Практический подход к генетического картирования Судьба индуцибельной: Путеводитель по Марку и Трек Клетки В Vivo</em

Краткое содержание

Генетические индуцибельной Судьба картирования (GIFM) знаки и треков клеток с тонкой пространственной и временной контроль В естественных условиях И выясняет, как клетки с определенной генетической линии вклад в разработку и тканях взрослого организма. Продемонстрированный здесь приемы, необходимые для судьбы карте E12.5 эмбрионов мыши для epifluorescent и эксплантов анализа.

Аннотация

Карты судеб клеток создаются путем маркировки и отслеживания клеток in vivo, чтобы определить, какой вклад вносят клетки-предшественники в формирование конкретных структур и типов клеток в развивающихся и взрослых тканях. Усовершенствованием этой концепции является генетически индуцируемое картирование судеб клеток (Genetic Inducible Fate Mapping, GIFM), которое связывает экспрессию генов, судьбу клеток и их поведение in vivo для создания карт судеб на основе генетических линий.

Метод GIFM использует линии X-CreER, где X представляет собой ген или набор регуляторных элементов гена, обеспечивающих пространственную экспрессию модифицированного белка бактериофага — Cre-рекомбиназы (CreER^T). CreER^T содержит модифицированный лиганд-связывающий домен эстрогенного рецептора, благодаря которому в отсутствие препарата тамоксифена CreER^T удерживается в цитоплазме. Связывание тамоксифена высвобождает CreER^T, который перемещается в ядро и опосредует рекомбинацию между последовательностями ДНК, фланкированными сайтами loxP. При GIFM рекомбинация обычно происходит между фланкированной сайтами loxP Stop-кассетой, предшествующей репортерному гену, такому как GFP.

Мышей разводят таким образом, чтобы они несли либо регион- или клеточно-специфичную CreER, либо условный аллель репортера. У необработанных мышей маркировка отсутствует, так как стоп-кассета в репортере препятствует дальнейшей транскрипции репортерного гена. Мы вводим тамоксифен путем перорального зондирования беременным самкам с определенным сроком беременности, что обеспечивает временной контроль высвобождения CreER^T и последующую транслокацию в ядро, в результате чего стоп-кассета удаляется из репортера. После рекомбинации аллель репортера экспрессируется конститутивно и наследуемо. Эта серия событий маркирует клетки таким образом, что их генетическая история записывается неизгладимо. Таким образом, рекомбинированный репортер служит высокоточным генетическим трейсером клеточных линий, который после активации больше не зависит от экспрессии гена, изначально использовавшегося для запуска CreER^T.

Мы применяем GIFM на мышах для изучения нормального развития и определения вклада генетических линий в формирование типов клеток и тканей взрослого организма. Мы также используем GIFM для отслеживания клеток на мутантных генетических фонах, чтобы лучше понять сложные фенотипы, которые имитируют основные признаки генетических заболеваний человека.

В данной видеостатье исследователям предлагается руководство по экспериментальным методам успешного применения GIFM. Мы демонстрируем этот метод на примере хорошо охарактеризованных мышей Wnt1-CreER^T;mGFP, которым вводили тамоксифен путем перорального зондирования на 8,5 эмбриональный день (E8.5) с последующим препарированием на E12.5 и анализом с помощью эпифлуоресцентной стереомикроскопии. Мы также показываем, как проводить микродиссекцию доменов с картированием судьбы клеток для подготовки эксплантатов или анализа методом FACS, а также как препарировать мозг взрослых животных с картированием судьбы клеток для флуоресцентной визуализации целого препарата. В совокупности эти процедуры позволяют исследователям решать критические вопросы в области биологии развития и моделей заболеваний.

Протокол

Тамоксифен Подготовка и устные зонд процедуры (E8.5)

• Подготовка 20 мг / мл исходного раствора тамоксифен, растворяя тамоксифен в подогретого кукурузное масло.
• Инкубируйте раствор при 37 ° С в течение 2 часов на nutator и вихревые периодически.
• Защита тамоксифен фондовом от света месте, хранить при 4 ° С, и использовать на срок до одного месяца.
• Для экспериментов судьба отображение, создание племенных пар, состоящих из швейцарских Вебстер женщины (дикого типа, приобретенных у Taconic) и мужчин и проведение конкретных генов Крир аллеля ^Т и репортер аллеля. Для демонстрационных целей, мы используем Wnt1-Крир ^Т; mGFP мужчин (Ellisor 2009).
• Проверьте швейцарские женщины Вебстер каждое утро в течение появление вагинальной пробки. Назначить утро (0900) в день вагинальных плагин считается 0,5 дней после полового акта и вычислить дату администрации тамоксифена на основе этой отправной точки. (Для этого эксперимента, эмбриональные день было использовано 8,5).
• Используйте 1 мл шприц с иглой для кормления животных (20G х 1-1/2) составить 200 мкл раствора тамоксифен акции (4 мг тамоксифена).
• Твердо сдерживать времени беременных женщин швейцарских Вебстер, держа задней части шеи и спины, чтобы обездвижить голову и перевернуть так брюшную сторону вверх.
• Держите хвост между свободными пальцы, чтобы держать тело в прямую линию.
• Место кормления иглу в углу рта и нежно руководство иглы по небу.
• Вращайте иглу так, чтобы она параллельно телу, одновременно наклоняя голову назад, чтобы держать шею прямо.
• Руководство иглу вниз по пищеводу, в сторону желудка. Будьте осторожны, чтобы не ввести в трахею. Если есть сопротивление на иглу, кляп животного занимается рефлекс, или, если мышь борьбы, немедленно удалить иглу и попробуйте зонд снова.
• После кормления игла находится в желудке, администрирования тамоксифен в желудок и возвращения женщины к ее дому клетке до даты вскрытия.

Краниотомия:

• Intracardially заливать взрослых судьба отображается мышь с 4% PFA и удалить голову с ножницами, сокращая через позвоночник чуть выше плеч.
• Выполнить скальпелем вдоль спинной средней линии головы (ростральной к хвосту), чтобы прорваться через кожу головы и подвергать черепа.
• Использование скальпеля, соскрести лишнюю ткань или мышцы вдоль боковой и задней черепной коробки.
• С щипцы, прокол черепа в средней линии просто ростральнее обонятельных луковиц и создать небольшое отверстие для размещения кончиками тонких ножниц.
• Вставьте тонкий ножницы в это отверстие и сделать разрез медиальнее боковые приблизительно на длину обонятельных луковиц. Этот отрезок сломается черепа на пересечении носовой кости и лобной кости и обеспечивают хороший доступ для ножницами.
• Разрезать вдоль сагиттального швов в черепе (спинной средней линии) и обязательно держать ножницы советы угловые от мозга во избежание повреждения основной ткани.
• Аккуратно понять черепа пинцетом и удаляйте кости вдоль медиальной разрез подвергать мозга. Череп может чип с небольшими кусочками или оторваться в больших разделах. Продолжайте использовать пинцет, чтобы удалить все лобной, теменной, межтеменной, и затылочной костей.
• Трещина кости упаковывая paraflocculi (расположенного вдоль боковых краев мозга на уровне мозжечка), зажимая сферической кости с каждой стороны. Осторожно потяните от костей.
• Включите голову вверх дном (спинной стороной вниз) и использовать щипцы разорвать черепных нервов и освободить мозг от черепа.

Всего микроскопии горе: Взрослый мозг

• Оценка взрослого мозга для GFP маркировки использованием флуоресцентных рассекает области.
• Передача мозга чашке Петри содержащие PBS и сфотографировать использованием PictureFrame или другого соответствующего программного обеспечения.

Всего микроскопии горе: E12.5 Эмбрионы

• Оценка целых зародышей крепление для GFP маркировки использованием флуоресцентных рассекает области.
• Передача те, которые являются положительными GFP целыми крепления к чашке Петри содержащие PBS и сфотографировать использованием PictureFrame или другого соответствующего программного обеспечения.
• Используйте пинцет, чтобы отщипывать кусочек хвоста от каждого эмбриона, поместить каждую часть в ПЦР-пробирку и генотип ткани с помощью ПЦР (Ellisor 2009) для обоих аллелей, чтобы подтвердить результаты, полученные через весь анализ монтирования.

Микро-вскрытие и подготовка эксплантатов брюшной средний мозг от E12.5 эмбрионов

• После вскрытия из матки цепи и идентификаторentification судьбы отображаемой эмбрионов целыми монтажа флуоресценции, трансфер эмбрионов ледяной стерильной PBS в блюдо культуре клеток.
• Использование тонких ножниц, удалить голову части эмбриона резка в поперечном направлении, каудально rhombomere 1.
• Затем удалите ростральной части головы короны прорезать промежуточного мозга. Это выставит ламповую структуру, в которой 4-го желудочка через мезенцефальных форму пузырька связующим звеном между спинной и брюшной ткани.
• Осторожно вставьте ножницеобразный наконечниками в 4-й желудочек, и надрез вдоль спинной средней линии, каудально ростральной, полностью открыть трубу, создание "открытой книги" подготовки. Вентрального среднего мозга теперь она подвергнется медиально, а два спинных половин мозга будет находиться сбоку.
• Удалите все оставшиеся без нервной ткани под вентрального среднего мозга для того, чтобы ткань лежала более решительно. В случае необходимости, сделать вырезы в ростральной и хвостовой аспекты, такие, что спинной «крыльях» эксплантов будет лежать, а также. Эксплантов должна выглядеть "бабочка, в котором спинной мозга представляет крылья, и rhombomere один хвост.
• Для еще большей изоляции вентрального среднего мозга для анализа FACS или экспериментов культуре клеток, удалите боковые (спинной стороны) ткани.

Представитель Результаты:

В этом GIFM эксперимент, Wnt1-экспрессирующие клетки постоянно и heritably отмеченные во время эмбриогенеза путем введения тамоксифена на E8.5 к Wnt1-CreERT; mGFP эмбрионов. Впоследствии эти клетки помечены визуализируются с помощью целого флуоресценции смонтировать и раздел иммуногистохимии чтобы определить, как Wnt1 клеток, полученных способствовать нервных структур по развитию. Всего горе флуоресценции зависит от мембраносвязанных GFP компонент репортер mGFP и, следовательно, обеспечивает сотовой информации, а также всеобъемлющие зрения Wnt1 полученных нейронных проекций. Например, с тамоксифеном управления на E8.5, Wnt1-CreERTmGFP эмбрионов на E12.5 выставку GFP флуоресценции в основном в средний мозг, задний задний мозг и спинной мозг (рис. 1А). При большом увеличении, тонкой нейронов прогнозы видел иннервирующих мозга, стенки тела, конечностей, а также черепно-лицевой области. На этой стадии развития эмбрион является прозрачным и внутренней маркировки GFP легко различить. Однако, как мозг развивается, плотность зрелые ткани скрывает GFP флуоресценции, исходящие из внутренних структур мозга. Таким образом, с тамоксифеном управления на E8.5, лишь незначительные маркировки GFP наблюдается в превосходной холмов среди взрослого целыми горе флуоресценции (рис. 1С, вставка). Кроме того, некоторые аксонального прогнозы видел бегущую вдоль брюшной поверхности заднего мозга (не показаны). Напротив, когда тамоксифен назначали в E9.5 значительные маркировки GFP происходит во всем уступает холмов (рис. 1В, вставка). Это увеличение в целом флуоресценции крепление может означать, что Wnt1-клеток, экспрессирующих на E9.5 способствовать более существенный вклад поверхностных областях спинного мозга или расширить несколько процессов в этом регионе, чем Wnt1 клеток, экспрессирующих от E8.5. В любом случае, эта разница в целом горе флуоресценции отражает динамическую природу Wnt1 выражения во время разработки и демонстрирует, как GIFM могут быть использованы следовать разные популяции клеток из эмбриона в зрелые взрослые.

С иммуногистохимии, судьба отображаются разделы ткани Wnt1-CreERT; mGFP животных анализируются на клеточном уровне. Антитела против GFP и β-галактозидазы (β-Gal) используются в сочетании с разнообразием тканей специфических биомаркеров для определения мелкого масштаба сотовой вклад Wnt1 происхождение от нервных структур и клеточных типов. С тамоксифена управления на E8.5 и тканей анализа на E12.5 дважды положительных клеток (GFP + и β-гал +) наблюдаются по всему среднего и заднего мозга с проекциями пробегает по вентрального среднего мозга (рис. 1В). Во взрослом мозге, Wnt1-линии отмечены на E8.5 порождает многие структуры мозга, включая высших и низших холмов, а также в непосредственной близости от дофаминергических клеточных популяций вентральной области покрышки и черной субстанции (рис. 1D) (см. Также Зервас 2004). В противоположность этому, Wnt1-линии отмечены на E9.5 порождает уступает холмов, а также нейроны в непосредственной близости от дофаминергических клеточных популяций (рис. 1F).

Рисунок 1 представитель Результаты Wnt1-рок отображения.:

Примеры целом монтажа и иммуноцитохимии приводит Wnt1-CreERT; mGFP эмбрионов и взрослых судьба мозги отображается (помечены) в E8.5 (AD)и E9.5 (EF). А. Wnt 1-Крир; mGFP эмбрионов на E12.5 выставку GFP флуоресценции в первую очередь в среднем мозге (Мб), задний задний мозг (Hb) и спинного мозга (Sp). Б. Помечено в клетках визуализироваться и анализироваться на клеточном уровне, иммуногистохимии, как показано на этом 1-мкм оптической части (40x цели, г-серии приобретения). Ядерный β-галактозидазы (nβ-гал) антител маркировку (красный) и GFP антител маркировки (зеленый) показывает судьба отображаемой клетки показано на вентральной мозга. Здесь рекомбинированное клетки двойной положительный (nβ-гал + / GFP +) из-за характера условного репортер mGFP. C. Всего монтажа расцвета микроскопия выявляет слабые флуоресценции GFP в превосходной холмов (SC) для взрослых (вставка). Оценка Wnt1 линии отмечены на E8.5 на взрослых участки с низким увеличением (5X) микроскопия показывает, что Wnt1 линии порождает мозга структур, включая улучшенный (SC) и нижней (IC) холмов (С). Д. 40x, 1 мм оптической части взяты из вентрального среднего мозга в непосредственной близости от дофаминергических нейронов с nβ-гал + клеток и богатой GFP + аксонального сплетения. Е. Маркировка на результаты E9.5 к существенному маркировки GFP, который легко наблюдается в нижних бугорок среднего мозга целыми горе флуоресценции (вставка). Wnt1 линии отмечены на E9.5 на взрослых секций (β-гал +, красный) сосредоточена в нижних бугорок (спинно-заднем среднего мозга), как видно с низким увеличением (5X) микроскопии (Е). Ф. 40x, 1 мм оптической части взяты из вентрального среднего мозга в непосредственной близости от дофаминергических нейронов с nβ-гал + клеток и богатой GFP + аксонального сплетения. Wnt1 полученных нейронов отмечается при сравнении E8.5 E9.5 постепенно запрещено способствует спинного мозга, в то время Wnt1 линии сохраняется в содействии вентрального среднего мозга.

Обсуждение

GIFM система, которую мы продемонстрировали, могут быть использованы для ответа широкий круг вопросов в различных клеточных процессов. Например, мыши разработана с различными драйверами Cre может быть использована для целевых любого типа клеток, тканей или генетической линии интересов. Кроме того, поскольку тамоксифен могут быть введены в любой эмбриональный или послеродового момент времени, рекомбинации могут быть направлены на любой соответствующей стадии развития. Пространственным и временным контролем этой системы и...