Количественная уровней РНК ВИЧ-1 в плазме крови и последовательности одного ВИЧ-1 генома от лиц с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения (50-75 копий / мл) трудно. Здесь мы опишем, как извлечь и количественной вирусной РНК с помощью ПЦР в реальном времени анализ, который надежно измеряет РНК ВИЧ-1 до 0,3 копий / мл и как усилить вирусных геномов путем секвенирования генома одного из образцов с очень низкой вирусной нагрузкой.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Усиление и Количественная РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения стандартными клиническими Анализы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Усиление вирусных генов и количественной оценки РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-1-инфицированных пациентов с вирусной нагрузкой ниже предела обнаружения стандартные анализы (ниже 50-75 копий / мл) необходимо, чтобы разобраться с вирусной динамики и взаимодействия вируса принимающей у пациентов, которые Естественно борьбы с этой инфекцией, и те, которые находятся на комбинированной антиретровирусной терапии (ВОЗ).
Здесь мы опишем, как для усиления вирусных геномов одиночными секвенирование генома (SGS протокола) 13, 19 и, как точно количественно РНК ВИЧ-1 у пациентов с низкой вирусной нагрузки (одной копией анализа (SCA) протокол) 12, 20.
Одной копии анализа является ПЦР в реальном времени анализа с чувствительностью в зависимости от объема плазмы быть проанализированы. Если одного генома вирус обнаружен в 7 мл плазмы, то количество РНК копия, как сообщается, 0,3 копий / мл. Анализ имеет внутреннее тестирование для контроля эффективности добычи РНК, а также контроль за возможным усилением из ДНК или загрязнения. Образцы пациентов измеряются в трех экземплярах.
Одной секвенирование генома анализа (SGS), теперь широко используется и считается без трудоемких 3, 7, 12, 14, 15, предельного разбавления пробы, в которых конечная точка разбавленный кДНК продукт распространяется на 96-луночного пластины. Согласно распределению Пуассона, когда менее чем 1 / 3 от скважины дают продукт, существует 80% вероятности продукт ПЦР будучи равнодействующей усиления из одной молекулы кДНК. SGS имеет преимущество по сравнению с клонированием не подвергается передискретизации, а не в предвзятости при помощи ПЦР введенные рекомбинации 19. Тем не менее, усиление успех SCA и SGS зависит от грунтовки дизайна. Оба были разработаны анализы на ВИЧ-1 подтипа Б, но могут быть адаптированы для других подтипов и других регионов генома, изменяя грунтовки, зонды, и стандартами.
Протокол
1. Добыча РНК из больших объемов плазмы
Обзор одного анализа копию (SCA) и одного секвенирование генома (SGS) протокола предоставляются на рисунках 1 и 2.
- Чтобы получить 7 мл плазмы, спин примерно 14 мл крови, собранных в 15 мл ЭДТА (не гепарин) сбор труб при 2600 мкг в течение 15 минут без торможения. Внесите плазмы (убедившись, чтобы избежать слой лейкомассы) в 15 мл пробирки.
- Если РНК добывается для одного анализа копию (SCA), шипованные плазмы с 30 000 копий вируса саркомы Рауса внутренних вириона управления (разъемы RCA). Вирус RCAs готова до выполнения SCA, как описано ранее (20). Короче говоря, разъемы RCA виру....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ВИЧ-1-инфицированных лиц на комбинированной антиретровирусной терапии (ВОЗ), или которые, естественно, контроль инфекции имеют очень низкую вирусную нагрузку, как правило, около 1 экземпляру на каждый мл 4 плазмы, 11, 12, 17, 18. Вирусная нагрузка у пациентов с естественным контролем, часто колеблются вокруг индивидуальный набор 1 очко, 2, 17. Чувствительность анализов, описанные здесь очень сильно зависит от входных объема плазмы. Как правило, мы работаем с 7 мл плазмы, но положительные результаты.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы признают, пациенты, которые принимали участие в многих исследованиях ВИЧ-1.
СВК был профессор-исследователь из Американского онкологического общества при поддержке FM Кирби Foundation.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Случайные гексамеров (500 мкг / мл) | Promega | C118A | |
| Taqman буфер | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 ед / мкл) | Promega | N211B | |
| RT фермента (200 ед / мкл) | Strategene | 600107-51 | |
| AmpliTaq Золотой ДНК-полимеразы | Applied Biosystems | 4311814 | 6-пакет |
| AmpliTaq 10XGold ПЦР буфер II | Applied Biosystems | 4311814 | поставляется с ферментом |
| Magnesiumcloride 25 мМ | Applied Biosystems | 4311814 | поставляется с ферментом |
| 1М Трис-HCl буфере, рН 8,0, 5 мМ | Invitrogen | AM9855G | |
| Надстрочный III фермента обратной транскриптазы, 200 U / UL | Invitrogen | 18080-044 | |
| Надстрочный III 10X буфера | Invitrogen | поставляется с ферментом | |
| 100 мМ DTT | Invitrogen | поставляется с ферментом | |
| Платиновый Taq ДНК-полимеразы High Fidelity 5 U / UL | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10Х High Fidelity ПЦР-буфера | Invitrogen | 11304-102 | поставляется с ферментом |
| Протеиназы-К 20 мг / мл | Амбион | 2546 | |
| Гуанидиний тиоцианатов решение 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Гликоген 20 мг / мл | Roche | 10901393001 | |
| Изопропанол | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Этанол 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Молекулярная класса воды | Gibco / Invitrogen | 10977-015 | |
| дНТФ (25 ммоль каждого) | Биолайн | BIO-39025 |
| Название датчик | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Легкая печать Центрифуга Tubes (16x73mm) | Ситон Научные | 6041 | |
| Белый Delrin крон | Ситон Научные | 4020 | Шапочки для Легкое Трубы печать |
| Стеллаж для труб Optiseal Белл-Top Трубы, 8,9 мл | Бекман | 361642 | |
| Шестигранный вороток ½ вкл открытия | Ситон Научные | 4013 | |
| крышка удаления Тупе | Ситон Научные | 4014 | |
| 5 мл серологических пипеток | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | любой | ||
| 15 мл пипетки Трансфер | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5,8 мл Dispossable пипетки передачи, тонкой наконечником | VWR | 14670-329 | |
| 15 мл центрифужные пробирки | Сокол | ||
| 1 мл пробирок центрифуги | любой | ||
| Трис буфер Saline таблетки | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ультрацентрифуге и ротора | Sorval | 90SE и Т-1270 | |
| 96-луночных ПЦР пластины | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 мл реагента водохранилище | Costar | 4870 | |
| МкА оптический 96-луночного планшета реакции | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Оптические пластины охватывает | Applied Biosystems | 4333183 | |
| МкА Оптический Pad сжатия | Applied Biosystems | 4312639 | |
| MicrosealФильм | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 мл пробирок центрифуги | Любой | ||
| 1% агарозном геле (E-гель, Invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-базы (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
ЭДТА Коллекция труб любой марки
Ссылки
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
