Name: protein pull-down with antibodies and beads
Uploaded: 2023-04-30T07:08:42.000Z
Duration: 13 min 46 s
Channel: JoVE

1. Иммунопреципитация с использованием белка A/G плюс агарозные шарики
Препарат клеточного лизата
<ol>
	<li>Центрифугируйте 108 тимоцитов в микроцентрифуге при 13 000 об/мин в течение 3 минут и удалите надосадочную жидкость. 
	Примечание: Количество клеток будет варьироваться в зависимости от уровня экспрессии желаемого белка и выбранного типа клеток. </li>
	<li>Повторно суспендируйте клетки в буфере для лизиса RIPA объемом 500 мкл с PMSF. </li>
	<li>Разрушайте клетки с помощью нескольких быстрых импульсов с помощью вихря, а затем несколько раз аспирируйте лизат с помощью иглы 25 G, прикрепленной к шприцу. 
	Примечание: Избегайте создания пузырей. Используйте иглу большего размера, например иглу 21G, для больших типов клеток. </li>
	<li>Инкубируйте лизат клеток на льду в течение 10 мин.</li>
	<li>Центрифугируйте лизат при 13 000 об/мин в течение 15 мин при 4°C. </li>
	<li>Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку с маркировкой для микроцентрифуги. </li>
</ol>
Предварительное очистка
<ol start="7">
	<li>Добавьте в лизат 20 μL белка A/G PLUS агарозные гранулы и 1 μг антитела контроля изотипа (здесь используется антитело контроля изотипа IgG1 мыши). 
	Примечание: Выбор используемого антитела изотипа будет зависеть от используемого белок-специфического антитела на более позднем этапе опускания. </li>
	<li>Инкубировать смесь лизатов на вращателе центрифуги в холодильной камере (4°C) в течение 30 мин.</li>
	<li>Центрифугирование образца при 3200 об/мин в течение 30 с при 4°C. </li>
	<li>Переложите предварительно очищенную надосадочную жидкость в свежую пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл с маркировкой. Выбросьте гранулы. </li>
</ol>
Определение концентрации белка
<ol start="11">
	<li>Определите концентрацию белка в клеточном лизате, выполнив анализ Брэдфорда. </li>
	<li>Аликвот 1000 мкл реагента Брэдфорда в 7 микроцентрифужных пробирок. </li>
	<li>Добавьте следующее количество стандартного белка БСА (2 мг/мл) в 6 пробирок (Таблица 1). </li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Номер трубки</td>
			<td>Объем БСА (мкл) (2 мг/мл)</td>
			<td>Концентрация белка (μг/μл)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 1: Стандартные количества белка БСА
<ol start="14">
	<li>В пробирку 7th добавьте 1 мкл предварительно очищенного лизата. 
	Примечание: Чтобы убедиться, что концентрация образца находится в пределах диапазона обнаружения анализа, приготовьте и проанализируйте также разведение лизата 1:2 или 1:5. </li>
	<li>Поместите по 200 мкл из каждой из 7 пробирок в отдельные лунки 96-луночного планшета с плоским дном, повторяя каждый образец в трех экземплярах. </li>
	<li>Считывание пластины на считывателе пластин под углом волны 595 нм. </li>
	<li>Постройте стандартную кривую в excel и рассчитайте концентрацию белка в предварительно очищенном лизате. </li>
</ol>
Потянуть вниз
<ol start="18">
	<li>Пометьте две свежие микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл — одну как «контрольную», а другую как «тестовую», которая в данном примере является c-myc. </li>
	<li>Поместите в каждую из этих пробирок по 500 г предварительно очищенного лизата. 
	Примечание: Количество используемого здесь белка будет зависеть от количества белка, который необходимо очистить. </li>
	<li>Доведите общий объем каждой пробирки до 500 мкл с помощью буфера для лизиса. </li>
	<li>Добавьте 2 мкг антитела против c-myc в пробирку тестовой группы и 2 мкг мышиного контрольного антитела изотипа IgG1 в контрольную группу. 
	Примечание: Количество антител будет зависеть от эффективности антител и количества целевого белка. </li>
	<li>Инкубируйте пробирки на ротаторе в холодильной камере (4°C) в течение 2 ч. </li>
	<li>Добавьте 20 μL белка A/G плюс агарозные шарики в каждую пробирку. 
	Примечание: Рекомендуется использовать наконечники для пипеток с отрезанным концом, чтобы предотвратить повреждение шариков. </li>
	<li>Инкубировать на ротаторе в холодном помещении (4°C) в течение ночи. 
	Примечание: В зависимости от целевого белка и эффективности антитела, этот шаг может варьироваться от 1 часа до ночи. </li>
	<li>Центрифугируйте пробирки при 3200 об/мин в течение 30 с 4°C, чтобы вытянуть шарики вниз. </li>
	<li>Отсасывайте надосадочную жидкость из каждой трубки. 
	Примечание: Целевой белок теперь связан с бусинами. </li>
	<li>Промойте шарики два раза, используя 500 μL 1X Dulbecco's PBS. </li>
	<li>Центрифугирование пробирок при 3200 об/мин в течение 30 с 4°C. 
	Примечание: Для более строгой промывки, используйте более строгие буферы, такие как RIPA. </li>
	<li>Отсасывайте буфер из каждой трубки. С помощью гелевых наконечников удалите остатки буфера из гранул и держите шарики на льду, чтобы разбавить белок. 
	Примечание: В этом примере белок элюируется в буфер SDS-PAGE путем кипячения гранул для вестерн-блоттинга. Этот подход подходит для проверки результатов ИП или для изучения белок-белковых взаимодействий. Для других последующих применений, таких как очистка белков для структурного или ферментативного анализа, используются более сложные системы, такие как эпитопные метки (flag-tag или myc-tag), чтобы избежать элюирования антитела интересующим белком. </li>
</ol>
2. Проверка IP-адреса с помощью анализа вестерн-блота
Электрофорез SDS-PAGE:
<ol>
	<li>Повторно суспендируйте шарики в 20 мкл загрузочного красителя SDS-Page, содержащего β-меркапто-этонол. </li>
	<li>Кипятите образцы при температуре 95 °C в течение 5 минут</li>
	<li>Центрифугируйте шарики при 13 000 об/мин в течение 10 с при комнатной температуре. </li>
	<li>С помощью наконечников для загрузки геля тщательно пипетируйте полученные из бусин образцы и загрузите их в лунки с градиентом 4-15% геля SDS-PAGE. </li>
	<li>В дополнение к образцам загрузите дорожку с белковой лестницей, а также дорожку с предварительно очищенным лизатом, который будет служить в качестве контроля загрузки. </li>
	<li>Работайте при напряжении 100 В, пока передняя часть красителя не достигнет дна геля (~1 час). </li>
</ol>
Анализ вестерн-блота:
<ol start="7">
	<li>Сделайте сэндвич вестерн-блот, убедившись, что мембрана из ПВДФ находится между гелем и красным катодом. </li>
	<li>Передача в течение 1 часа при 100 В. </li>
	<li>Поместите мембрану в блокирующий буфер объемом 5 мл при комнатной температуре на 1 ч на коромысле при низкой температуре, чтобы блокировать неспецифические участки связывания белка. 
	Примечание: Объемы блокирующего буфера, первичного антитела, вторичного антитела и смывов могут потребоваться для блотов большего размера. </li>
	<li>Инкубируйте блот с 5 мл антител анти-c-myc в блокирующем буфере в течение ночи при 4°C на коромысле при низкой настройке. 
	Примечание: Антитело, используемое здесь, должно отличаться от того, которое используется на этапе pull-down. </li>
	<li>Промойте кляксу 3-6 раз, используя 5 мл TBST, каждое стирание 5 минут при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке. </li>
	<li>Инкубируйте блот с меченым HRP вторичным антителом против легкой цепи кролика в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке. 
	Примечание: Выбор вторичного антитела будет зависеть от первичного антитела, используемого для вестерн-блоттинга. Кроме того, в протоколе используется специфичная для легкой цепи вторичная структура, поскольку белок-мишень близок по молекулярной массе к тяжелой цепи антитела. Если целевой белок близок к 50 кДа, используйте легкую цепь, специфичную для вторичного белка. Если целевой белок близок к 25 кДа, используйте специфичный для тяжелой цепи вторичный . </li>
	<li>Промойте кляксу 3-6 раз, используя 5 мл TBST, каждое стирание 5 минут при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке. </li>
	<li>Удалите жидкость с кляксы и промокните край кляксы на лабораторных салфетках, чтобы удалить излишки жидкости. </li>
	<li>Покройте блоттинг 1x хемилюминесцентным реагентом для обнаружения и инкубируйте в течение 1 мин. 
	Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в быстрой последовательности, так как реагент для обнаружения чувствителен к свету и времени. </li>
	<li>Нанесите край кляксы на лабораторные салфетки, чтобы удалить излишки реагента для обнаружения. </li>
	<li>Поместите кляксу на поверхность лотка имидж-сканера. 
	Примечание: Хемилюминесцентные блоты также можно визуализировать с помощью пленки. </li>
	<li>Изображение с помощью 'Хемилюминесцентная программа' для захвата нескольких временных точек от 10 с до 5 минут. 
	Примечание: Оптимальное время может меняться в зависимости от количества белка и качества антител. </li>
	<li>Выберите изображение с оптимальной видимостью канала, а затем экспортируйте его. </li>
	<li>Перед перемещением кляксы сфотографируйте кляксу с помощью тепловизора, чтобы зафиксировать местоположение лестницы. Затем экспортируйте это изображение. </li>
	<li>С помощью программного обеспечения для подготовки слайдов (например, PowerPoint) выровняйте полосы и изображения лестницы, чтобы сформировать одно изображение. </li>
</ol>

Если коротко, то иммунопреципитация – это выделение определенного белка с помощью антитела. В этом примере результаты иммунопреципитации были проанализированы методом вестерн-блоттинга для оценки чистоты. Выделенный белок может быть использован в ряде применений, в том числе: ЯМР для определения структуры белка, масс-спектрометрия для определения аминокислотной последовательности или анализы in vitro для ферментативной характеристики. ВП также могут характеризовать взаимодействующих партнеров белков. Например, п...

Методики на основе иммунопреципитации: очистка эндогенных белков с помощью агарозных шариков

Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

Источник: Сюзанна К. Шисслер1, Тоня Дж. Уэбб1 
1 Факультет микробиологии и иммунологии, Университет Мэриленда, Балтимор, MD 21201
Иммунопреципитация (IP, также известная как анализ "pull-down") - это широко используемый метод, который имеет применение в различных областях. Впервые задуманный в 1984 году, он был усовершенствован в 1988 году (1, 2). Фундаментальной целью ВП является очистка и выделение определенного белка с помощью антитела против этого белка. Слово «иммуно» относится к использованию антитела, в то время как слово «преципитация» относится к извлечению определенного вещества из раствора. Целевой белок может быть эндогенным или рекомбинантным. Большинство рекомбинантных белков имеют эпитопную метку (т.е. myc или flag), прикрепленную к ним для упрощения последующей очистки. Как правило, легче оптимизировать IP-адрес рекомбинантного белка, потому что антитела против меток рекомбинантных эпитопов очень сильны и эффективны. Антитела против эндогенных белков имеют чрезвычайно изменчивую эффективность, что значительно затрудняет оптимизацию этих IP. Необходимым этапом после иммунопреципитации является проверка очистки. Выделенный белок разрешают с помощью SDS-PAGE и затем проверяют на чистоту с помощью вестерн-блоттинга (рис. 1). Важным контролем является использование другого антитела во время вестерн-блоттинга для проверки удаления правильного белка. Сочетание ИС с последующими методами является мощным инструментом анализа. Целью после очистки может быть характеристика самого белка с помощью ЯМР, масс-спектрометрии и анализов in vitro или анализ взаимодействующих партнеров белка (т.е. белка, ДНК, РНК) (3, 4, 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10502/10502fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Обзор процедуры иммунопреципитации. Иммунопреципитация – это выделение определенного белка с помощью антитела. После производства лизата из клеток происходит два основных этапа – предварительное очищение и вытягивание вниз. На стадии предварительного очищения клеточные лизаты предварительно очищаются от белков, которые связываются с антителами неспецифическим образом, с использованием антител контроля изотипа. На этапе понижения целевой белок оттягивается вниз с помощью белок-специфического антитела. Затем выделенный белок анализируют с помощью вестерн-блоттинга. Антитела изотипа и белковые специфические антитела имеют один и тот же константный домен, но разные антигенсвязывающие домены. Ключевым компонентом этого протокола являются агарозные шарики белка A/G, которые связывают постоянный домен антител, обеспечивая иммунопреципитацию целевого белка. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10502/10502fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Антитела являются ключевым компонентом иммунопреципитации, который отличает ее от других форм очистки белков (т.е. очистки колонки сродства никеля). Антитела — это молекулы, вырабатываемые В-клетками, которые могут распознавать определенные белковые эпитопы. Антитела имеют два домена: константу (Fc) и антигенсвязывание (Fab) (рис. 1). Константный домен определяет тип антитела и диктует его функцию in vivo. Обычно постоянными доменами антител, используемых для IP, являются IgG мыши, крысы или кролика. Антигенсвязывающая часть антитела распознает определенный эпитоп определенного белка. Антитела могут распознавать эпитопы на свернутых белках, которые могут отсутствовать при денатурации белка, и наоборот. Таким образом, доступность эпитопа зависит от сворачивания белка – что является важным фактором, который следует учитывать при выборе антител и условий для IP.
Обе прокариотические и эукариотические системы имеют антитело-связывающие белки. В эукариотических системах целью является иммунная защита от бактерий, в то время как в прокариотических системах целью является защита от иммунной системы. Антителосвязывающие белки влияют на методологию ИП двумя способами. Во-первых, существует необходимый этап предварительного очищения (рис. 1) для избавления лизата от белков, связывающих антитела, тем самым уменьшая неспецифическое связывание в конечном продукте. На этом этапе используется антитело изотипа, которое имеет тот же константный домен, что и ваш белок-специфический домен, но другой домен связывания антитела. Бактериальные белки, связывающие антитела, являются вторым ключевым компонентом этого метода. После того, как белок-специфическое антитело связывается с белком-мишенью, комплекс антитело: белок должен быть снижен (рис. 1). Белки A, G и L — это бактериальные белки, которые связываются с постоянным доменом антител. В то время как бактерии используют эту систему для подрыва иммунной системы, исследователи использовали эту систему для легкого очищения антител, и она используется как на этапе предварительного очищения, так и на этапе вытягивания. Эти белки имеют разное сродство связывания для разных видов и разных подтипов константных доменов — еще один фактор, который следует учитывать при выборе условий для IP. Многие компании продают шарики с маркировкой Protein A/G (Рисунок 1), готовые спин-колонки или смолы для изготовления колонок. Как правило, шарики и спин-колонки используются для небольших размеров образцов, в то время как смолы используются для объемной очистки.
В этом лабораторном упражнении мы демонстрируем, как очистить эндогенный белок c-myc из первичных тимоцитов мышей с помощью метода базовой иммунопреципитации на основе агарозных гранул Protein A/G Plus. Протокол начинается с приготовления клеточного лизата и заканчивается проверкой успешного извлечения белка с помощью вестерн-блоттинга.

Результаты процедуры, описанной выше, показаны на рисунке 2. Слева направо полосы содержат контрольную группу (изотип), тестовую группу (c-myc), предварительно очищенный лизат (лизат) и лестницу молекулярных масс (лестницу). Обозначены полосы лестницы 25 и 75 кДа. Две выступающие полосы на уровнях ~25 кДа и 50 кДа представляют собой легкую и тяжелую цепи связывающего антитела, соответственно, и не специфичны для IP или образцов. белок c-myc, который составляет около 67 кДа на вестерн-блот...

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation ...

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Продвинутый курс биологии

Immunology

Иммунология

protein pull-down with antibodies and beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term &quot;immuno&quot; refers to the antibody, and &quot;precipitation&quot; means pulling a substance out of solution.

The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies against endogenous proteins vary a lot in how well they work, so these assays can be harder to optimize.

After immunoprecipitation, the purified protein must be checked. The isolated sample is separated by SDS-PAGE and then tested by Western blot for purity. A different antibody is used in the Western blot to confirm that the correct protein was pulled down. This combined approach can also support later tests such as NMR, mass spectrometry, in vitro assays, or studies of protein, DNA, or RNA partners.

The procedure begins with lysate preparation and includes two major steps: pre-clearing and pull down. During pre-clearing, an isotype control antibody removes proteins that bind antibodies non-specifically. In the pull-down step, a protein-specific antibody binds the target protein, and the complex is collected with Protein A/G agarose beads. The isotype control antibody and the protein-specific antibody have the same constant domain, but different antigen-binding domains.

Antibodies are the key feature that set immunoprecipitation apart from other protein purification methods, such as nickel affinity column purification. They are made by B cells and recognize specific protein epitopes. Antibodies have a constant domain, or Fc region, and an antigen-binding domain, or Fab region. The constant domain is usually from mouse, rat, or rabbit IgG in IP experiments.

Antibody binding also depends on protein folding. Some epitopes are present on folded proteins, while others appear only when a protein is denatured. That is why antibody choice and assay conditions matter. Antibody-binding proteins from bacteria also help this method work, because Proteins A, G, and L bind the constant domain of antibodies. Researchers use this interaction during both pre-clearing and pull down, and they choose conditions based on species and constant-domain subtype binding.

Protein A/G can be attached to agarose beads, pre-made spin columns, or resins. Beads and spin columns are usually used for smaller sample sizes, while resins are used for bulk purification. In this protocol, c-myc is purified from primary murine thymocytes with Protein A/G Plus agarose beads, starting from cell lysate preparation and ending with Western blot verification of successful pull down.

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

protein-pull-down-with-antibodies-and-beads

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

Learn how immunoprecipitation uses antibodies, Protein A/G agarose beads, and Western blotting to isolate and verify a specific protein from cell lysate.

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Description

Transcript

Tags