Quantificação da captação de ácidos graxos endoteliais usando análogos de ácidos graxos fluorescentes

Nutrientes transmitidos pelo sangue, como os ácidos graxos, precisam atravessar uma barreira endotelial capilar para entrar no tecido metabólico por meio de mecanismos pouco compreendidos. Esclarecer esses processos pode revelar novos alvos terapêuticos para tratar doenças metabólicas, como o diabetes tipo 2. Assim, descobrimos que o músculo do bisturi e o tecido adiposo regulam a absorção e o transporte de lipídios endotelianos usando metabólitos paracrinos, parcialmente controlados também pelo sistema endócrino.

E também descobrimos que o ATP mitocondrial contribui inesperadamente para a absorção de gordura endotelial, apesar de sua dependência conhecida do ATP glicolítico. Usando o ensaio descrito neste protocolo, planejamos investigar mais profundamente os mecanismos moleculares subjacentes à absorção e transporte de ácidos graxos endoteliais, incluindo como eles podem ser regulados por outros tecidos. Para começar, prepare uma solução de gelatina a 0,1% adicionando 25 mililitros de estoque de gelatina a 2% a 475 mililitros de PBS.

Misture a solução de gelatina cuidadosamente e esterilize com filtro usando um filtro a vácuo de 0,2 micrômetro ou autoclave. Usando uma pipeta, adicione 100 microlitros da solução de gelatina a 0,1% em cada poço de uma placa preta transparente de 96 poços. Coloque o prato em uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos ou durante a noite.

Após a incubação, remova a solução extra de gelatina da placa pré-revestida de 96 poços. Lave o prato com PBS uma vez. Depois, pipetei 100 microlitros da suspensão celular em cada poço usando uma densidade de semeadura que permita que as células atinjam a confluência até o dia seguinte.

Prepare 20 soluções milimolares de 3-hidroxiisobutirato e lactato como controles positivos. Para o controle negativo, use um micromolar niclosamida. Depois, pipetee as soluções em uma placa separada de 96 poços.

Lave as células endoteliais uma vez com PBS divalente pré-aquecido, pipeteando em um ângulo acentuado para evitar perturbar as células em placa. Adicione 50 microlitros por poço do reagente de tratamento apropriado e incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos ou 60 minutos. Para preparar o complexo de ácidos graxos BSA do BOBPY, misture uma solução de ácido graxo BODIPY de 2 micromolares com 1 BSA livre de ácidos graxos micromolares em PBS.

Incube a mistura em temperatura ambiente, no escuro, por 10 minutos antes do uso. Em seguida, adicione 50 microlitros do complexo de ácidos graxos preparados BODIPY a cada um bem tratado e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos. Prepare uma solução de 1 micromolar de BSA livre de ácidos graxos em PBS como tampão de lavagem e pré-aqueça a 37 graus Celsius.

Remova o complexo de ácido graxo BODIPY BSA dos poços e lave toda a placa duas vezes com 50 microlitros do buffer de lavagem pré-aquecido, realizando cada lavagem por 1,5 minutos. Depois, adicione 50 microlitros de azul de tripano 0,08% em cada poço para apagar a fluorescência extracelular. Usando um leitor de microplacas, meça imediatamente a fluorescência intracelular.

Após remover a solução azul de tripan dos poços, lave suavemente as células com PBS. Adicione 4 microgramas por mililitro de corante Hoechst diluído em 10% de meio a cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Depois, lave a placa uma vez com PBS para remover o excesso de corante. Depois disso, adicione PBS novo a cada poço e meça a fluorescência Hoechst usando um leitor de microplacas. Tanto nas células HUVEC quanto nas células EA.hy926, o sinal intracelular de BODIPY-C12 aumentou significativamente com maiores concentrações de ácidos graxos BODIPY em um minuto, cinco minutos e dez minutos após a incubação.

O tratamento com lactato por uma hora aumentou a absorção de BODIPY-C12 de forma dependente da dose, em concentrações de 5 milimolares e 20 milimolares. O tratamento com 3-hidroxiisobutirato também aumentou significativamente a absorção de BODIPY-C12 de forma dependente da dose, com a maior captação observada em 20 milimolares. O tratamento com 1 micromolar niclosamida por 30 minutos levou a uma redução significativa na absorção de BODIPY-C12 em comparação com o controle não tratado por DMSO.

Após cinco minutos de incubação com BODIPY-C16 no HUVEC, o tratamento com lactato em 10 milimolares e 20 milimolares aumentou significativamente a absorção de forma dependente da dose. O tratamento com niclosamida micromolar reduziu significativamente a captação de BODIPY-C16 em comparação com o controle DMSO não tratado.