Name: Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a combinar microscopia de fluorescência com microfluidos para estudar a dinâmica de filamentos de actina individuais em tempo real. Este método permite controlar condições bioquímicas e mecânicas com precisão.

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Somos gratos ao B. Ladoux e R.-M. Laboratório Mège para o uso de seus equipamentos de limpeza UV, e J. Heuvingh e 0. du Roure para o treinamento inicial que recebemos na preparação de moldes em wafers de silício e fornecendo dicas sobre microfluidos. Reconhecemos o financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa Grant StG-679116 (para A.J.) e Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (para G.R.-L.).

<ol><li>Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li>
<li>Jégou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).</li>
<li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li>
<li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963(2019).</li>
<li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+phosphate+release+from+Arp2%2F3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li>
<li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li>
<li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li>
<li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li>
<li>Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883(2013).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li>
<li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li>
<li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li>
<li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li>
<li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsional+stress+generated+by+ADF%2Fcofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li>
<li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548(2021).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li>
<li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li>
<li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li>
<li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li>
<li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Le Clainche, C., Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+motility+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).</li>
<li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470(2016).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li>
<li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li>
<li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Comparado aos métodos padrão de filamento único, onde filamentos de actina são ancorados na superfície por vários pontos ao longo de seu comprimento ou mantidos perto dele por um agente de aglomeração como metilcelulose, os microfluidos oferecem uma série de vantagens. Como as interações com a superfície são mínimas, as pausas artificiais que essas interações podem induzir durante o alongamento e a despomerização são evitadas. Os filamentos são alinhados pelo fluxo, paralelos uns aos outros, facilitando seu monitoramento...

A montagem e desmontagem de filamentos de actin e redes de filamentos de actin são controladas por diversas reações bioquímicas e dependem do contexto mecânico. Para obter uma visão desses mecanismos complexos, é inestimável ser capaz de observar reações individuais em filamentos individuais (em números suficientemente grandes). Ao longo das últimas décadas, a observação de filamentos dinâmicos de actina em tempo real, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF), emergiu como uma técnica-chave e forneceu uma lista impressionante de resultados que não poderiam ter sido obtidos com ensaios bioquímicos de solução em massa1.
Para isso, é preciso manter filamentos de actina fluorescente rotulados perto da superfície do microscópio, ao mesmo tempo em que os expõe a soluções de proteínas de ligação de actina (ABPs), que também podem ser rotuladas fluorescentemente. Isso fornece um meio de monitorar eventos que ocorrem em filamentos individuais em condições bioquímicas bem controladas e, assim, quantificar as taxas de reação. No entanto, uma série de limitações específicas devem ser consideradas. Manter artificialmente filamentos próximos à superfície, muitas vezes graças a múltiplos pontos de ancoragem ou usando um agente de aglomeração como metilcelulose, pode alterar seu comportamento (por exemplo, causando pausas em sua polimerização e despomerização2). Rastrear o contorno de cada filamento pode ser desafiador, especialmente se novos filamentos ou fragmentos de filamento se acumularem no campo de visão ao longo do tempo. As reações ocorrem em um volume finito onde a concentração de monômeros e ABPs actina pode variar ao longo do tempo, potencialmente dificultando a derivação de constantes de taxa precisa. Por fim, renovar ou mudar a solução de ABPs é difícil de alcançar em menos de 30 anos e muitas vezes levará ao conteúdo proteico inhomogêneo na amostra.
Há pouco mais de 10 anos, inspirados pelo que já foi feito para estudar as cadeias individuais de ácido desoxiribonucleico (DNA)3, introduzimos uma nova técnica baseada em microfluidos para observar e manipular filamentos individuais de actin4. Permite contornar as limitações acima mencionadas das técnicas clássicas de filamento único. Nestes ensaios de microfluidos, os filamentos de actina são cultivados a partir de sementes de espectrin-actin adsorvidas no deslizamento de cobertura. Os filamentos são, portanto, ancorados por uma extremidade apenas na parte inferior da câmara microfluida e flutuam acima da superfície sem furar. Os filamentos se alinham com o fluxo de soluções de entrada, facilitando assim o monitoramento do comprimento do contorno e mantendo-os em uma região rasa acima do deslizamento de cobertura onde a TIRF pode ser usada. Diferentes soluções são simultaneamente fluídas para a câmara sem misturar, e os filamentos podem ser expostos a eles sequencialmente e rapidamente.
Aqui, propomos uma série de protocolos básicos para configurar ensaios de microfluidos de filamento único no laboratório. Tampas e câmaras de microfluidos podem ser preparadas com antecedência (em meio dia), e o experimento em si, onde várias condições bioquímicas podem ser testadas, é feito em menos de um dia.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Caseína</td><td>Merck</td><td>C6905</td><td>Usado a 8 mg/mL</td></tr><tr><td>Punção de biópsia (com êmbolo)</td><td>Ted Pella</td><td>15115-2</td><td>ID 0,75 mm, OD 1,07 mm</td></tr><tr><td>Biotina-BSA</td><td>Merck</td><td>A8549</td><td>Usado a 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A8022</td><td>Usado a 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Coverslip Mini-Rack Suporte de teflon</td><td>Invitrogen</td><td>C14784</td><td>para 8 lamínulas</td></tr><tr><td>Lamínulas 22x40mm Espessura #1.5</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>631-1370</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>D27802</td><td>componente em f-buffer</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-D</td><td>componente em f-buffer</td></tr><tr><td>Éster NHS Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td>Fluoróforo para marcação de actina em Lys328.</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina</td><td>Thermo Scientific</td><td>21338</td><td>Para biotinilato de actina em Lys328</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td>Detergente para limpeza de vidros</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N / A</td><td>software de código aberto</td></tr><tr><td>Laboport</td><td>KNF</td><td>811kn.18</td><td>bomba de vácuo (vácuo final: 240 mbar)</td></tr> <tr><td>Fita mágica invisível</td><td>Scotch</td><td>7100024666</td><td>fita de escritório transparente padrão</td></tr><tr><td>Micrewtube</td><td>Simport</td><td>T341-6T</td><td>2 mL tubos de reservatório microfluídico</td></tr><tr><td>Dispositivo microfluídico Parte 1: Unidade de fluxo S</td><td>Fluigente FLUIGENT</td><td>FLU-S-D-PCKB</td><td>Medidor de vazão</td></tr><tr><td>Dispositivo microfluídico Parte 2: Fluiwell-4C-2 mL</td><td>Fluigent</td><td>14002001PCK</td><td>Suporte de reservatório</td></tr><tr><td>Dispositivo microfluídico Parte 3: MFCS-EZ</td><td>Fluigent</td><td>EZ-11000001 EZ-00345001 Controlador de</td><td>pressão</td></tr><tr><td>modelo 42 - UVO-Cleaner</td><td>Jelight Inc.</td><td>42-220</td><td>Limpador ultravioleta</td></tr><tr><td>N6-(6-Aminohexil)-ATP-ATTO-488</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-805-488</td><td>ATP-ATTO usado para rotular a actina</td></tr><tr><td>neutravidina</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td>Use a 1 mg/mL em PBS.</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 Elastômero de Silício</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>Contém base PDMS e agente de cura</td></tr><tr><td>Tubulação de polieteretercetona (PEEK)</td><td>Merck</td><td>Z226661</td><td>" Azul" : I.D. = 0,25 mm</td></tr><tr><td>Pistola de sopro de segurança</td><td>Coilhose Pneumatics</td><td>700-S</td><td>ar filtrado</td></tr><tr><td>Tubo de silício</td><td>VWR</td><td>228-0701P</td><td>conecta PEEK ao acoplador</td></tr><tr><td>Acoplador de cateter em aço inoxidável</td><td>Prime Bioscience</td><td>SC22/15</td><td>Inserido nas entradas e saídas do PDMS para conectar ao tubo PEEK</td></tr><tr><td>Filme termoplástico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PM996</td><td>"parafilme" padrão </td></tr><tr><td>Etanol ultrapuro</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Banho de limpeza ultrassónico</td><td>VWR</td><td>USC200TH</td><td>Para acomodar copos de 1 L</td></tr><tr><td>Exsicador a vácuo</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td>para desgaseificar o PDMS ou soluções</td></tr></tbody></table>

usando microfluidos e microscopia de fluorescência para estudar a dinâmica de montagem de filamentos e pacotes de actin Único

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

A fim de decifrar os complexos mecanismos moleculares que regulam a montagem e desmontagem de filamentos actin, é um grande trunfo monitorar reações individuais que vivem em condições bem controladas. Para isso, experimentos de filamento único ao vivo surgiram nos últimos 20 anos, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF) e forneceram uma série de resultados-chave. Em 2011, a fim de ampliar ainda mais as possibilidades desses experimentos e evitar artefatos problemáticos recorrentes, introduzimos microfluidos simples nesses ensaios. Este estudo detalha nosso protocolo básico, onde filamentos de actina individuais são ancorados por uma extremidade à superfície passivated de deslizamento de cobertura, alinhados com o fluxo, e podem ser sucessivamente expostos a diferentes soluções proteicas. Também apresentamos os protocolos para aplicações específicas e explicamos como forças mecânicas controladas podem ser aplicadas, graças ao arrasto viscoso da solução de fluxo. Destacamos as ressalvas técnicas desses experimentos e apresentamos brevemente possíveis desenvolvimentos com base nessa técnica. Esses protocolos e explicações, juntamente com a disponibilidade atual de equipamentos de microfluidos fáceis de usar, devem permitir que não especialistas implementem este ensaio em seus laboratórios.

Para todos os experimentos descritos acima, filamentos de actina fluorescentemente rotulados devem ser claramente visíveis, com bom contraste, indicativo de baixa fluorescência de fundo da superfície (Figura 4, ver Arquivo Suplementar 1 para solução de problemas comuns). Os filamentos actinados também não devem ficar na superfície: quando a taxa de fluxo dominante é baixa, as flutuações laterais dos filamentos actina devem ser perceptíveis ao observá-las ao vivo e permitir q...

Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Combinamos microscopia de fluorescência com microfluidos para estudar como proteínas de ligação de actina regulam a montagem, e a desmontagem, de filamentos de actina. Com microfluidos, somos capazes de quantificar reações acontecendo em dezenas de filamentos de actina individuais simultaneamente, controlando precisamente as condições bioquímicas e mecânicas. Lembre-se que as soluções são injetadas primeiro em paralelo até chegarem à câmara e, em seguida, filamentos são expostos sequencialmente a cada solução alterando o ajuste de pressão.Para iniciar a preparação de polidimtilsiloxano, ou PDMS, montagem da câmara, pré-aqueça a placa quente a 100 graus Celsius. Exponha uma câmara PDMS limpa e uma tampa de vidro deslize em uma placa de Petri limpa à luz ultravioleta por três a cinco minutos em um limpador UV profundo. Quando terminar, posicione a câmara PDMS sobre o deslizamento da tampa de forma que as duas superfícies diretamente expostas à UV sejam colocadas em contato.Para remover bolhas de ar presas na interface de deslizamento de cobertura PDMS, pressione suavemente a superfície da câmara com um dedo. Pressione fortemente sobre cantos e laterais, garantindo que o teto da câmara não entre em contato com a superfície de vidro. Coloque a câmara com o fundo de vidro voltado para a placa quente a 100 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, use a câmara imediatamente, ou armazene-a em uma placa de Petri limpa por uma semana. Para enxaguar a entrada e a tubulação de saída, encha um tubo de reservatório de 2 mililitros com 300 microlitros de tampão F, enrosque-o no suporte microfluido e coloque a pressão em 300 milibares. Deixe de cinco a oito gotas de f-buffer ir para o lixo, em seguida, definir a pressão para zero e repetir o procedimento para cada canal.Em seguida, coloque a pressão para a tomada no tubo do reservatório de quatro a 50 milibar, uma vez que uma gota saia da ponta do tubo, conecte o tubo à saída da câmara PDMS. À medida que o líquido enche a câmara e sai de todas as entradas, coloque a pressão de saída em 20 milibais. Mais tarde, coloque a pressão do tubo do reservatório em 1 a 50 milibar.Para evitar a introdução de bolhas de ar, certifique-se de que uma gota saia da tubulação e da entrada do PDMS antes de conectar a tubulação à entrada. Coloque a pressão da entrada em 30 milibar. Depois de conectar as entradas dois e três como demonstrado, coloque a pressão de todas as entradas em 20 milibarbares, e a pressão de saída para zero milibar.Certifique-se de que as taxas de fluxo nas entradas são aproximadamente iguais. Ao mudar o reservatório, coloque todas as pressões de entrada em 12 milibar e pressione a saída para 5 milibais. Para injetar rapidamente uma solução, defina a pressão da entrada correspondente para 150 milibares, e ajuste a pressão nas outras entradas para cerca de 100 milibares, de modo que a taxa de fluxo resultante nas entradas seja de 500 nanoliters por minuto.Para mudar a solução, encha de 200 a 300 microlitres da solução em um novo tubo de reservatório e coloque a pressão na configuração da mudança. Em seguida, desaparafusar o tubo do reservatório da entrada. Uma vez que uma pequena gota tenha se formado na ponta do tubo, aparar o novo tubo com a solução fresca, mude a configuração de pressão para alto fluxo.Dependendo da configuração microfluidica e de uma geometria da câmara, aguarde de três a cinco minutos para que a solução preencha a tubulação e chegue à câmara. O processo pode ser seguido pela medição do aumento da fluorescência ao longo do tempo. Para a funcionalização superficial, altere a solução de três a 200 microlitres de 50 sementes de espectro-actina picomolar em F-buffer, e injete a solução por dois minutos com alto fluxo três.Para a passivação superficial, troque o tubo três com 300 microliters de 5%BSA em F-buffer, em seguida, injete por cinco minutos em alto fluxo três, seguido por cinco minutos no fluxo médio três, com pressão reduzida de sete a oito milibares nos canais um e dois para obter um contrafluxo de 100 nanoliters por minuto. Toda a superfície da câmara será passivada pela BSA. Troque o tubo de três para f-tampão para enxaguar o canal por cinco minutos em alto fluxo três.Mais tarde, troque os tubos de um a três com um micromolar actin profilin, 0,15 a actina micromolar e tampão F, respectivamente, conforme explicado no manuscrito, e injete soluções recém-preparadas usando o alto fluxo de todos os predefinidos por três a quatro minutos. Ligue o microscópio e ajuste o tempo de exposição da câmera para 100 a 200 milissegundos, laser de excitação a 10 a 20% de potência, e fluorescência de reflexo interno total, ou profundidade de TIRF, de 200 a 300 nanômetros para capturar as imagens com um objetivo de 60X. Em seguida, coloque a configuração de pressão para o fluxo médio por 10 minutos para registrar a polimerização do filamento à taxa de um quadro a cada 20 segundos, seguido pelo fluxo médio dois por 15 minutos para o envelhecimento do filamento.Capture a despolimerização no modo de epifluorescência em um quadro a cada cinco segundos, após um a dois quadros, mude para o fluxo médio três para registrar filamentos despolimerizando em torno de 10 subunidades por segundo. Para redefinir o experimento, quebre todos os filamentos rotulados fluorescente, expondo-os continuamente ao laser com potência máxima por dois minutos. Teste condições diferentes alterando as soluções um, dois ou três e injetando-as em alto fluxo por três a quatro minutos.O resultado do experimento básico de polimerização/despomerização é apresentado aqui. Os kymógrafos resultantes foram utilizados para quantificar as taxas de polimerização e despomerização. Quando os filamentos de actina cultivados foram expostos a uma solução de cofilina fluorescentemente rotulada, os clusters de cofilina foram nucleados e cresceram em direção às extremidades pontiagudas e farpadas.Quando filamentos únicos são expostos à fascina formam feixes que parecem mais brilhantes e não perfeitamente alinhados com o fluxo. É muito importante evitar a introdução de bolhas de ar no sistema ao trocar tubos e prestar atenção para não deixar os tubos de reservatório vazios. Esta técnica foi fundamental para aplicar forças de puxar sobre dezenas de filamentos únicos, olhar para a sensibilidade mecânica de formin e cofilin, e desbranching ARP2/3.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Apresentamos um protocolo para construir naves moleculares, onde motor proteínas cinesina aderida a superfície propelir microtúbulos tintura-rotulados. Interações fracas da kinesins com a superfície permite sua fixação reversível para isso. Isto cria um sistema de nanoescala que exibe dinâmica montagem e desmontagem de seus componentes, mantendo sua funcionalidade.

Montagem Molecular vaivéns alimentados por reversivelmente ligado Kinesins

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Este trabalho apresenta protocolos para engenharia e caracterização de redes compostas tridimensionais sintonizáveis de filamentos de actina co-emaranhados e microtúbulos. Os compósitos sofrem reestruturação ativa e movimento balístico, impulsionados pelos motores de miosina II e cinesina, e são sintonizados pelas concentrações relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes passivos.

Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

Aqui, apresentamos métodos para preparar conjuntos de actina emaranhados, reticulados e de cristal líquido quase bidimensionais (2D) a partir de proteínas purificadas.

Ajustando os modos de contratilidade e deformação de conjuntos ativos baseados em actina in vitro: de redes ativas bidimensionais a gotas de cristal líquido

Aprenda a combinar microscopia de fluorescência com microfluidos para estudar a dinâmica de filamentos de actina individuais em tempo real. Este método permite controlar condições bioquímicas e mecânicas com precisão.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

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