Колоночная хроматография

Колоночная хроматография

Существует множество методов очистки и разделения соединений в лаборатории органической химии. Одним из наиболее надежных методов разделения для микромасштабного разделения, когда для анализа доступно менее 10 граммов соединения, является колоночная хроматография. Этот метод разделяет соединения в смеси на основе их физических свойств, таких как растворимость, полярность, гидрофобность, размер и заряд.

Основы хроматографии

Основными компонентами любой хроматографической системы являются стационарная фаза, подвижная фаза и анализируемая смесь образцов. В колоночной хроматографии неподвижная фаза обычно представляет собой микроразмерные шарики, которые равномерно упакованы в вертикальную колонку. Непрерывный поток подвижной фазы, также известной как растворитель, добавляется в верхнюю часть колонны, которая протекает через неподвижную фазу под действием силы тяжести или с контролируемой скоростью потока с помощью насоса.

Образец растворяют в небольшом количестве растворителя, а затем добавляют в верхнюю часть колонны. Добавляется больше растворителя, чтобы образец протекал через неподвижную фазу. Соединения в смеси разделяются между подвижной и стационарной фазами в зависимости от их различных свойств и образуют дискретные полосы.

Соединения с сильным взаимодействием со стационарной фазой будут двигаться медленнее, чем соединения со слабыми взаимодействиями со стационарной фазой. Таким образом, соединения со слабыми взаимодействиями будут выходить из колонки, или элюировать, раньше, чем соединения с сильными взаимодействиями. Интенсивность взаимодействия соединения со стационарной фазой определяется коэффициентом замедления (R_f), который представляет собой отношение расстояния, пройденного компонентом, к расстоянию, пройденному подвижной фазой. Фактор запаздывания определяется путем предварительного проведения тонкослойной хроматографии.

Высокое значение коэффициента замедления указывает на то, что образец сильно взаимодействует со стационарной фазой и долго элюируется. Низкое значение коэффициента запаздывания указывает на то, что образец не очень сильно взаимодействует со стационарной фазой и быстрее элюирует. Поскольку соединения разделяются на отдельные полосы и вымываются из колонки в разное время из-за их различных значений_Rf f, их можно выделить по отдельности, собирая растворитель из-под колонки по фракциям.

Рекомендации по колоночной хроматографии

Хроматографическая колонка представляет собой вертикально ориентированную стеклянную или пластиковую трубку. Размер колонки может варьироваться от нескольких сантиметров (например, у пастеровской пипетки) до нескольких метров (как в случае с промышленными колоннами). Диаметр колонны зависит от количества образца, который необходимо отделить, в то время как длина колонны зависит от сложности разделения. Наиболее эффективное разделение на дискретные полосы требует тонких слоев выборки; Поэтому определение подходящего диаметра является жизненно важным этапом. Загрузка слишком большого объема образца относительно диаметра колонки приведет к созданию более широких и менее определенных полос, чем тот же объем пробы в колонке большего диаметра.

При выборе длины столбца необходимо учитывать значения R_f компонентов. Компоненты с аналогичными коэффициентами запаздывания может быть сложно разделить, и для их разделения отдельных полос требуется более длинная колонка. Соединения с очень разными коэффициентами замедления могут не нуждаться в длинной колонке, так как они должны легко разделяться. При выборе стационарной фазы важно выбрать ту, которая приводит к различным коэффициентам замедления для каждого компонента.

Подготовка колонки является наиболее важной частью работы хроматографической колонки. Масса неподвижной фазы, упакованной в колонку, должна быть не менее чем в 20 раз больше массы образца. Если колонка не имеет пористого диска внизу, ее следует набить ватой и тонким слоем песка. Это предотвращает потерю неподвижной фазы через выход из колонны.

Существует два метода уплотнения колонны: метод сухой упаковки и метод навозной жижи. При сухом способе неподвижная фаза переносится в колонну в виде порошка. Затем колонку несколько раз промывают подвижной фазой/растворителем, чтобы убедиться, что растворитель проникает во все части силикагелевой колонки. Этот метод, если он выполнен неправильно, может увеличить вероятность образования сухих участков, каналов и пузырьков воздуха в колонке. Эти дефекты повлияют на способность колонны разделять компоненты смеси.

Метод навозной жижи обеспечивает более однородную насадочную колонну, которая не содержит пузырьков воздуха, сухих участков и каналов. Для этого метода неподвижная фаза смешивается с растворителем для образования однородной суспензии. Затем суспензия переносится в колонну, постукивая по бокам, чтобы избавиться от образовавшихся пузырьков воздуха. Запорный кран колонны, если таковой имеется, должен быть открыт во время этого этапа, чтобы позволить растворителю стечь.

Силикагелевая хроматография

Для разделения смеси соединений используется множество различных свойств, таких как размер, заряд и гидрофобность. Одним из свойств, используемых для разделения соединений в органической химии, является полярность. Для этого чаще всего используются силикагель и оксид алюминия в виде стационарных фаз. Силикагель чрезвычайно полярен и образует сильные диполь-дипольные взаимодействия с полярными соединениями. Кроме того, силикагель может образовывать водородные связи с анализируемым веществом благодаря наличию на его поверхности -ОН-групп.

Компоненты смеси, которые являются наиболее полярными, прочно связываются с силикагелем и медленно перемещаются по колонне, в то время как неполярные компоненты более растворимы в подвижной фазе и быстро перемещаются по колонне. Таким образом, важно, чтобы компоненты смеси имели разную полярность. Компоненты, которые сильно взаимодействуют со стационарной фазой, элюируются путем пропускания полярной подвижной фазы через колонку.

Ссылки

1. Shuler, M.L., Kargi, K., DeLisa, M. (2017). Биотехнологическая инженерия, основные понятия. Аппер Сэддл Ривер, Нью-Джерси: Прентис Холл.
2. Harris, D.C. (2015). Количественный химический анализ. Нью-Йорк, Нью-Йорк: W.H. Freeman and Company.

Колоночная хроматография — это метод, при котором насадочная колонка используется для разделения соединений на основе их взаимодействия со стационарной фазой, которая обычно имеет форму микроскопических шариков. Промежутки между бусинами заполняются растворителем. Открытие колонны позволяет растворителю протекать через неподвижную фазу. Когда смесь наносится на верхнюю часть насадочной колонны с последующим добавлением большего количества растворителя, смесь переходит в подвижную фазу и протекает через стационарную фазу.

Каждый компонент смеси по-разному взаимодействует со стационарной фазой. Некоторые компоненты имеют слабое взаимодействие со стационарной фазой и поэтому быстро перемещаются по колонне, в то время как другие имеют сильное взаимодействие со стационарной фазой и, таким образом, движутся медленнее. При этом различные соединения разделяются на полосы, которые собираются в мелкие фракции. Это позволяет очищать каждое соединение.

Итак, какие же свойства можно использовать для разделения смесей? Одним из наиболее часто используемых свойств является полярность. Для этого в качестве стационарной фазы часто используется силикагель, который является формой диоксида кремния. Силикагель взаимодействует с соединениями посредством диполь-дипольных взаимодействий и водородных связей через группы -ОН, которые образуются на его поверхности. Таким образом, полярные соединения будут сильно взаимодействовать со стационарной фазой, в то время как неполярные соединения будут взаимодействовать слабо.

Другие свойства, которые могут быть использованы для разделения, включают размер, заряд и гидрофобность. Распространенным способом загрузки стационарной фазы в колонну является загрузка неподвижной фазы в виде суспензии и растворителя. Затем неподвижная фаза упаковывается путем пропускания большего количества растворителя через колонну для уплотнения суспензии. Важно, чтобы неподвижная фаза была равномерно упакована без пузырьков воздуха, пустых каналов или сухих участков. Это может нарушить поток и привести к смешиванию полос.

При выборе колонки диаметр определяется исходя из объема разделяемой пробы. Проба должна покрывать верхнюю часть столбика тонким ровным слоем. Более толстый слой образца приводит к более широким полосам. Длина колонки зависит от того, насколько хорошо соединения разделяются на неподвижной фазе. Соединения с одинаковым сродством к стационарной фазе требуют длинной колонки для адекватного разделения. Однако смесь соединений с очень разным сродством к стационарной фазе может быть разделена на более короткой колонне.

В этой лаборатории вы изучите колоночную хроматографию, сначала упаковав и подготовив силикагелевую колонку. Затем вы будете использовать колонку для разделения цветных компонентов зеленым пищевым красителем.