Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar modelos preditivos para a expressão transitória de proteínas nas folhas das plantas. Isso é conseguido através da criação de um projeto experimental para identificar os parâmetros mais importantes para a expressão transitória e quantificar seu impacto no acúmulo de proteínas. Como segunda etapa, os genes são clonados e transferidos para agrobactérias, que são então injetadas nas folhas, resultando na expressão transitória de proteínas.

Em seguida, amostras de folhas são analisadas para determinar os níveis de expressão de proteínas. São obtidos resultados que mostram o padrão de níveis de expressão de proteínas transitórias em folhas de diferentes idades e para diferentes condições de incubação com base em um planejamento de avaliação do modelo de experimento. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como um fator de cada vez, é que as interações entre diferentes parâmetros, como idade da folha ou folha posicional, podem ser detectadas e quantificadas.

A abordagem de um fator de cada vez, que é frequentemente usada para caracterizar o efeito de certos fatores no resultado de um experimento, é abaixo do ideal porque as corridas individuais durante um experimento serão alinhadas como pérolas em uma corda, alcançando assim uma baixa cobertura do espaço de design. Em contraste com o desenho de experimentos da estratégia DOE, a variação de mais de um fator por vez aumenta a cobertura e, portanto, a precisão dos modelos resultantes. Além disso, a cobertura tendenciosa do espaço de design em um fator de cada vez.

Os experimentos também podem falhar em identificar regiões operacionais ideais e prever soluções abaixo do ideal, enquanto as estratégias do DOE são mais propensas a identificar condições preferíveis. Este fluxograma ilustra o processo de planejamento de uma estratégia de DOE. O primeiro passo é identificar fatores e respostas relevantes para inclusão no projeto.

Nesta demonstração, os níveis de expressão de um modelo de anticorpo monoclonal anti-HIV dois G 12 e um marcador fluorescente, a proteína DS red serão medidos com base em experimentos anteriores. A diferença mínima detectável considerada relevante será de 10 microgramas por mililitro para dois G 12 e de 20 microgramas por mililitro para o vermelho DS. Além disso, os valores aproximados para o desvio-padrão estimado do sistema para dois G 12 e DS vermelhos serão de quatro e oito microgramas por mililitro, respectivamente.

As etapas restantes para planejar essa estratégia do DOE não serão discutidas aqui, mas os detalhes podem ser encontrados no manuscrito anexo. Dois vermelhos G 12 e DS serão expressos transitoriamente em plantas de tabaco. Para iniciar o procedimento de cultivo de plantas, prepare blocos de parede de rocha de 10 por 10 por oito centímetros, envolvendo-os extensivamente com água deionizada para remover produtos químicos residuais.

Depois disso, equilibre os blocos com uma solução recém-preparada de sementes de tabaco com fertilizante, colocando uma a duas sementes de tabaco em cada bloco de parede de rocha, seguido de uma pequena lavagem com fertilizante. Tenha cuidado para evitar lavar as sementes, germinar e cultivar as plantas de tabaco por 42 dias em uma estufa em condições adequadas. Prepare o AUM FASS cultivando uma cultura para um OD 600 nanômetros de 5.0.

Diluir a cultura com água e duas vezes o meio de infiltração para corresponder ao diâmetro externo de 600 nanômetros necessário para a injeção antes da injeção. Confirme o OD 600 nanômetros do atum da suspensão de fasion para preparar as folhas para a injeção. Coce suavemente a epiderme no local da injeção com uma ponta de pipeta para facilitar o influxo da solução de AUM Fasion.

Evite romper a lâmina da folha ao fazê-lo. Segure a seringa contendo a suspensão de fasão AUM perpendicular à lâmina da folha, tocando o cano contra o campo intercostal a ser tratado empurre suavemente a saída para o lado inferior da folha. Ao mesmo tempo, pressione a parte superior da folha suavemente para evitar que a lâmina da folha se desloque ou se rompa.

Empurre suavemente o pistão da seringa para baixo. A solução de moda AUM entrará nos espaços intercelulares dentro da lâmina foliar, conforme indicado pelas áreas tratadas que parecem mais escuras, verdes e úmidas. Certifique-se de que a seringa permanece perpendicular à folha durante a injeção.

Caso contrário, a suspensão bacteriana pode ser estimulada sob alta pressão. Repita este procedimento em várias posições até que todo o campo intercostal esteja infiltrado com aum, aum, fass. Em seguida, continue com o próximo campo intercostal após a injeção, incube as plantas nas condições determinadas pelo DOE quando o período de incubação estiver completo.

Comece a amostragem. Estabilize a folha com uma toalha de papel portátil e use um mutuário de cortiça para remover quatro a cinco discos de folhas dos campos intercostais tratados nas posições e tempos indicados pelo DOE. Não remova a folha inteira da planta durante a amostragem.

Determine a massa de cada amostra e coloque-a em um tubo de reação de plástico de 1,5 mililitro rotulado com o nome e a massa da amostra. Armazene as amostras a 20 graus Celsius negativos ou 80 graus Celsius negativos antes da quantificação da proteína. O processo pode ser pausado nesta fase por vários meses, dependendo da estabilidade da amostra e da temperatura de armazenamento para extrair proteínas das amostras de disco foliar.

Adicione três mililitros de tampão de extração por miligrama de massa de amostra e triture os discos de folhas no tubo de reação usando um pilão elétrico até que não haja fragmentos grandes. Para evitar o superaquecimento da amostra, coloque o tubo no gelo sempre que o tubo estiver quente após a centrifugação. Para remover os sólidos dispersos, transfira o sobrenadante para um tubo de reação limpo de 1,5 milímetro.

Meça a fluorescência vermelha DS duas vezes sequencialmente. Em um leitor de 96 bem jogado equipado com 530 filtros de excitação de 25 nanômetros e 590 filtros de emissão de 35 nanômetros para cada amostra. Calcular a média da fluorescência das duas leituras e dos três replicados técnicos e subtrair o valor registado para o controlo em branco contendo zero microgramas por mililitro de vermelho DS.

Subtraia também este valor das palhetas das diluições-padrão e utilize estes valores corrigidos em branco para uma regressão linear que produza uma curva de referência. A inclinação da curva de referência é então usada para converter a fluorescência medida para as amostras em concentrações de vermelho DS. O procedimento para determinar a concentração dos dois anticorpos G 12 não será mostrado aqui, mas é detalhado no manuscrito anexo.

O software Design Expert é usado para análise e avaliação de dados no nó de análise. Escolha a resposta a ser analisada e selecione inicialmente nenhuma na guia de transformação. Continue para a guia de resumo de ajuste, que fornece informações gerais sobre fatores importantes para o sistema sob investigação.

O software irá sugerir um modelo inicial com base em sua significância na guia do modelo. Um modelo inicial é pré-selecionado com base nos resultados do resumo do ajuste. Use o modo automatizado para editar esse modelo na guia Innova.

Investigue o modelo sugerido e os fatores incluídos, se necessário. Remova manualmente todos os fatores com valores de P acima de um limite predefinido ou aqueles que são improváveis com base na consideração mecanicista, voltando para a guia do modelo, alterando a seleção para manual e eliminando os fatores apropriados do modelo. Continue na guia de diagnóstico para confirmar a qualidade do modelo e detectar possíveis exceções no conjunto de dados que têm uma forte influência no modelo.

Ao examinar todas as guias na ferramenta de diagnóstico, ajuste o tipo de transformação na guia correspondente, se sugerido pela caixa Gráfico de Cox, e reinicie o procedimento de análise na guia de gráficos do modelo. Visualize o modelo avaliado para um número limitado de fatores numéricos, como três. A representação da superfície de resposta é útil para avaliar as características ótimas.

As superfícies de resposta manual ilustram apenas o impacto de dois fatores na resposta sob investigação. O efeito de qualquer fator adicional na resposta é revelado alterando seu valor ou nível na janela de ferramentas de fatores. Como alternativa, os fatores podem ser atribuídos ao eixo de plotagem clicando com o botão direito do mouse neles na janela de ferramentas de fatores e selecionando o eixo da variável independente desejada.

Manipule os níveis de fator e atribua-os às coordenadas do gráfico usando a ferramenta de fatores. Exporte gráficos usando o comando exportar gráfico para arquivo na guia arquivo. Use o subnó numérico no nó de otimização para otimizar a resposta desejada numericamente, dependendo dos fatores do modelo aos quais, por sua vez, certas restrições podem ser aplicadas por meio da guia de critérios.

Calcule e examine soluções numéricas na guia de soluções com base na entrada fornecida na guia de critérios. Exporte essas soluções para outro software, como uma planilha, para análise posterior, revelando as configurações de fator associadas a valores de resposta altos ou baixos. Isso é útil se mais de três fatores numéricos forem investigados e a representação 3D for difícil neste estudo representativo.

A estratégia DOE foi usada para examinar os efeitos de diferentes promotores e cinco RS primos na expressão transitória de ds. Os fatores vermelhos incluídos no modelo de expressão transitória e os intervalos investigados são mostrados nesta tabela. Os fatores em negrito são exclusivos deste experimento.

Os fatores em itálico são para outro experimento que será descrito mais tarde. Pelo menos três níveis foram selecionados para todos os fatores numéricos discretos para permitir o cálculo de um modelo base quadrático. Um algoritmo de seleção ótima foi escolhido para a seleção das execuções do DOE para obter as estimativas mais precisas para os coeficientes do modelo de regressão.

O projeto inicialmente sugerido pelo especialista em design consistia em 90 execuções, mas o FDS foi insuficiente para atingir um erro padrão de previsão de 1%. O aumento ideal do experimento para um total de 210 execuções resolveu esse problema e resultou em um FDS de 100% com precisão de previsão mais uniforme em todo o espaço de experimento indicado pela curva plana, as concentrações de vermelho DS foram determinadas para todas as 210 execuções e os dados foram transformados em log 10. Os fatores do modelo foram escolhidos por seleção reversa automatizada a partir de um modelo cúbico com um nível alfa de 0,100.

Isso resultou em um modelo significativo com falta de ajuste insignificante e altos valores para os coeficientes de correlação múltipla. O valor de P de todos os fatores do modelo foi inferior a 0,05 e, portanto, nenhuma manipulação manual adicional do modelo foi necessária. O modelo continha três interações fatoriais destacadas em negrito que não faziam parte da reavaliação inicial do modelo base quadrática do gráfico FDS.

O uso de todos os fatores incluídos no modelo de previsão final revelou que o FDS para o erro padrão de previsão não diminuiu significativamente ao incluir as interações adicionais de três fatores. As ferramentas de diagnóstico de qualidade do modelo no especialista em design indicaram que a transformação de dados foi útil e não houve fatores ausentes no modelo porque o gráfico normal de resíduos mostrou comportamento linear e nenhum padrão específico foi observado no gráfico de resíduos versus previsto. Também não houve tendência ao longo do experimento para indicar uma variável dependente do tempo oculta.

Em vez disso, as previsões do modelo estavam em muito boa concordância com a fluorescência vermelha Diaz observada, pois todos os pontos estão próximos à diagonal. Assumiu-se, portanto, que o modelo selecionado foi útil para prever a expressão transitória do vermelho DS em folhas de tabaco sem chumbo derivadas por diferentes combinações de UTR primos durante um período de incubação pós-infiltração com duração de oito dias, e o modelo de regressão linear artificial sem transformação de dados também foi selecionado para ilustrar as consequências da seleção e transformação incorreta de fatores. Como visto claramente aqui, o gráfico normal de resíduos se desvia do comportamento linear esperado e há um padrão em forma de V no gráfico de resíduos versus previsto, em vez de uma dispersão aleatória.

Além disso, o gráfico de resíduos versus execução destaca dois valores extremos. Embora as previsões tenham sido ruins para valores pequenos e altos que se desviam da diagonal, as superfícies de resposta ideais do modelo para a expressão transitória do vermelho DS em folhas de tabaco são mostradas aqui. O modelo previu que a idade da folha foi um fator significativo com níveis de expressão mais baixos nas folhas velhas, por exemplo, folha dois na parcela A e na parcela B em comparação com folhas jovens, como a folha seis na parcela C e na parcela D. A progressão do acúmulo de vermelho DS nas folhas não foi linear ou exponencial, mas seguiu uma curva sigmoidal durante os oito dias de incubação pós-infiltração.

As cinco combinações UTR primárias com o promotor CAMV 35 SS resultaram em uma expressão vermelha DS mais forte do que as combinações com o promotor NOS. Embora os cinco primos UTR também tenham tido um impacto significativo na expressão correta do DS, conforme mostrado pela comparação entre TL e CHS, a força da expressão foi dependente do promotor acompanhante. O modelo preditivo também indicou que certos pares de combinações UTR primárias do promotor, como nas CHS e CAMV 35 SS CHS, resultaram em níveis de expressão equilibrados diferindo em menos de 30% de uma proporção definida em todas as folhas e tempos de incubação superiores a dois dias.

Essa expressão equilibrada seria útil para a expressão de proteínas multiméricas com estequiometria definida. A abordagem DOE também foi utilizada para otimizar as condições de incubação e esquemas de colheita para a produção simultânea de dois vermelhos G 12 e DS em tabaco. Os fatores que afetam a expressão transitória que foram incluídos neste experimento estão em itálico de 600 nanômetros e tempo de incubação.

Um modelo preditivo foi estabelecido para a expressão de cada proteína em plantas em diferentes idades. As folhas novas foram colhidas aos 40 dias após a semeadura, as folhas velhas foram colhidas aos 47 dias após a semeadura. Esses quatro modelos foram então avaliados e um modelo de consenso estabelecido que incluiu cada fator considerado significativo nos modelos individuais.

Posteriormente, foi confirmado que o modelo de consenso ainda era uma boa representação de todos os conjuntos de dados iniciais. O modelo de consenso foi posteriormente usado para identificar temperaturas ideais de incubação e OD bacteriano de 600 nanômetros para ambas as proteínas para prever as concentrações de proteínas em todas as folhas e posições das folhas em plantas jovens e velhas. A integração dos perfis de concentração com os dados de biomassa resultou em rendimento absoluto de proteína.

As quantidades absolutas de proteína foram então correlacionadas com os custos associados a jusante, permitindo uma análise de custo-benefício para o processamento de cada folha por idade da planta. A mesma quantidade de vermelho DS e aproximadamente 65% de dois G 12 foi encontrada em plantas jovens em comparação com as velhas, apesar de uma biomassa média aproximadamente 50% menor, refletindo a maior expressão de proteína específica em plantas jovens. Isso revelou que as plantas jovens eram vantajosas para a expressão transitória porque as proteínas atingiram concentrações mais altas durante períodos de crescimento mais curtos, apesar da menor biomassa geral em comparação com as plantas velhas.

Por fim, também foi descoberto que processar todas as folhas de plantas antigas era mais caro do que descartar as folhas de um a três e aumentar o número de plantas por lote. Portanto, os modelos baseados em DOE são adequados não apenas para marcar a etapa final de um experimento, mas também para combinação com outros dados para facilitar aspectos mais complexos da análise do processo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar, conduzir e analisar um DOE para investigar a expressão transitória de proteínas em plantas.