Projeto de Sistemas de Fermentação em Estado Sólido para Produção de Enzimas Extracelulares Hidrolíticas Poliméricas por Fungos Filamentosos

Projetamos sistemas versáteis de fermentação em estado sólido, bananas, produção de enzimas por fungos. Explorando como diferentes indutores, tipos de inóculo e sistemas rotativos melhoram a escalabilidade e o gel.

A ampliação dos sistemas rotativos de fermentação em estado sólido, mantendo condições homogêneas, transferência de oxigênio e rendimentos enzimáticos consistentes, continua sendo um desafio experimental importante.

Demonstramos que os sistemas rotativos de fermentação em estado sólido produzem quatro a seis vezes mais rendimentos do que a fermentação submersa, mostrando sua versatilidade e escalabilidade para várias enzimas.

Nosso protocolo integra mistura rotativa, diversos tipos de protocolo e variedade de indutores específicos, garantindo géis enzimáticos de alta qualidade, crescimento homogêneo e aplicabilidade em vários sistemas enzimáticos.

Vamos nos concentrar em aumentar o sistema de fermentação em estado sólido rotativo para explorar sua aplicação na produção de novas enzimas nos setores de alimentos, bioenergia e meio ambiente.

[Narrador] Para começar, lave o farelo de trigo três vezes com água destilada estéril para remover resíduos de matéria orgânica, detritos e poeira. Espalhe o farelo de trigo lavado em uma bandeja de alumínio e seque-o em um forno a 60 graus Celsius por 24 horas. Para preparar a suspensão de esporos, transfira um disco helicoidal de cinco milímetros de diâmetro saturado com micélio para uma placa helicoidal de dextrose de batata fresca. Incube a placa a 28 graus Celsius por cinco a sete dias ou até que o micélio sature o meio. Em seguida, adicione cinco mililitros de água destilada estéril ao prato e, usando uma alça estéril, retire os esporos da superfície. Agora, prepare uma diluição de um a 100 da suspensão de esporos, usando água destilada estéril. Adicione 10 microlitros da suspensão à câmara de Neubauer e conte os esporos usando um microscópio. Para cultura líquida, use uma pinça estéril para transferir um disco helicoidal saturado de micélio para uma placa helicoidal de dextrose de batata fresca. Incubar a placa a 28 graus Celsius até que o meio esteja totalmente saturado. Prepare 25 mililitros de caldo de batata dextrose em um frasco Erlenmeyer estéril de 125 mililitros e autoclave o frasco para esterilizar o meio. Em seguida, transfira um disco de cinco milímetros de micélio da placa de PDA saturada para o caldo estéril. Incubar o frasco num shaker a 125 RPM durante 24 a 48 horas, ajustando o tempo com base na estirpe do fungo. Colete dois mililitros do caldo cultivado para o preparo do inóculo e outros dois mililitros para determinação do peso seco. Para inoculação direta de discos de micélio, coloque o disco de trado saturado de micélio em uma placa de trado de dextrose de batata fresca e incube-o a 28 graus Celsius até que o meio esteja totalmente saturado. Prepare o tubo de substrato com cinco gramas de farelo de trigo, 0,5 gramas do indutor e 5,5 mililitros de água e autoclave o tubo a 15 libras por polegada quadrada por 15 minutos. Após o resfriamento, insira a sonda de eletrodo diretamente no reator em profundidades variadas para medir a umidade relativa, usando um higrômetro baseado em eletrodo. Inocular o substrato com um mililitro de suspensão de esporos, contendo 10 elevado a seis a 10 elevado a sete esporos por mililitro. Vortex os tubos na velocidade máxima por cinco minutos em ciclos de um minuto para evitar a aglomeração do substrato. Em seguida, coloque os tubos em um misturador rotativo com eixo horizontal. Incube o misturador rotativo em uma incubadora ajustada para a temperatura ideal de crescimento do microrganismo. Para extração enzimática, ressuspenda o substrato em 20 mililitros de tampão pré-resfriado após o período de fermentação desejado. Vortex os tubos em ciclos de um minuto na velocidade máxima, seguido de um minuto no gelo. Filtrar a suspensão com filtros de papel e pressionar para extrair mecanicamente o sobrenadante. Finalmente, centrifugue o sobrenadante a 3.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius para clarificar o líquido. Após seis dias de fermentação em estado sólido, o substrato apresentou colonização fúngica visível com uma rede micelial fibrosa cobrindo a superfície. A formação de glucosamina através da hidrólise da quitosana foi significativamente maior em Trichoderma harzianum sob fermentação em estado sólido, indicando que a atividade da quitinase neste caso foi muito maior do que na fermentação submersa. Da mesma forma, a atividade da amilase por aspergillus lentulus foi significativamente elevada na fermentação em estado sólido em comparação com a fermentação submersa.