Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

Combinamos microscopia de fluorescência com microfluidos para estudar como proteínas de ligação de actina regulam a montagem, e a desmontagem, de filamentos de actina. Com microfluidos, somos capazes de quantificar reações acontecendo em dezenas de filamentos de actina individuais simultaneamente, controlando precisamente as condições bioquímicas e mecânicas. Lembre-se que as soluções são injetadas primeiro em paralelo até chegarem à câmara e, em seguida, filamentos são expostos sequencialmente a cada solução alterando o ajuste de pressão.

Para iniciar a preparação de polidimtilsiloxano, ou PDMS, montagem da câmara, pré-aqueça a placa quente a 100 graus Celsius. Exponha uma câmara PDMS limpa e uma tampa de vidro deslize em uma placa de Petri limpa à luz ultravioleta por três a cinco minutos em um limpador UV profundo. Quando terminar, posicione a câmara PDMS sobre o deslizamento da tampa de forma que as duas superfícies diretamente expostas à UV sejam colocadas em contato.

Para remover bolhas de ar presas na interface de deslizamento de cobertura PDMS, pressione suavemente a superfície da câmara com um dedo. Pressione fortemente sobre cantos e laterais, garantindo que o teto da câmara não entre em contato com a superfície de vidro. Coloque a câmara com o fundo de vidro voltado para a placa quente a 100 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, use a câmara imediatamente, ou armazene-a em uma placa de Petri limpa por uma semana. Para enxaguar a entrada e a tubulação de saída, encha um tubo de reservatório de 2 mililitros com 300 microlitros de tampão F, enrosque-o no suporte microfluido e coloque a pressão em 300 milibares. Deixe de cinco a oito gotas de f-buffer ir para o lixo, em seguida, definir a pressão para zero e repetir o procedimento para cada canal.

Em seguida, coloque a pressão para a tomada no tubo do reservatório de quatro a 50 milibar, uma vez que uma gota saia da ponta do tubo, conecte o tubo à saída da câmara PDMS. À medida que o líquido enche a câmara e sai de todas as entradas, coloque a pressão de saída em 20 milibais. Mais tarde, coloque a pressão do tubo do reservatório em 1 a 50 milibar.

Para evitar a introdução de bolhas de ar, certifique-se de que uma gota saia da tubulação e da entrada do PDMS antes de conectar a tubulação à entrada. Coloque a pressão da entrada em 30 milibar. Depois de conectar as entradas dois e três como demonstrado, coloque a pressão de todas as entradas em 20 milibarbares, e a pressão de saída para zero milibar.

Certifique-se de que as taxas de fluxo nas entradas são aproximadamente iguais. Ao mudar o reservatório, coloque todas as pressões de entrada em 12 milibar e pressione a saída para 5 milibais. Para injetar rapidamente uma solução, defina a pressão da entrada correspondente para 150 milibares, e ajuste a pressão nas outras entradas para cerca de 100 milibares, de modo que a taxa de fluxo resultante nas entradas seja de 500 nanoliters por minuto.

Para mudar a solução, encha de 200 a 300 microlitres da solução em um novo tubo de reservatório e coloque a pressão na configuração da mudança. Em seguida, desaparafusar o tubo do reservatório da entrada. Uma vez que uma pequena gota tenha se formado na ponta do tubo, aparar o novo tubo com a solução fresca, mude a configuração de pressão para alto fluxo.

Dependendo da configuração microfluidica e de uma geometria da câmara, aguarde de três a cinco minutos para que a solução preencha a tubulação e chegue à câmara. O processo pode ser seguido pela medição do aumento da fluorescência ao longo do tempo. Para a funcionalização superficial, altere a solução de três a 200 microlitres de 50 sementes de espectro-actina picomolar em F-buffer, e injete a solução por dois minutos com alto fluxo três.

Para a passivação superficial, troque o tubo três com 300 microliters de 5%BSA em F-buffer, em seguida, injete por cinco minutos em alto fluxo três, seguido por cinco minutos no fluxo médio três, com pressão reduzida de sete a oito milibares nos canais um e dois para obter um contrafluxo de 100 nanoliters por minuto. Toda a superfície da câmara será passivada pela BSA. Troque o tubo de três para f-tampão para enxaguar o canal por cinco minutos em alto fluxo três.

Mais tarde, troque os tubos de um a três com um micromolar actin profilin, 0,15 a actina micromolar e tampão F, respectivamente, conforme explicado no manuscrito, e injete soluções recém-preparadas usando o alto fluxo de todos os predefinidos por três a quatro minutos. Ligue o microscópio e ajuste o tempo de exposição da câmera para 100 a 200 milissegundos, laser de excitação a 10 a 20% de potência, e fluorescência de reflexo interno total, ou profundidade de TIRF, de 200 a 300 nanômetros para capturar as imagens com um objetivo de 60X. Em seguida, coloque a configuração de pressão para o fluxo médio por 10 minutos para registrar a polimerização do filamento à taxa de um quadro a cada 20 segundos, seguido pelo fluxo médio dois por 15 minutos para o envelhecimento do filamento.

Capture a despolimerização no modo de epifluorescência em um quadro a cada cinco segundos, após um a dois quadros, mude para o fluxo médio três para registrar filamentos despolimerizando em torno de 10 subunidades por segundo. Para redefinir o experimento, quebre todos os filamentos rotulados fluorescente, expondo-os continuamente ao laser com potência máxima por dois minutos. Teste condições diferentes alterando as soluções um, dois ou três e injetando-as em alto fluxo por três a quatro minutos.

O resultado do experimento básico de polimerização/despomerização é apresentado aqui. Os kymógrafos resultantes foram utilizados para quantificar as taxas de polimerização e despomerização. Quando os filamentos de actina cultivados foram expostos a uma solução de cofilina fluorescentemente rotulada, os clusters de cofilina foram nucleados e cresceram em direção às extremidades pontiagudas e farpadas.

Quando filamentos únicos são expostos à fascina formam feixes que parecem mais brilhantes e não perfeitamente alinhados com o fluxo. É muito importante evitar a introdução de bolhas de ar no sistema ao trocar tubos e prestar atenção para não deixar os tubos de reservatório vazios. Esta técnica foi fundamental para aplicar forças de puxar sobre dezenas de filamentos únicos, olhar para a sensibilidade mecânica de formin e cofilin, e desbranching ARP2/3.