Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Материалы
Буферы
<ol>
	<li>Буфер для промывки: 1 x стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция или магния</li>
	<li>Фиксирующий буфер: 1% параформальдегида в PBS</li>
	<li>Буфер для проникновения: 0,1% Triton X-100 в PBS</li>
	<li>Блокирующий буфер: 1% бычьего сывороточного альбумина в PBS</li>
	<li>Среда для роста клеток: DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллин/стрептомицин и L-глутамин</li>
</ol>
Оборудование
<ol start="6">
	<li>Ламинарный колпак</li>
	<li>Увлажнённый инкубатор (37°C, 5%CO2)</li>
	<li>Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп; здесь лазер Nikon Eclipse Ti</li>
</ol>
Материалы и реактивы
<ol start="9">
	<li>Предметные стекла камерных клеточных культур</li>
	<li>Монтажный носитель с защитой от выцветания с DAPI (для окрашивания ядер)</li>
	<li>Защитное стекло микроскопа</li>
	<li>Деликатные салфетки для работы</li>
	<li>Пипетки и наконечники</li>
</ol>
Реагенты для анализа
<ol start="14">
	<li>В этом случае использовались адгезивные клетки (первичные клетки или клеточные линии), в которых использовались мышиные фибробласты, трансфицированные CD1d (LCD1).</li>
	<li>Первичные антитела для обнаружения клеточных мишеней; здесь были использованы крысиный антимышиный CD107a (LAMP-1) и мышиный антимышиный CD1d.</li>
	<li>Флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, специфичные к первичным изотипам антител; здесь использовали антикрысиный IgG, конъюгированный с Alexafluor 488, и антимышиный IgG, конъюгированный с Alexafluor 647.</li>
</ol>
2. Протокол
Подготовка к окрашиванию антителами
Засев ячеек
<ol>
	<li>Ресуспендируйте интересующие клетки в питательных средах.</li>
	<li>Затем засейте 500 мкл клеточной суспензии/на лунку в лунки 4-луночного камерного скольжения. (Здесь клетки LCD1 засеивали в соотношении 2,5x105 клеток/камеру в 500 мкл питательной среды. Плотность посева может варьироваться в зависимости от клеточной линии).</li>
	<li>Инкубируйте предметное стекло камеры в течение ночи в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C, чтобы клетки прилипли к стеклу.</li>
	<li>На следующий день отсадите среду из каждой лунки, а затем промойте клетки 1X 500 мкл PBS.</li>
</ol>
Фиксация
<ol start="5">
	<li>Чтобы зафиксировать клетки, добавьте в каждую лунку 500 μл 1% раствора параформальдегида и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.</li>
	<li>После инкубации соберите параформальдегид в соответствующий контейнер для опасных жидких отходов.</li>
	<li>Затем промойте ячейки 3 раза 500 мкл PBS, чтобы удалить остатки фиксатора.</li>
</ol>
Пермеабилизация
<ol start="8">
	<li>Пермеабилизируйте клетки путем инкубации с 500 мкл пермеабилизационного буфера/лунки в течение 15 минут при комнатной температуре.</li>
	<li>Затем кратковременно промойте клетки 3 раза 500 μл PBS.</li>
</ol>
Блокировка
<ol start="10">
	<li>Инкубируйте клетки в каждой лунке с блокирующим буфером объемом 500 мкл в течение 1 часа при 4°C, чтобы блокировать связывание неспецифических антител.</li>
</ol>
Инкубация первичных антител
<ol start="11">
	<li>Отсадите блокирующий буфер из затворных камер.</li>
	<li>Затем добавьте в клетки 500 мкл разбавленного раствора первичного антитела. (Здесь анти-CD107a (LAMP-1) разбавляли в соотношении 1:500, а анти-CD1d использовали в неразбавленном виде (моноклональное антитело 1H6 было любезно предоставлено доктором Рэнди Бруткевичем)).</li>
	<li>Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 4°C.</li>
</ol>
Примечание: Если вы исследуете более одной мишени, убедитесь, что первичные антитела имеют разные изотипы. Рекомендуемые концентрации антител варьируются у разных производителей и должны быть титрованы перед использованием.
Инкубация вторичных антител
<ol start="14">
	<li>Аспирируйте первичный раствор антитела из лунок.</li>
	<li>Промыть камеры колодца 4 раза 500 μл PBS.</li>
	<li>Затем добавьте по 500 мкл разбавленного раствора вторичного антитела в каждую лунку. (Здесь оба вторичных антитела - антимышиный IgG Alexafluor 647 и антикрысиный IgG Alexafluor 488 были разведены в соотношении 1:2000 в блокирующем буфере).</li>
	<li>Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч в темное время суток.</li>
	<li>После инкубации аспирируйте раствор вторичного антитела.</li>
	<li>Промойте камеры 4 раза 500 мкл PBS, чтобы удалить все несвязанные вторичные антитела.</li>
</ol>
Примечание: Рекомендуемые концентрации антител варьируются у разных производителей и должны быть титрованы перед использованием. При зондировании более чем одной мишени вторичные антитела должны быть конъюгированы с различными флуорофорами с уникальными спектрами возбуждения/излучения. Также следует учитывать возбуждение/излучение ядерного противокрасителя (т.е. DAPI) при выборе флуорофоров. На выбор флуорофора может влиять конфигурация лазера используемого конфокального микроскопа. Конфигурация лазера машины будет определять, какие флуорофоры подходят для эксперимента.
3. Монтажные покровные стекла
<ol>
	<li>Для начала аккуратно снимите патронники с затвора.</li>
	<li>Затем держите предметное стекло под углом над деликатной рабочей жидкостью, протрите и удалите жидкость с краев, не касаясь ячеек.</li>
	<li>Добавьте по 1 капле антивыцветающего монтажного материала, содержащего ядерное пятно DAPI, на каждый участок элементов.</li>
	<li>Затем поместите покровное стекло размером 20 мм x 60 мм на предметное стекло, удерживая его за края кончиками пальцев. (Избегайте образования пузырьков над клетками, так как они мешают визуализации).</li>
	<li>Сотрите лишний монтажный материал по бокам деликатной рабочей салфеткой и храните слайды в темноте при комнатной температуре до недели.</li>
</ol>
4. Конфокальная визуализация
Изображение образцов на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Для данных, показанных на рисунке 2, Nikon Eclipse Ti A1R использовался с программным обеспечением NIS Elements Advanced Research. В следующем разделе подробно описана процедура съемки изображений с помощью вышеупомянутого программного обеспечения.
<ol>
	<li>Чтобы начать визуализацию клеток, откройте «Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research», нажав на «значок программного обеспечения NIS».</li>
	<li>Далее в окне управления нажмите на вкладку «TiPad» и выберите нужный объект для визуализации. (Здесь был использован первый объектив с 40-кратным увеличением).</li>
	<li>Загрузите слайд с ячейками на сцену и расположите его по центру под объективом.</li>
	<li>Теперь на вкладке «A1plus Compact GUI» настройте лазеры, подходящие для используемых флуорофоров. Нажмите на символ шестеренки, чтобы открыть меню настроек красителя и спектра, выберите необходимые каналы и установите лазер для каждого канала.</li>
	<li>Затем выберите соответствующие выбросы в выпадающем меню под первым дихроичным зеркалом.</li>
	<li>Затем в окне «A1plus Compact GUI» нажмите на «Ch. Series», чтобы настроить серию линейных каналов, которая определяет, будут ли используемые лазеры одновременно или последовательно воздействовать на образец. (Здесь были выбраны последовательные проходы, начиная с канала 1, затем канала 2, затем 4).</li>
	<li>После этого начните сканирование, нажав на значок «Наконечник стрелки» вверху. На этом этапе, пока изображение находится в реальном времени, в окне «A1plus Compact GUI» нажмите на скользящую шкалу и измените размер отверстия, чтобы обеспечить ограничение расфокусированного света. (Здесь использовалась самая низкая доступная настройка (0,5).</li>
	<li>Затем отрегулируйте настройки «высокого напряжения» и «смещения» для каждого лазера до соответствующих уровней, используя скользящие шкалы, чтобы обеспечить обнаружение конкретного окрашивания, ограничивая при этом любое потенциальное фоновое окрашивание. Если имеется образец с положительным окрашиванием, начните с визуализации этого образца для каждого канала, чтобы убедиться, что настройки лазера обеспечивают оптимальное соотношение сигнал/шум. 
	Внимание: высокая интенсивность лазера в течение длительного времени может вызвать фотообесцвечивание.</li>
	<li>После установки оптимальных значений высоковольтного напряжения и смещения для каждого лазера перейдите на вкладку «Захват нейтральных зарядов», а затем выберите значок «Z», чтобы настроить параметры для серии Z. Затем, получая изображение образца в реальном времени, сначала установите нижнюю часть, найдя нижнюю часть изображения и нажав кнопку «низ», затем найдите верхнюю позицию образца и нажмите кнопку «верх». Установите размер шага, введя предпочтительный размер шага в μm для каждого шага или указав, сколько всего шагов необходимо.</li>
	<li>После настройки параметров z-серии выберите желаемый размер/разрешение изображения в пикселях. Для этого нажмите на окно «A1plus Compact GUI» и под значком «размер» выберите желаемое разрешение. Чтобы уменьшить шум изображения, можно выбрать выпадающее меню рядом с символом «ø», чтобы усреднить выбранное количество изображений.</li>
	<li>Теперь нажмите на вкладку «Выполнить» в меню «Захват ND», чтобы начать визуализацию образца.</li>
	<li>После того, как создание образа будет завершено, сохраните изображение, нажав «Файл», затем «Сохранить как», после чего файл изображения будет экспортирован с расширением «.nd2». Наконец, повторите процесс для каждого из остальных образцов.</li>
</ol>

Конфокальное флуоресцентное окрашивание является относительно простой процедурой, которая позволяет получать изображения образцов чрезвычайно высокого качества, которые готовятся так же, как и для обычной флуоресцентной микроскопии. Короче говоря, образцы фиксируются, проникают, а затем блокируются. Первичные антитела против белка или белков, представляющих интерес, связываются, затем флуорофор-конъюгированные вторичные антитела используются для визуализации окрашивания. Конфокальная флуоресцентная микроскопия находит пр...

Конфокальная флуоресцентная микроскопия: методика определения локализации белков в фибробластах мышей

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

В этом эксперименте мышиные фибробласты, экспрессирующие поверхностный гликопротеин ген CD1d, были зафиксированы, иммуноокрашены и визуализированы на конфокальном микроскопе. Репрезентативное изображение, полученное с использованием вышеуказанного протокола, показано на рисунке 4. На верхней панели A представлены одноканальные изображения, показывающие рисунок окрашивания каждой отдельной мишени. Эти изображения составляют одну секцию (срез) захваченного z-стека. На правой панели показано...

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Продвинутый курс биологии

Immunology

Иммунология

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

confocal-microscopy-for-protein-localization

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

Description

Transcript

Tags