Modelo Multilaboratório da Rede de Avaliação Pré-clínica do AVC Tromboembolico com Trombólise: TE-MCAo

O escopo de nossa pesquisa é desenvolver um modelo de AVC tromboembólico com trombolise controlada para uso em rigorosos testes terapêuticos pré-clínicos multilaboratórios. Nosso protocolo aborda a ausência de um modelo simples e reprodutível de AVC tromboembólico que imite a trombolise clínica e apoie ensaios pré-clínicos multicêntricos. Para começar, encher um tubo de PE-50 cega cortando a extremidade em um ângulo chanfrado.

Corte a ponta do bisel com uma microtesoura. Após preparar o rato anestesiado para a cirurgia, faça uma incisão vertical na parte interna da coxa, com aproximadamente 1,5 a dois centímetros de comprimento ao longo da dobra natural da interseção inguinal com a perna. A incisão deve ser ortogonal ao curso anatômico esperado da artéria femoral.

Usando dissecação contundente, dissecar cuidadosamente até os vasos femorais. Depois, separe a artéria femoral da veia e do nervo que correm no mesmo feixe. Esqueletice a artéria femoral o mais próximo possível, traçando a artéria até sua origem retroperitoneal.

Coloque frouxamente um laço de seda 5-0 ao redor da artéria femoral e use as caudas para fornecer uma tensão suave na extremidade proximal da artéria. Em seguida, ocluir distalmente a artéria femoral com uma ligadura de seda 5-0 e usar as caudas da sutura para fornecer uma leve tensão distal com pinças hemostáticas. Cerca de dois terços da distância do laço do ponto proximal, coloque um pedaço de sutura de seda sob a artéria e faça uma pequena arteriotomia distal ao ponto solto usando microtesoura.

Usando pinças afiadas, levante a abertura superior da arteriotomia e introduza o cateter PE-50 com bisel rombado na abertura. Avance o cateter proximalmente o máximo possível, de modo que o laço solto, ao apertar, envolva o cateter. Aperte o ponto suavemente, garantindo que não obstrua o cateter nem fique sobre o bise.

Solte a grampa de borracha. O cateter deve imediatamente se encher de sangue. Encha três tubos centrífugos de 1,5 mililitro e armazene-os a quatro graus Celsius.

Após preencher os tubos, remova o cateter PE-50 da artéria femoral, ligue a extremidade proximal e feche a incisão com suturas 5-0 Prolene interrompidas. Para preparar o trombo, transfira 500 microlitros de sangue doador recém-coletado ou armazenado para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione um mililitro de cloreto de cálcio para reversão da anticoagulação. Depois, aspire imediatamente o sangue do tubo da microcentrífuga para um tubo PE-50 de 100 centímetros, usando sucção suave, e incube o tubo enrolado em PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius por duas horas em um forno de mesa.

Após expelir o trombo para uma placa de Petri contendo PBS, corte-o em seções de aproximadamente seis centímetros, usando uma lâmina de barbear. Puxe cada trombo suavemente para dentro de um cateter PE-50 e expeli-o completamente cinco vezes para lavá-lo. Lave o trombo novamente, puxando-o suavemente para dentro de um cateter PE-10 e expelindo-o completamente 15 vezes.

Adicione 200 microlitros de 4% de azul de Evans em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de PBS para criar a diluição número 1. Depois, pipeteie 400 microlitros de diluição número 1 em uma placa de Petri separada contendo 20 mililitros de PBS para criar a diluição número 2. Coloque o coágulo na solução mais concentrada da placa de Petri azul de Evans por um segundo, depois transfira para a placa de Petri azul de Evans diluída.

Coloque um trombo lavado em microcateteres pré-fabricados sem êblos de ar, usando o método úmido para úmido. Uma vez que o trombo esteja totalmente carregado, extruda trombo suficiente para que exatamente cinco centímetros permaneçam no microcateter. Corte o excesso com uma lâmina de barbear.

Marque o microcateter a 16 milímetros da ponta para demarcar a extensão do cateter que deve ser avançado intraluminalmente. Os tromboembolos pré-carregados foram injetados na artéria carótida interna de 135 participantes em seis laboratórios de pesquisa para testar a viabilidade do modelo de oclusão da artéria cerebral média tromboembolica. Imagens por ressonância magnética foram realizadas após três dias em 102 animais, indicando uma taxa de conclusão de varredura de 75%.

A perda de animais antes da exame de imagem foi consistente em todos os seis laboratórios. O volume médio de lesão em todos os locais foi de 13% do hemisfério ipsilateral, com alguma variação entre os seis laboratórios. Nosso protocolo imita trombose e trombose humanas, reduz o uso de animais, padroniza a cirurgia e alcança reprodutibilidade multicêntrica confiável.

Como resultado significativo da nossa pesquisa, criamos um modelo TE-MCAo escalável e reproduzível, utilizável em vários laboratórios com resultados consistentes e controle de qualidade estruturado. Esse modelo pode ser utilizado consistentemente tanto em estudos de AVC individuais quanto multilaboratoriais, melhorando a triagem terapêutica e acelerando a translação de tratamentos cerebrais candidatos protetores.