Ajustando os modos de contratilidade e deformação de conjuntos ativos baseados em actina in vitro: de redes ativas bidimensionais a gotas de cristal líquido

Esta pesquisa se concentra em materiais biológicos macios e visa explorar os mecanismos físicos subjacentes que regulam a forma e a organização e materiais inspirados em células biológicas.

Os sistemas modelo biológicos e in vitro são inerentemente complexos, com muitas armadilhas, e a preparação da amostra é fundamental para sua reprodutibilidade. Este protocolo foi projetado para melhorar a reprodutibilidade nesses sistemas.

Esses resultados abrem caminho para detectar, caracterizar mecanismos e entender a função das forças físicas e dos biomateriais. Isso pode ser generalizável para vários biopolímeros e organelas.

[Narrador] Para começar, prepare a amostra a ser carregada adicionando cinco microlitros de tampão 10XF em um tubo de microcentrífuga e adicione um volume de água destilada deionizada de modo que o volume final da amostra seja de 50 microlitros após a adição dos componentes restantes. Pipete um microlitro de beta-mercaptoetanol a 25%, um microlitro de 225 miligramas por mililitro de glicose, um microlitro de uma mistura de glicose oxidase e 85.000 unidades por mililitro de catalisador na solução. Em seguida, adicione um microlitro de ATP 25 milimolar e 10 microlitros de metilcelulose a 2%, 15 centipoise e misture bem por pipetagem. Para iniciar a polimerização da actina, misture actina não marcada com actina marcada e adicione a mistura de actina à solução tampão F preparada. Pipete a solução para cima e para baixo para garantir uma mistura adequada. Deixe a actina polimerizar à temperatura ambiente no tubo da microcentrífuga. Em seguida, para preparar uma célula de fluxo, coloque dois pedaços de fita dupla face paralelos um ao outro ao longo da largura da lâmina do microscópio para formar os limites do canal da célula de fluxo. Posicione a lamínula sobre o canal da fita, certificando-se de que esteja perpendicular à lâmina do microscópio. Pressione a área da lamínula que está em contato com a fita dupla-face para criar uma boa vedação e eliminar bolsas de ar. Usando uma lâmina de barbear, corte o excesso de fita da lâmina do microscópio e da lamínula de forma que a única fita visível fique dentro do canal de amostra. Para preparar uma câmara de amostra de cilindro para duas amostras de deplanador, primeiro enxágue a lamínula com etanol, água e etanol. Seque com ar filtrado. Aplique uma fina camada de epóxi de cinco minutos para aderir o cilindro de clonagem de vidro à lamínula. Adicione 3,5 microlitros de solução de surfactante de óleo a um tubo de microcentrífuga transparente ou de cor clara. Sem misturar, pipete cinco microlitros da solução de actina no topo da camada de surfactante de óleo. Feche o tubo. Segure a parte superior do tubo da microcentrífuga e sacuda a borda inferior para formar uma espuma inicial com emulsão visível e continue agitando até formar microemulsões uniformes. Antes de carregar a célula de fluxo, misture uma pequena quantidade de epóxi de cinco minutos. Para carregar uma célula de fluxo, pipete de um a três microlitros de solução de surfactante de óleo no canal de amostra da célula de fluxo para criar um pequeno tampão que molha o canal. Incline a célula de fluxo para remover qualquer espaço de ar que se forme devido ao recuo do menisco do surfactante de óleo antes de adicionar a amostra. Pipetar imediatamente a suspensão da emulsão da solução de amostra para a entrada da célula de fluxo para encher o canal. Sele cada lado do canal da célula de fluxo com epóxi de cinco minutos. Para carregar a câmara de amostra do cilindro para amostras sem emulsão, pipete cinco microlitros de solução de surfactante de óleo no fundo da câmara do cilindro de vidro. Incline e gire lentamente a lamínula para revestir a superfície e o cilindro inferior com a solução de surfactante. Remova o excesso de solução de surfactante de óleo usando uma pipeta para obter uma camada fina, evitando a evaporação completa do óleo. Adicione imediatamente a solução de amostra à câmara. Cubra a câmara com um pequeno pedaço de politetrafluoretileno, ou fita de PTFE, para evitar a evaporação e o fluxo. Monte a amostra no microscópio stage. Inicie a aquisição de imagens de lapso de tempo de actina usando uma objetiva de 20x, 40x, 60x ou 100x com imersão em óleo ou água para garantir uma abertura numérica suficientemente alta para imagens de alta resolução. Se polimerizar em uma câmara de amostra, deixe a polimerização por aproximadamente 30 minutos ou até que não haja alongamento ou movimento visível do filamento. Adicione um reticulador à amostra e, em seguida, adicione miosina como filamentos pré-polimerizados, pipetando lentamente aproximadamente metade do volume total na amostra. Por fim, inicie a imagem de lapso de tempo. A imagem de fluorescência confocal representativa da rede de actina emaranhada é mostrada aqui. A rede de actina emaranhada é uniformemente distribuída pela superfície. Os pontos brilhantes nesta imagem representam sobreposições de filamentos, enquanto as regiões escuras indicam presença mínima de actina. As flutuações térmicas levam a mudanças de intensidade local e flexão visível dos filamentos de actina. A adição de miosina II causa flexão e reorganização da rede de actina com acúmulo visível de pontos de miosina em longos tempos. A contração da rede depende da concentração de miosina e da concentração de ATP. Em redes de actina reticuladas, a contração induzida pela miosina leva a um movimento coordenado em escalas de comprimento mais longas em comparação com redes emaranhadas.