Количественная агонистично активность на G-белком рецепторы

Краткое содержание

Метод оценки сродства константа агонистом активном состоянии ( K _{Б) Для G-белком рецептор описывается. Анализ дает абсолютной или относительной меры K Б, В зависимости от того, учредительные активации рецепторов измеримо. Наш метод применяется к различным вниз по течению ответы от активации рецепторов.}

Аннотация

Когда агонист активизирует население G-белком рецепторы (GPCR), он вызывает сигнального пути, который завершается в ответе клеток или тканей. Этот процесс может быть проанализирован на уровне одного рецептора, население рецепторов, или вниз по течению реакции. Здесь мы опишем, как анализировать ответ на выходе получить оценку агонист константа сродства для активного состояния одного рецепторов.

Рецепторы вести себя как квантовые коммутаторы, которые чередуются между активным и неактивным состояниями (рис. 1). Активном состоянии взаимодействует со специфическими белками G или другой сигнализации партнеров. В отсутствие лигандов, неактивном состоянии преобладает. Связывание агонистов увеличивает вероятность того, что рецептор переходит в активное состояние, потому что его константа сродства для активного состояния (К _б) гораздо больше, чем для неактивном состоянии (К). Суммированиеслучайного выхода из всех рецепторов в популяции дает постоянный уровень активации рецептора во времени. Обратная концентрации агониста вызывая полумаксимальной активации рецептора эквивалентно наблюдается постоянная близость (K _набл), а доля агонист-рецепторных комплексов в активное состояние определяется как эффективность (ε) (рис. 2).

Методы анализа вниз по течению ответы GPCRs были развиты, что позволяют оценка K _набл и относительной эффективности агониста ^1,2. В этом докладе показано, как изменить этот анализ для оценки агонистов К _б значение относительно, что другого агониста. Для тестов, которые показывают учредительных деятельности, мы покажем, как оценить К _б в абсолютных единицах М ^-1.

Наш метод анализа агонист реакции на концентрацию кривые ^3,4 состоитглобальной нелинейной регрессии с использованием операционной модели ^5. Мы описываем процедуру, используя программное приложение, Prism (GraphPad Software, Inc, Сан-Диего, Калифорния). Анализ дает оценку произведению K _набл и параметр, пропорциональный эффективности (τ). Оценку тк _набл одного агониста, деленная на территорию другого, является относительной мерой К _Ь (РА _я) ^6. Для любого рецептора выставке учредительных деятельности, то можно оценить параметр, пропорциональный эффективности свободный комплекс рецепторов (τ _{системы).} В этом случае значение К _Ъ агонист эквивалентно тк _{затемнения} / τ _{системы} ^3.

Наш метод используется для определения избирательности агонистом рецепторов подтипа и для количественного агонист-рецептор передачи сигналов через различные белки G.

Протокол

1. Измерение концентрации агониста-ответ кривые: нет учредительных деятельности

1. Для оценки относительного агонистов К значения _б (RA _я), серии по крайней мере два агониста реакции на концентрацию кривых не требуется. Любой в пробирке тест для функциональной реакции GPCR могут быть измерены при условии, что концентрация агониста можно управлять и один тип рецепторов опосредует ответ. Подходит клеточной анализы включают измерение цАМФ ^4,7 и ^8,9 inositolphosphate накопления в клеточной линии выражения рекомбинантных рецепторов. Примеры целом анализы тканей включают измерение сокращение гла....

Обсуждение

Потому что наш метод оценки РА _я (относительно К _б значению) только требует измерения концентрации агониста-ответ кривые, наш анализ можно сделать в любое время эти кривые измерены.

Если изо дня в день изменения в ответе экспериментальной подготовки (например, клеток или тканей) велика, ответ измерения каждой реакции на концентрацию кривой можно нормировать относительно "Топ" оценка стандартного агонистом для каждого дня эксперимента. Оценка .......