Чтобы вырастить нервного гребня стволовых клеток (NCSC) в пробирке, специальные среды (NCSCM) не требуется. Значительная часть NCSCM является куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ). Мы здесь описать точных методов для получения максимальной суммы чистого и высокого качества Центральной и Восточной Европы, в том числе детали, как изоляция, мацерации, центрифугирования и фильтрации процессов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Производство Чик извлечение эмбрионов для выращивания мышей нервных стволовых клеток Крест
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нервного гребня возникает из-за нервно-эктодермы в период эмбриогенеза и сохраняется только на время. Первые эксперименты уже проверенные плюрипотентных клеток-предшественников, чтобы быть неотъемлемой частью нервного гребня 1. Фенотипически, нервного гребня стволовых клеток (NCSC) определяются одновременно выразив p75 (низкий аффинных фактора роста нервов рецепторов, LNGFR) и SOX10 во время их миграции из нервного гребня 2,3,4,5. Эти клетки-предшественники могут дифференцироваться в клетки гладкой мускулатуры, хромаффинных клеток, нейронов и глиальных клеток, а также меланоцитов, хрящевой и костной 6,7,8,9. Чтобы вырастить NCSC в пробирке, специальные нервного гребня стволовых клеток среды (NCSCM) требуется 10. Наиболее сложной частью NCSCM является подготовка куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ), представляющий собой важный источник роста факторов NCSC, а также для других типов нейронных эксплантов. Другие ингредиенты NCSCM рядом с Центральной и Восточной Европы имеются в продаже. Производство CCE с использованием лабораторных стандартной комплектации он имеет большое значение, чтобы знать о сложных деталей, как изоляция, мацерации, центрифугирования и фильтрации процессов. В этом протоколе описываются точных методов для получения максимальной суммы чистого и высокого качества ЦВЕ.
Протокол
Авторы утверждают, что эксперименты на животных были проведены в соответствии с Европейскими сообществами Директивы Совета (86/609/EEC), следующие руководящие принципы в отношении НИЗ уход и использование животных для экспериментальных процедур и правил, установленных Институциональные животных Уход и использование комитета (IACUC) в университете Дуйсбург-Эссен (Германия).
Часть 1: Настройка (не показано на видео)
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ И ПУТИ ИХ РЕШЕНИЯ (до принятия яйца из инкубатора)
- Яйца должны быть инкубировали во влажной инкубаторе в течение 11 дней при температуре 37 ° C (100 ° F).
- 70% этанола, спрей, чистые тарелки, точный чистый пинцет, 4 ° C (40 ° F) холодного стерильного DMEM на льду и 60 мл стерильные шприцы
- 50 мл стерильные пробирки Corning должны быть наполовину заполненной с 4 ° С холодным DMEM смешать вымоченных эмбрионов в соотношении 1:1 (вымоченных масса: DMEM). Как только яйца выводятся из рассечение инкубатор куриных эмбрионов должен быть запущен.
- Стерилизовать рассечение инструментов в автоклаве или в день вскрытия, погрузить инструменты в 70% этаноле в течение 20 минут.
Часть 2: Препарирование куриных эмбрионов (демонстрируется на видео)
- Влажные инкубационных яиц с 70% этанола спрея в течение по крайней мере, 30 секунд и высушите их осторожно чистой мягкой салфеткой при этом не качая яйца чрезмерно.
Примечание: Мы рекомендуем не рассекает более чем на 60 куриных эмбрионов одновременно. - Открытое яйца тщательно лихой против острого края и выньте эмбриона с осторожностью, не разрушая мешок желтка или куриного эмбриона себя.
- Поиск начале пуповины быстро и открытых ясно упаковки, не разрушая мешок желтка или любой мало судов. Затем рассекают пуповину с точным чистым пинцетом.
- Возьмите эмбриона из мешка желтка.
Примечание: Эмбрионы должны быть обезглавленным быстро (не показано на видео). - Сбор эмбрионов в минимальной необходимой среде при температуре 4 ° C.
Часть 3: мацерация куриных эмбрионов
- Возьмите поршень из 60 мл стерильного шприца.
- Передача примерно 10 эмбрионов в одном 60 мл шприца.
- Поместите поршень тщательно обратно в шприц, чтобы не потерять вымоченных материала.
- Размочите, нажав на поршень.
- Сбор вымоченных массу в подготовленные трубки Corning наполовину заполненной с DMEM в соотношении 1:1 (вымоченных масса: DMEM). Использование 10 эмбрионов объемом около 25 мл производится.
- Поместите смесь в шейкере в течение 45 мин при 4 ° C.
Часть 4: Центрифугирование куриного эмбриона - DMEM Подвеска
- Передача куриного эмбриона - DMEM суспензии в центрифугирования труб.
- Добавить стерильной гиалуронидазы в концентрации 1 мг на 25 мг эмбриона.
- Тара центрифугирования труб очень точно.
Примечание: Этот шаг следует выполнять с осторожностью, так как центрифугирование запускается при очень высоких перегрузок и повреждения материала или центрифуги могут возникнуть при использовании несбалансированной труб. С высокой точностью весов соответствии отношении трех позиций после десятичной точки для всех труб должна быть получена путем корректировки недостающую сумму с DMEM. - Уменьшить температуру центрифуге до 4 ° C.
Примечание: Также центрифугирования ротора должны храниться в холодильной камере или холодильнике в течение ночи. - Центрифуга 6 часов по крайней мере, 180,000 х ^ Х ч. Примечание: Для получения превосходных результатов в отношении разделения отдельных фаз использовать 266,000 х ^ Х ч. Если это возможно, использовать вакуум регулировки.
Часть 5: Фильтрация Извлечение куриного эмбриона
После центрифугирования, три фазы можно заметить: верхний темный жидкой фазы с жирными фрагменты, ясно жидкой фазы в середине и осадок на дне трубки центрифугирования. Примечание: встряхивания или оживленной перемещения центрифугировали смеси должна быть строго избегать, так как это разрушит результате центрифугирования шаг за потери ясно центральной жидкой фазы.
Примечание: Все следующие шаги должны быть выполнены в стерильных условиях с использованием ламинарного потока воздуха скамьи:
- Внесите ясно жидкой фазы в фильтр с порами 0,45 мкм. Затем включите связано вакуумного насоса.
Примечание: Не прикасайтесь гранул на дне. Это привело бы к загрязнению извлекать и блокирование системы фильтров. - Передача предварительно распакован в фильтр с порами 0,22 мкм и переключиться на подключенном вакуумный насос снова.
- Алиготе достигнута экстракт куриного эмбрионав стерильные 15 мл Corning труб.
- Быстро хранить аликвоты при -80 ° C (-62 ° F). Примечание: Центральной и Восточной Европе продлится до двух лет при условии хранения при температуре -80 ° C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол основан на модификации процедуры, которые были описаны в прошлом 10,11. В дополнение к бывшим публикациях мы здесь, показывают отдельные различные этапы процесса более расширены. Это подтверждает экспериментатор с важной детали обеспечения правильного разбирательства и достоверных результатов. Кроме того, как рассечение процесс является неотъемлемой частью добычи Центральной и Восточной Европы мы описываем процедуру принятия эмбрионов из мешка желтка в каждой детали. Есть несколько важных момент...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Поддержку и советы Маркус Pajtler и Роберт Борер были бесценны для визуализации этого протокола.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Куриные яйца, инкубированные в течение 11 дней | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Спрей для спиртовой дезинфекции | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Стерильный шприц (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Стерильные пробирки (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Стерильные наконечники для пипеток | Starlab GmbH | ||
| Гиалуронидаза typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Стерильные фильтры Milipore stericups (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Стерильные пипетки (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Центрифуга L5-50 | Ротор типа Ti-45 |
Ссылки
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
