Name: elisa methods for detecting antigens
Uploaded: 2023-04-30T07:07:48.000Z
Duration: 14 min 22 s
Channel: JoVE

1. Косвенный ИФА
Непрямой ИФА – это метод, при котором первичное антиген-специфическое антитело распознается вторичным конъюгированным антителом. Приведенный ниже протокол является примером метода непрямого иммуноферментного анализа, в рамках которого образцы сыворотки мышей, инфицированных вирусом гриппа А (IAV), проверяются на наличие специфических антител IgG, специфичных для IAV. Одним из преимуществ этого примера является то, что можно использовать различные вторичные антитела, которые распознают все изотипы антител или конкретные изотипы (например, IgG). 
Покрытие антигена микропланшетом
<ol>
	<li>Покройте лунки 96-луночного планшета для ИФА очищенным антигеном путем пипетирования 50 мкл очищенного антигена (2 мг/мл очищенного вируса A/PR/8 гриппа А в 0,05М трис-HCl буфере (pH 9,5)) в каждую лунку планшета. </li>
	<li>Накройте планшет клейкой крышкой и инкубируйте его в течение ночи при температуре 4°C, чтобы антиген смог закрепиться на планшете. </li>
	<li>По завершении инкубации удалите раствор для покрытия, перебросив пластину над раковиной. </li>
</ol>
Блокировка
<ol start="4">
	<li>Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие сайты в лунках с покрытием, добавив 200 мкл блокирующего буфера, здесь используется 5% ослиная сыворотка в 1X PBS, на лунку. Альтернативные блокирующие реагенты включают 5% обезжиренного сухого молока или BSA в PBS или нормальную сыворотку от животного, у которого было получено вторичное антитело. </li>
	<li>Выдерживать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C. </li>
	<li>После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20. </li>
</ol>
Инкубация с первичным антителом
<ol start="7">
	<li>Приготовьте серийное разведение образца сыворотки, содержащего первичное антитело, для получения диапазона разведения от 1 до 204 800 с использованием 1X PBS. Для этого сначала разбавляют сыворотку 1:12,5, а затем проводят 4-кратное разведение (диапазон разведения - от 1:12,5 до 1:204,800). </li>
	<li>Добавьте в лунки 100 мкл серийно разведенных образцов сыворотки. </li>
	<li>Накройте пластину с клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1-2 часов. </li>
	<li>После инкубации перекиньте тарелку над раковиной и вымойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20. </li>
</ol>
Инкубация с вторичным антителом
<ol start="11">
	<li>Добавьте в каждую лунку по 100 мкл конъюгированного ферментом вторичного антитела, пероксидазы хрена, HRP-конъюгированного осла против мышей вторичного в этом эксперименте. </li>
	<li>Выдержите тарелку в течение 1 часа при комнатной температуре. </li>
	<li>После инкубации перекиньте тарелку над раковиной, а затем промойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20. </li>
</ol>
Обнаружение
<ol start="14">
	<li>Добавьте в каждую лунку по 100 мкл индикаторного субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ)) в концентрации 1 мг/мл. </li>
	<li>Инкубируйте тарелку с субстратом в течение 5-10 минут при комнатной температуре. </li>
	<li>Через 10 минут остановите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл 2N серной кислоты (H2SO4). 
	В течение 30 минут после добавления стоп-раствора считайте показания планшета с помощью микропланшетного ридера с длиной волны 405 нм, чтобы определить абсорбцию лунок. </li>
</ol>
2. Бутерброд ELISA
В этой версии ИФА экспериментальный образец «зажат» между неконъюгированным антителом захвата и конъюгированным антителом обнаружения, оба из которых специфичны к одному и тому же белку, но имеют разные эпитопы. В следующем примере с помощью сэндвич-ИФА концентрацию человеческого TNFα определяли в неизвестном образце с использованием стандартной кривой, полученной в результате 2,5-кратного серийного разведения известного стандартного рекомбинантного человеческого TNFα (при концентрации 75 пг/мл). 
Покрытие для захвата антител к микропланшету
<ol>
	<li>Покройте лунки 96-луночного планшета ИФА очищенным антителом захвата, добавив 100 мкл антитела захвата (диапазон 1-10 г/мл) в каждую лунку планшета. </li>
	<li>Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 4°C. </li>
	<li>После инкубации удалите раствор для покрытия с пластины, перебросив пластину над раковиной. </li>
</ol>
Блокировка
<ol start="4">
	<li>Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках, покрытых антителами, добавив в лунки 200 мкл блокирующего раствора, 5% обезжиренного сухого молока, содержащего PBS. </li>
	<li>Инкубировать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C. </li>
	<li>После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20. </li>
</ol>
Добавить антигенсодержащие тестовые образцы
<ol start="7">
	<li>Добавьте в лунки 100 мкл исследуемого образца. Запечатайте пластину клеевым чехлом. </li>
	<li>Выдерживать в течение 1-2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C. </li>
	<li>После инкубации извлеките образцы, перекинув планшет над раковиной, а затем промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20. </li>
</ol>
Добавить конъюгированное с ферментом антитело обнаружения
<ol start="10">
	<li>Добавьте в лунки 100 мкл конъюгированного с ферментом детектирующего антитела в предварительно оптимизированной концентрации. </li>
	<li>Закройте планшет клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 2 часов. </li>
	<li>Удалите несвязанное антитело обнаружения, перекинув планшет над раковиной, и промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20. </li>
</ol>
Обнаружение
<ol start="13">
	<li>Добавьте 100 мкл индикаторного субстрата в концентрации 1 мг/мл. Любое связанное антитело, конъюгированное с ферментом, преобразует субстрат в детектируемый сигнал. </li>
	<li>Выдержать тарелку в течение 5-10 минут при комнатной температуре. </li>
	<li>Через 5-10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N H2SO4. В течение 30 минут после добавления стоп-раствора прочитайте показания планшета с помощью считывателя микропланшетов, чтобы определить абсорбцию лунок. </li>
</ol>
3. Соревновательный ИФА
Этапы конкурентного ИФА отличаются от тех, которые используются при непрямом и сэндвич-ИФА, при этом основное различие заключается в стадии конкурентного связывания между образцом антигена и «дополнительным» антигеном. Образец антигена инкубируют с немеченым первичным антителом. Эти комплексы антитела-антиген затем добавляются к планшету ИФА, который был предварительно покрыт тем же антигеном. После инкубационного периода все несвязанные антитела смываются. Существует обратная корреляция между количеством свободного антитела, доступного для связывания антигена в лунке, и количеством антигена в исходном образце. Например, образец с большим количеством антигена будет иметь больше комплексов антиген-первичные антитела, оставляя мало несвязанного антитела для связывания с планшетом ИФА. Затем в лунки добавляют конъюгированное ферментом вторичное антитело, специфичное к первичному антителу, а затем субстрат. 
Покрытие антигена микропланшетом
<ol>
	<li>Покройте лунки 96-луночного планшета методом ИФА 100 мкл очищенного антигена в концентрации 1-10 мкг/мл. </li>
	<li>Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте пластину в течение ночи при 4°C. </li>
	<li>После инкубации удалите несвязанный раствор антигена из лунок, перекинув пластину над раковиной. </li>
</ol>
Блокировка
<ol start="4">
	<li>Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках с покрытием, добавив в каждую лунку 200 мкл блокирующего буфера, который может быть либо 5% обезжиренного сухого молока, либо BSA в PBS. </li>
	<li>Инкубировать планшет не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C. </li>
</ol>
Инкубационный образец (антиген) с первичным антителом
<ol start="6">
	<li>При блокировании лунок готовят смесь антиген-антитело, смешивая 150 мкл образца антигена и 150 мкл первичного антитела для каждой лунки в анализе. </li>
	<li>Выдерживайте эту смесь в течение 1 ч при 37°C. </li>
</ol>
Добавьте в лунку смесь антиген-антитело
<ol start="8">
	<li>Теперь снимите блокирующий буфер с лунок, перебросив пластину над раковиной. </li>
	<li>Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим Tween-20. </li>
	<li>Добавьте 100 мкл образца смеси антигена и первичного антитела. </li>
	<li>Инкубируйте планшет при температуре 37°C в течение 1 ч. </li>
	<li>Извлеките образец смеси, перебросив тарелку над раковиной. </li>
	<li>Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим 1% Tween-20, чтобы удалить все несвязанные антитела. </li>
</ol>
Добавьте вторичное антитело
<ol start="14">
	<li>Добавьте в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгированного вторичного антитела, которое в данном случае представляет собой AP-конъюгированное антитело. </li>
	<li>Инкубировать планшет в течение 1 ч при 37°C. </li>
	<li>После инкубации промойте планшет 1X PBS, содержащим 1% Tween-20. </li>
</ol>
Обнаружение
<ol start="17">
	<li>Добавьте по 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку. </li>
	<li>Подождите 5-10 минут. </li>
	<li>Через 10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N серной кислоты. Затем измерьте поглощение в считывателе микропланшетов в течение 30 минут после добавления стоп-раствора</li>
</ol>

Как показано, ряд иммунологических тестов (с небольшими вариациями в протоколах) относится к семейству методов ИФА. Определение того, какую версию ИФА следует использовать, зависит от ряда факторов, в том числе от того, какой антиген обнаруживается, моноклонального антитела, доступного для конкретного антигена, и желаемой чувствительности анализа (5). Некоторые сильные и слабые стороны различных ИФА, описанных в настоящем документе:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ЭЛИЗА</td>
			<td>Сильные стороны</td>
			<td>Слабые стороны</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Непрямой</td>
			<td>1) Высокая чувствительность за счет того, что множественные фермент-конъюгированные вторичные антитела могут связываться с первичным антителом</td>
			<td rowspan="3">1) Высокий фоновый сигнал может возникать из-за того, что покрытие антигена, представляющего интерес для планшета, не является специфичным (т.е. все белки в образце будут покрывать планшет)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Множество различных первичных антител могут быть распознаны одним конъюгированным ферментом вторичным антителом, что дает пользователю гибкость использования одного и того же конъюгированного ферментом вторичного антитела во многих различных ИФА (независимо от обнаруживаемого антигена)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3) Лучший выбор, когда доступно только одно антитело к интересующему антигену</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Бутерброд</td>
			<td>1) Использование антиген-специфического захвата и детекции моноклонального антитела повышает чувствительность и специфичность анализа (по сравнению с непрямым ИФА)</td>
			<td rowspan="2">1) Оптимизация концентраций моноклональных антител для захвата и обнаружения может быть затруднена (особенно для некоммерческих наборов)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Лучший выбор для обнаружения большого белка с несколькими эпитопами (например, цитокина)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Конкурентоспособный</td>
			<td>1) Можно использовать нечистые образцы</td>
			<td rowspan="3">1) Требуется большое количество высокочистого антигена для покрытия пластины</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Меньшая чувствительность к эффектам разбавления реагентов</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3) Идеально подходит для обнаружения малых молекул (таких как гаптен)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 3: Резюме. Краткое изложение сильных и слабых сторон различных методов ИФА.
Несмотря на то, что это простой и полезный метод, у любого ИФА есть и некоторые недостатки. Одним из них является неопределенность количества интересующего белка в тестовых образцах. Если величина слишком высока или слишком мала, значения поглощения, полученные считывателем микропланшетов, могут упасть выше или ниже границ стандартной кривой, соответственно. Это затруднит точное определение количества белка, присутствующего в исследуемых образцах. Если значения слишком высокие, испытуемый образец можно разбавить перед добавлением в лунки пластины. Затем окончательные значения необходимо будет скорректировать в соответствии с коэффициентом разрежения. Как уже упоминалось, самодельные наборы часто требуют тщательной оптимизации используемых концентраций антител для получения высокого соотношения сигнал/шум.

Анализы ИФА: косвенные, сэндвич и конкурентные

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Источник: Уитни Суонсон1,2, Фрэнсис В. Шостад2,3 и Томас С. Гриффит1,2,3,4 
1 Факультет урологии, Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота 55455 
2 Центр иммунологии, Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота 55455 
3 Аспирантура по микробиологии, иммунологии и биологии рака, Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота 55455 
4 Масонский онкологический центр, Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота 55455
Иммуноферментный анализ (ИФА) часто используется для измерения присутствия и/или концентрации антигена, антитела, пептида, белка, гормона или другой биомолекулы в биологическом образце. Он чрезвычайно чувствителен, способен обнаруживать низкие концентрации антигенов. Чувствительность ИФА объясняется его способностью обнаруживать взаимодействия между одним комплексом антиген-антитело (1). Кроме того, включение фермент-конъюгированного антиген-специфического антитела позволяет превращать бесцветный субстрат в хромогенный или флуоресцентный продукт, который может быть обнаружен и легко количественно определен с помощью планшетного ридера. При сравнении со значениями, полученными путем титрования количеств известного антигена, представляющего интерес, можно определить концентрацию того же антигена в экспериментальных образцах. Различные протоколы ИФА были адаптированы для измерения концентраций антигенов в различных экспериментальных образцах, но все они имеют одну и ту же основную концепцию (2). Выбор типа ИФА для выполнения, косвенного, сэндвичевого или конкурентного, зависит от ряда факторов, включая сложность тестируемых образцов и доступных для использования антиген-специфических антител. Непрямой ИФА часто используется для определения исхода иммунологического ответа, например, для измерения концентрации антитела в образце. Сэндвич-ИФА лучше всего подходит для анализа сложных образцов, таких как надосадочная жидкость тканевых культур или тканевые лизаты, где анализируемый или представляющий интерес антиген является частью смешанного образца. Наконец, конкурентный ИФА чаще всего используется, когда доступно только одно антитело для обнаружения интересующего антигена. Конкурентные ИФА также полезны для выявления небольшого антигена с только одним эпитопом антитела, который не может вместить два разных антитела из-за стерического препятствия. В протоколе будут описаны основные процедуры для непрямого, сэндвичного и конкурентного анализа ИФА. 
Непрямой ИФА-анализ обычно используется для измерения количества антител в сыворотке крови или в надосадочной жидкости гибридомной культуры. Общая процедура проведения непрямого ИФА-анализа следующая:
<ol>
	<li>Покройте лунки антигенами</li>
	<li>Добавить супернатант сыворотки или гибридомной культуры, содержащий антитела (первичные или антитела 1°)</li>
	<li>Инкубация и промывка</li>
	<li>Добавьте вторичное (или 2°) фермент-конъюгированное антитело</li>
	<li>Инкубация и промывка</li>
	<li>Добавить субстрат</li>
</ol>
Сэндвич-тест ИФА отличается от непрямого ИФА тем, что метод не предполагает покрытия планшетов очищенным антигеном. Вместо этого для покрытия лунок планшета используется антитело «захвата». Антиген «зажат» между антителом захвата и вторым «обнаруживающим» антителом, конъюгированным с ферментом, где оба антитела специфичны для одного и того же антигена, но в разных эпитопах (3). Связываясь с комплексом антитело захвата/антиген, антитело обнаружения остается в планшете. В качестве антител для захвата и обнаружения можно использовать либо моноклональные антитела, либо поликлональные антисыворотки. Основное преимущество сэндвич-ИФА заключается в том, что образец не нужно очищать перед анализом. Более того, анализ может быть достаточно чувствительным (4). Многие коммерчески доступные наборы ИФА относятся к разновидности сэндвичей и используют проверенные, подобранные пары антител. Общая процедура проведения сэндвич-теста ИФА следующая:
<ol>
	<li>Лунки для покрытия с антителом захвата</li>
	<li>Добавить тестовые образцы, содержащие антиген</li>
	<li>Инкубация и промывка</li>
	<li>Добавьте конъюгированное с ферментом антитело для обнаружения. </li>
	<li>Инкубация и промывка</li>
	<li>Добавить субстрат</li>
</ol>
Большинство коммерчески доступных наборов для сэндвич-ИФА поставляются с антителами, конъюгированными с ферментами. В случаях, когда конъюгированное с ферментом антитело для обнаружения недоступно, можно использовать вторичное антитело, конъюгированное с ферментом, специфичное для обнаруженного антитела. Фермент на вторичном антителе выполняет ту же роль, которая заключается в преобразовании бесцветного субстрата в хромогенный или флуоресцентный продукт. Вышеупомянутое вторичное фермент-конъюгированное антитело больше хотелось бы использовать в «домашнем» бутерброде ИФА, разработанном, например, исследователем, который сгенерировал свои собственные моноклональные антитела. Одним из недостатков использования вторичного антитела, конъюгированного ферментом, является уверенность в том, что оно связывается только с антителом обнаружения, а не с антителом захвата, связанным с планшетом. Это приведет к получению измеримого продукта во всех лунках, независимо от наличия или отсутствия антигена или антител для обнаружения. 
Наконец, для обнаружения растворимых антигенов используется конкурентный анализ ИФА. Он прост в исполнении, но подходит только тогда, когда очищенный антиген доступен в относительно большом количестве. Общая процедура проведения конкурентного анализа методом ИФА следующая:
<ol>
	<li>Покройте лунки антигеном</li>
	<li>Инкубация и промывка</li>
	<li>Прединкубированный тестовый образец с конъюгированными с ферментом первичными антителами</li>
	<li>Добавьте смесь в колодец</li>
	<li>Инкубируйте и смойте все несвязанные первичные антитела, конъюгированные ферментом</li>
	<li>Добавить субстрат</li>
</ol>
«Конкуренция» в этом анализе заключается в том, что большее количество антигена в исследуемом образце, используемом на этапе 3, приведет к меньшему количеству антител, доступных для связывания с антигеном, покрывающим лунку. Таким образом, интенсивность хромогенного/флуорогенного продукта в лунке в конце анализа обратно пропорциональна количеству антигена, присутствующего в исследуемом образце. 
Ключевым компонентом любого типа ИФА являются титруемые стандарты известных концентраций, которые позволят пользователю определить концентрацию антигена, присутствующего в исследуемых образцах. Как правило, ряд лунок предназначен для создания стандартной кривой, где известные количества очищенного рекомбинантного белка добавляются в лунки в уменьшающихся количествах. Когда эти лунки обрабатываются одновременно с испытуемыми образцами, пользователь может затем получить эталонный набор значений поглощения, полученных с помощью считывателя микропланшетов для известных концентраций белка, в сочетании со значениями поглощения для тестовых образцов. Затем пользователь может рассчитать стандартную кривую, с которой можно сравнить тестовые образцы для определения количества присутствующего белка, представляющего интерес. Стандартная кривая также может определять степень точности разбавления пользователем. 
Наконец, последний шаг в каждом из перечисленных выше типов ИФА требует добавления субстрата. Степень превращения субстрата в продукт напрямую связана с количеством фермента, присутствующего в лунке. Пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза (АФ) являются наиболее распространенными ферментами, конъюгированными с антителами. Как и ожидалось, существует ряд субстратов, специфичных для фермента, которые производят хромогенный или флуоресцентный продукт. Кроме того, субстраты доступны в диапазоне чувствительности, которые могут повысить общую чувствительность анализа. Пользователь также должен принять во внимание тип прибора, доступного для считывания показаний планшета в конце эксперимента, при выборе типа используемого субстрата, а также соответствующего фермент-конъюгированного антитела. 
Обычно используемые хромогенные субстраты для HRP включают 2,2'-азинобис [3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту]-диаммониевую соль (ABTS) и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB), тогда как p-нитрофенилфосфат (PNPP) используется для AP. ABTS и TMB производят водорастворимые продукты реакции зеленого и синего цвета соответственно. Зеленый продукт ABTS имеет два основных пика поглощения, 410 и 650 нм, в то время как синий продукт TMB лучше всего обнаруживается на 370 и 652 нм. Цвета ABTS и TMB меняются на желтый при добавлении кислотного стоп-раствора, который лучше всего считывается при 450 нм. Развитие цвета для ABTS происходит медленно, в то время как для TMB оно происходит быстро. TMB более чувствителен, чем ABTS, и может давать более высокий фоновый сигнал, если ферментативная реакция протекает слишком долго. PNPP производит желтый водорастворимый продукт после преобразования AP, который поглощает свет с длиной волны 405 нм.

В следующем примере непрямого ИФА было определено присутствие специфичного для вируса гриппа А (IAV) IgG в сыворотке мышей, инфицированных IAV. Мышей C57Bl/6 инфицировали вирусом гриппа А (A/PR/8; 105 PFU в 100 мкл PBS i.p.), а сыворотка была собрана через 28 дней. Для количественного определения количества специфичного для IAV IgG в сыворотке крови 96-луночные ИФА-планшеты покрывали очищенным вирусом гриппа А A/PR/8 (50 мкл/лунка вируса PBS 2 мг/мл) в течение ночи при 4°C. Покрытые пластины блокировали на 1 час при комнатной температуре с 5% нормальной ослиной сыворотки в PBS. с последующей инкубацией с разбавленными образцами сыворотки от мышей, подвергшихся воздействию IAV, в течение ночи при температуре 4°C. Сыворотку первоначально разбавляли в соотношении 1:12,5, а затем разводили в соотношении 1:4 (диапазон разведения - от 1:12,5 до 1:204,800). После промывки планшеты инкубировали с конъюгированным с щелочной фосфатазой (АФ)-конъюгированным ослиным антимышиным IgG в течение 1 ч. Планшеты промывали, а затем добавляли п-нитрофенилфосфат (PNPP; 1 мг/мл, 100 мкл/лунку). Бесцветный раствор PNPP приобретает желтый цвет при наличии AP. Через 5-10 мин ферментативную реакцию останавливали добавлением 100 мкл/лунка 2N H2SO4. Пластина считывалась на микропланшетном ридере с длиной волны 405 нм. Полученные результаты представлены в таблице 1 и рисунке 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="всегда">
	<tbody>
		<tr>
			<td>образец</td>
			<td>Уэллс</td>
			<td>Наружный диаметр405</td>
			<td>значить</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:12.5</td>
			<td>А1</td>
			<td>2.163</td>
			<td rowspan="3">2.194</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>2.214</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>2.204</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:50</td>
			<td>А1</td>
			<td>1,712</td>
			<td rowspan="3">1.894</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>2.345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>1,624</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:200</td>
			<td>А1</td>
			<td>1,437</td>
			<td rowspan="3">1.541</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>1.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>1,456</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:800</td>
			<td>А1</td>
			<td>1,036</td>
			<td rowspan="3">0.957</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>0,912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>0,923</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:3200</td>
			<td>А1</td>
			<td>0.579</td>
			<td rowspan="3">0.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>0,431</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>0,429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:12800</td>
			<td>А1</td>
			<td>0,296</td>
			<td rowspan="3">0.281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>0,312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>0,236</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:51200</td>
			<td>А1</td>
			<td>0,308</td>
			<td rowspan="3">0.283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>0.299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>0,243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Сыворотка 1:204800</td>
			<td>А1</td>
			<td>0,315</td>
			<td rowspan="3">0.303</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В1</td>
			<td>0,298</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С1</td>
			<td>0,297</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 1: Данные косвенного анализа ИФА. Разведения сыворотки крови (от 1:12,5 до 1:204 800) инфицированных вирусом гриппа А мышей, содержащих специфичный для IAV IgG, значения оптической плотности (OD) (405 нм) и средние значения OD405.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10496/10496fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Диаграмма рассеяния среднего значения OD405 (+ S. D.) и сывороточных разведений (от 1:12,5 до 1:204 800) специфических для вируса гриппа А (IAV) IgG в сыворотке мышей, инфицированных IAV. Значения OD405 могут быть обратно пропорциональны разведениям сыворотки крови.
В следующем примере сэндвич-ИФА в указанные лунки 96-луночного планшета с плоским дном было добавлено разведение 1:2,5 рекомбинантных человеческих стандартов TNFα (начиная с концентрации 75 пг/мл). Эти стандарты привели к соответствующему изменению показателей поглощения в 2,5 раза.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="всегда">
	<tbody>
		<tr>
			<td>образец</td>
			<td>Концентрация (пг/мл)</td>
			<td>Уэллс</td>
			<td>Значения</td>
			<td>среднее значение</td>
			<td>Расчет концентрации назад</td>
			<td>средний</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Стандартный 1</td>
			<td rowspan="2">75</td>
			<td>А1</td>
			<td>1.187</td>
			<td rowspan="2">1.169</td>
			<td>Количество: 76.376</td>
			<td rowspan="2">75.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>А2</td>
			<td>1.152</td>
			<td>Количество: 73.644</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Стандартный 2</td>
			<td rowspan="2">30</td>
			<td>В1</td>
			<td>0,534</td>
			<td rowspan="2">0.52</td>
			<td>30.827</td> Телефон
			<td rowspan="2">29.962</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>В2</td>
			<td>0,506</td>
			<td>29.098</td> Кабель
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Стандартный 3</td>
			<td rowspan="2">12</td>
			<td>С1</td>
			<td>0,23</td>
			<td rowspan="2">0.217</td>
			<td>12.838</td>
			<td rowspan="2">12.105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>С2</td>
			<td>0,204</td>
			<td>11.372</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Стандартный 4</td>
			<td rowspan="2">4.8</td>
			<td>Д1</td>
			<td>0,09</td>
			<td rowspan="2">0.084</td>
			<td>5.055</td>
			<td rowspan="2">4.726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Д2</td>
			<td>0.078</td>
			<td>4.398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Стандартный 5</td>
			<td rowspan="2">1.92</td>
			<td>Е1</td>
			<td>0,033</td>
			<td rowspan="2">0.031</td>
			<td>1,941</td>
			<td rowspan="2">1.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Е2</td>
			<td>0,03</td>
			<td>1,778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Стандартный 6</td>
			<td rowspan="2">0.768</td>
			<td>Формула-1</td>
			<td>0,009</td>
			<td rowspan="2">0.011</td>
			<td>0.626</td>
			<td rowspan="2">0.764</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2</td>
			<td>0,014</td>
			<td>0,901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Стандартный 7</td>
			<td rowspan="2">0.307</td>
			<td>Г1</td>
			<td>0,002</td>
			<td rowspan="2">0.004</td>
			<td>0,238</td>
			<td rowspan="2">0.377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Г2</td>
			<td>0,007</td>
			<td>0,516</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 2: Данные стандартной кривой TNFα Sandwich ELISA. Разведение в соотношении 1:2,5 рекомбинантных стандартов человеческого TNFα (от 75 до 0,3 пг/мл), значений OD (450 нм), средних значений OD450, расчетов обратной концентрации и их средних значений.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10496/10496fig2.jpg"> 
Рисунок 2: Стандартная кривая для сэндвич-теста ИФА TNFα. Разведение рекомбинантных стандартов TNFα человека в соотношении 1:2,5 (от 75 до 0,3 пг/мл) было проанализировано с помощью сэндвич-ИФА. Значения наружного диаметра450 могут быть напрямую соотнесены со стандартными концентрациями разбавления. Количество белка TNFα в исследуемом образце определяли с помощью стандартной кривой, которая соответствует концентрации 38,72 пг/мл.
Как только стандартная кривая была сгенерирована, было определено количество белка TNFα в тестовом образце. В этом примере сэндвич-ИФА тестовые образцы дали показания OD450 0,636 и 0,681, что в среднем дает 0,6585. При нанесении этого значения OD450 на приведенную выше диаграмму это соответствует концентрации TNFα 38,72 пг/мл.

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
...

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Продвинутый курс биологии

Immunology

Иммунология

elisa methods for detecting antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure.

Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is often used to measure antibody levels in serum or in hybridoma culture supernatants. Sandwich ELISA works well for complex samples such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the antigen is mixed with many other molecules. Competitive ELISA is useful when only one antibody is available, or when a small antigen has only one epitope and cannot fit two antibodies because of steric hindrance.

The indirect ELISA starts by coating the wells with antigen. Then serum or hybridoma supernatant with the primary antibody is added, followed by incubation and washing. A secondary enzyme-conjugated antibody is added next, and after another wash, substrate is added. This format is commonly used to measure how much antibody is present in a sample.

The sandwich ELISA uses a capture antibody instead of a purified antigen on the plate. The antigen from the test sample binds between the capture antibody and a second detection antibody, so the antigen is “sandwiched” between them. Both antibodies must recognize the same antigen at different epitopes. This format is very sensitive and has the advantage that the sample usually does not need to be purified first. Many commercial ELISA kits use matched antibody pairs, and some assays use an enzyme-conjugated detection antibody while others use a secondary enzyme-conjugated antibody. In homemade assays, that secondary antibody must bind only the detection antibody and not the capture antibody, or false signal can appear in every well.

The competitive ELISA is used for soluble antigens and is simple to run, but it works best when purified antigen is available in a relatively large amount. In this assay, the wells are coated with antigen first. The test sample is preincubated with an enzyme-conjugated primary antibody and then added to the plate. If the sample contains more antigen, less antibody can bind to the antigen on the well, so the final color or fluorescent signal is lower. For that reason, the signal is inversely related to antigen amount in the test sample.

A standard curve is an important part of any ELISA. Wells with known concentrations of purified recombinant protein are run alongside the test samples, usually in decreasing amounts. The absorbance values from these standards give a reference that can be compared with the unknown samples to calculate protein concentration. The standard curve also helps show whether dilution steps were done accurately.

The final signal depends on the enzyme and substrate used. Horseradish peroxidase, or HRP, and alkaline phosphatase, or AP, are the most common enzymes attached to antibodies. Common HRP substrates include ABTS and TMB, while PNPP is used with AP. ABTS makes a water-soluble green product, and TMB makes a water-soluble blue product. After an acidic stop solution is added, both ABTS and TMB turn yellow and are often read at 450 nm. ABTS changes slowly, while TMB reacts faster and is more sensitive, although it can create more background if the reaction goes too long. PNPP produces a yellow water-soluble product that is read at 405 nm.

ELISA Methods for Detecting Antigens

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

Learn how indirect, sandwich, and competitive ELISA methods detect antigens and antibodies, and how enzymes, substrates, and standard curves reveal results.

ELISA Methods for Detecting Antigens

Description

Transcript