentação ao longo do tempo. Para garantir a hidratação do cartucho sensor no dia anterior ao ensaio, encha cada poço da placa do utilitário com 200 microlitros de água deionizada e coloque o cartucho do sensor, submerso em água na placa do utilitário. Mantenha aproximadamente 20 mililitros da solução calibrante durante a noite em um forno umidificado a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono.

Ligue o instrumento de respirometria de alta resolução e inicie o software para permitir que o instrumento se estabilize a 37 graus Celsius durante a noite. No dia do ensaio, substitua a água da placa da concessionária por um volume igual de solução calibrante aquecida pelo menos 45 minutos antes da execução do ensaio. Aquecer 25 mililitros do meio de ensaio de teste de esforço Mito preparado sem vermelho fenol a 37 graus Celsius e filtrar a vácuo o meio ajustado para pH 7,4, usando uma unidade de filtro superior de tubo.

Remova o meio de EPR humano da placa de cultura celular e adicione 100 microlitros de meio de ensaio recém-preparado. Em seguida, coloque a placa de cultura celular em um forno umidificado a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono por uma hora antes de iniciar o ensaio. Cada cartucho sensor tem quatro portas de entrega de reagentes por poço para injetar os compostos de teste em poços de placa de cultura celular durante o ensaio.

Preparar três mililitros das soluções do medicamento Tenex cada, diluindo os estoques do medicamento em seus respectivos meios de ensaio. Em seguida, pipetar 20 microlitros do estoque de medicamentos Tenex para a porta A, 22 microlitros para a porta B e 25 microlitros para a porta C para atingir a concentração final especificada da droga em cada poço. Em seguida, no software de análise, abra a guia de modelos, selecione Mito stress test e preencha as definições de grupo.

Detalhes de entrada sobre a estratégia de injeção para os medicamentos de teste de estresse Mito. Em seguida, insira detalhes sobre os diferentes grupos experimentais no ensaio para controle ou tratamento. Detalhes de entrada no meio de ensaio para adicionar diferentes suplementos e suas concentrações específicas ao meio de ensaio de base.

E, finalmente, adicione o tipo de célula. Clique na próxima aba e, em seguida, no Mapa da Placa para atribuir diferentes grupos sob exame à sua localização específica na placa de 96 poços. Ao preencher o Mapa da Placa, clique na guia protocolo para revisar o protocolo do instrumento para o protocolo padrão do teste de estresse Mito.

Em seguida, clique em executar o ensaio e insira o cartucho do sensor, submerso na solução calibradora na placa do utilitário para calibração. Este processo leva cerca de 25 minutos e cada biossensor é calibrado independentemente, com base na saída do sensor medida na solução calibrante de pH e concentração de oxigênio conhecidos. Após a conclusão da calibração, remova a placa de utilidade e insira a placa de cultura celular.

Após a medição inicial, o instrumento injeta automaticamente a solução do fármaco Port A em cada poço, que segue três ciclos de mistura e medição, três minutos cada. O mesmo padrão ocorre após cada injeção subsequente de droga nos outros portos. Quando a execução estiver concluída, remova a placa de cultura de células e o cartucho do sensor.

Para fins de controle de qualidade, certifique-se de que todas as portas de drogas e o cartucho do sensor tenham sido injetados, examinando as portas em busca de restos de drogas residuais. Em seguida, examine as células na microplaca de cultura celular sob o microscópio para garantir a monocamada confluente de células. Em seguida, descarte o meio de ensaio e substitua-o por 60 microlitros de um tampão de lise x em cada poço.

Embrulhe as bordas da placa em parafilme para evitar a evaporação e coloque-a em um freezer de 80 graus Celsius negativos para ajudar na lise celular durante a noite antes da quantificação do conteúdo de proteína, usando o ensaio BCA. Por análise de dados, normalize todos os dados dividindo a taxa de consumo de oxigênio ou OCR e taxa de acidificação extracelular ou valores de ECAR pelos microgramas de proteína em cada poço. Em seguida, exporte o gerador de relatórios de teste de estresse Mito, que utiliza macros do Excel para calcular automaticamente os parâmetros do teste de estresse Mito usando o software de análise de dados.

Seguindo os mesmos passos demonstrados para o teste de esforço de Mito, o teste de estresse glicolítico pode ser realizado, exceto para os suplementos de meios de ensaio e injeções de drogas que são diferentes, como mostrado na tabela um e na tabela dois. O instrumento mede simultaneamente OCR e ECAR para cada corrida. Para o teste de esforço de Mito, os cálculos de perímetro são baseados em leituras de OCAR, enquanto para o teste de estresse glicolítico, os cálculos de parâmetros são baseados em leituras de ECAR.

Aqui está uma curva de OCR gerada a partir da realização do teste de estresse Mito em células primárias de EPR humano. Os cálculos dos parâmetros do teste de estresse Mito são exibidos como gráficos de barras. Da mesma forma, esta é a curva ECAR, gerada a partir da realização do teste de estresse glicolítico em células primárias de EPR humano e os cálculos são mostrados como gráficos de barras.

Para otimizar a injeção do fármaco porta B para o teste de estresse de Mito, a eficácia de dois agentes desacopladores no aumento da OCR em células primárias de EPR humano foi comparada. A BAM15 mostrou-se superior à FCCP no aumento da capacidade respiratória mitocondrial, como visto pela respiração máxima significativamente maior e capacidade respiratória sobressalente com a FAB15, em comparação com a FCCP. É importante lembrar de hidratar o cartucho do sensor no dia anterior à execução do ensaio.

Essa técnica permite aos pesquisadores caracterizar melhor os perfis bioenergéticos das células de EPR e entender como as células de EPR exibem flexibilidade metabólica em resposta a diferentes estímulos patogênicos.