Методическая статья

Поколение, очистка и характеристика Cell-инвазивных видов белка DISC1

DOI:

10.3791/4132

⸱

30 августа 2012 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuropathology, Medical School Düsseldorf, Germany, 2Center of Behavioral Neuroscience, University of Düsseldorf

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поколения, очистки и клеточной вторжения внутриклеточных, цитоплазматические полную длину DISC1 белка aggresomes из клеточных культур и помечены, мультимерные рекомбинантного DISC1 фрагмент белка в E. палочки Описаны. Сотовые инвазивности показано для клеток реципиента в культуре клеток и нейронов В естественных условиях После стереотаксической прививки мозга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Агрегации белков рассматривается как общий признак хронических дегенеративных заболеваний мозга, как, например, в нейродегенеративных заболеваний, болезни Альцгеймера (Ар, тау), болезнь Паркинсона (α-синуклеина), болезнь Хантингтона (полиглутаминовых, гентингтина), и другие. Агрегации белков, как полагают, происходят из-за нарушения proteostasis, то есть дисбаланс между возникновением и деградации неправильно свернутых белков. Следует отметить, что те же белки находятся собраны в спорадическими формами этих заболеваний, которые мутанта в редких вариантах семейных формах.

Шизофрения является хроническим прогрессирующим состояние мозга, что во многих случаях идет вместе с постоянными и необратимыми когнитивного дефицита. В подходе гена кандидата, мы исследовали, может ли Нарушенные-в-шизофрения 1 (DISC1), ген, клонированный в шотландской семьи с привязкой к хроническим психическим заболеванием 1, 2, может быть найдено в виде нерастворимых агрегатов в Braiп спорадических случаев шизофрении 3. Использование CC SMRI, мы определили примерно в 20% случаев с CMD, но не нормальное управление или пациентов с нейродегенеративных заболеваний sarkosyl нерастворимые DISC1 иммунореактивности после биохимического фракционирования. Последующие исследования в пробирке показали, что агрегация склонность DISC1 под влиянием болезни связанные полиморфизма S704C 4, и что DISC1 aggresomes генерируется в пробирке клетки были инвазивные 5, подобное тому, что было показано для Ар 6, тау 7-9, α -синуклеина 10, полиглутаминовых 11, или SOD1 агрегатов 12. Эти результаты побудили нас предположить, что по крайней мере подмножество случаев с CMD, те, с общей DISC1 может быть белка конформационные нарушения.

Здесь мы расскажем, как мы генерируем DISC1 aggresomes в клетках млекопитающих, очистить их от градиента сахарозы и использовать их для клеточной инвазии StudiES. Кроме того, мы расскажем, как мы создаем исключительно мультимерные С-концевой фрагмент DISC1, этикетки и очистить его для исследования клетки инвазивности. Использование рекомбинантных мультимеры DISC1 мы достичь аналогичных инвазивности клетки, как и для аналогичной надписью синтетических α-синуклеина фрагмент. Мы также показываем, что этот фрагмент взят в естественных условиях, когда стереотаксически вводили в мозг получателя животных.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Aggresome клетки донора: Трансфекция мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) или расширенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP)-отмеченном человека Full Length (Флорида) DISC1

  1. Семенной 1,5 х 10 6/10 см блюдо нейробластомы человека NLF (НПР; Детской больницы Филадельфии, Филадельфия, Пенсильвания) клеток в десяти 10 см блюд и расти в течение ночи. NLF клетки культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS, пенициллин / Strepomycin, L-глютамин. На следующий день, клетки должны быть на уровне 70-80% слияния.
  2. Временно трансфекции каждые 10 см Блюдо с 15 мкг плазмидной ДНК и Metafectene реагентов трансфекции (Biontex, Martinsried, Германия). Короче говоря, для 10 см блюдо, 15 мкг плазмидной ДНК и 30 мкл Metafectene были добавлены к 750 мкл Opti-MEM, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин. 5 блюд трансфицировали pcDNA3.1 mRFP / УЗФБ с метками человека (Флорида) DISC1 и 5 блюд с EGFP-плазмиды в одиночку.

2. AggresomeОчистка от трансфицированных клеток донора

Протокол, описанный здесь, является сочетание методов для очистки Леви-органов из мозговой ткани 13 и протокол выделить крупные агрегаты и aggresomes 14. Так как уже существующие методы основаны на использовании моющих средств, изоляции моющие средства без белков для применения в клеточной инвазии анализа имеет решающее значение.

  1. 48 ч после трансфекции, следить за выражением УЗФБ и mRFP/eGFP-DISC1 и подтвердить образование aggresomes под флуоресцентным микроскопом (рис. 1).
  2. Вымойте клетки с PBS рН 7,4, царапина с 400 мкл PBS каждому, добавить 1X коктейля ингибитора протеазы (Roche, Indianapolis, IN) и разрушают клетки, используя Precellys24 гомогенизатора (Бертен технологий, Франция). Короче говоря, добавляют 1 мл клеточной суспензии в 2-х трубной лизиса мл и добавляют 10 керамические бусины. Лизиса клеток с 3 х 60 импульсов сек. Механической силой процесса можетповышения температуры внутри образца выше 37 ° С, так следует позаботиться, чтобы охладить образец на лед после лизиса процедуры.
  3. Охладить клетки на льду и добавляют 10 мМ MgCl 2, 40 ед / мл ДНКазы и инкубировать в течение 60 мин при 37 ° C
  4. Подготовка решений 80%, 50%, 20% сахарозы (вес / объем) в PBS рН 7,4 (10 мл каждая).
  5. Подготовка градиента сахарозы в 15 мл трубки сокола, начиная с 2 мл 80% сахарозы, затем 50% и 20%. Залить градиентом медленно и будьте осторожны, чтобы не нарушить уже налил слоев. Слой переваривается лизат в верхней части градиента и центрифуги в течение 15 мин при 1000 мкг при 4 ° C.
  6. Осторожно собрать межфазных между 50-80% сахарозы слоя с помощью пипетки и смешать с 5 объемами PBS рН 7,4. Центрифуга в течение 15 мин при 1000 мкг при 4 ° C. Повторите промывание два раза. В этом интерфазе, aggresomes являются люминесцентные и могут быть визуализированы в микроскоп, под воздействием ультрафиолетового излучения.
  7. Удалите супернатант иресуспендируют осадок в 250-500 мкл PBS рН 7,4. Этот осадок содержит очищенный aggresomes (рис. 2).

3. Лечение получателя SH-SY5Y Клетки с mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes

  1. Семенной 5 х 10 4 получателем SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы конститутивно выражения GFP-DISC1 (598-854) на стерильные покровные стекла в каждую лунку 24-луночный планшет. SH-SY5Y клетки культивируют в DMEM/F-12 среде с добавлением пенициллина / стрептомицина, без незаменимых аминокислот (NEAA) и 10% FBS.
  2. 24 час позже, добавьте 10 мкл в каждую лунку и инкубировать в течение 48-72 часов.
  3. Вымойте клетки: 3 х PBS рН 7,4 и утолить внеклеточной флуоресценции с 0,04% трипановым синим в течение 5 мин.
  4. Исправить клетки с 4% PFA в PBS рН 7,4 в течение 10 мин на льду, мыть один раз стерильной H 2 O и установить покровные на предметные стекла с золотой продлить с DAPI монтаж среды (Invitrogen, США).
  5. Подтвердите поглощение /вторжение экзогенно применяется aggresomes по колокализации работу с белками выраженных клеток реципиента в Z-стек изображений.

Тем не менее, поглощение / Вторжение экзогенных белков не может быть обнаружено по существу параллельно с набором хозяин клеточного белка. В нашем примере mRFP с метками DISC1 aggresomes новобранца растворимые GFP с метками DISC1 (598-854) белок выразил в клетку-хозяина (см. Рисунок 3). Представленные фотографии были сделаны на Zeiss LSM 510 конфокальной или микроскоп Zeiss AxioVision Apotome2.

4. Поколение рекомбинантных DISC1 (598-785)

В предыдущей публикации мы проанализировали способность различных DISC1 фрагменты белка самостоятельно взаимодействовать на основе наличия самоассоциации области. Среди всех белковых фрагментов испытания человека DISC1 (598-785) отображается самая сильная склонность мультимеризацию 4 (рис. 4). Таким образом, человек DISC1 (598-785), был клонирован в pET15b (нетVagen, Madison, Wisconsin), содержащих N-терминал 6-гистидин тегов, выраженное в E. палочки BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, США), и очищенный в денатурирующих условиях в 8 моль / л мочевины, как описано 4. Короче говоря, протокол приводится ниже.

  1. BL21-(IDE3) Rosetta E. палочки были выращены в 2 х 500 мл 2YT, содержащего 5 мМ-аргинин-HCl, 5 мМ MgSO4, 100 мкг / мл carbencillin, 35 мкг / мл хлорамфеникола до OD 600: 0.6-0.8 и DISC1 (598-785) выражение индуцированного с 1 мМ IPTG.
  2. DISC1 (598-785) была высказана в течение 4 часов при 37 ° C, выражение было прекращено, собирая бактерии путем центрифугирования.
  3. Бактериальных ресуспендировали в 50 мл ТЕ-буфера (50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 5 мМ EDTA) плюс 2 мМ PMSF, 1% TX-100, 250 мкг / мл лизоцима, 20 мМ MgCl 2 и 400 мл U/50 ДНКазы I. Для обеспечения полного лизиса, реакция инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
  4. Добавить 10 мМ β-mercaptoethanol (ME) и 500 мМ NaCl и инкубировать в течение еще 30 мин.
  5. Спином вниз бактериальных телец включения при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° C.
  6. Ресуспендируют гранул в 50 мл экстракционного буфера содержащего 50 мМ Трис, рН 8,0, 5 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 8 М мочевины и 10 мМ β-ME и удаления мусора с помощью центрифугирования при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° C.
  7. Вымойте Ni-NTA агарозы матрицу с буфером для экстракции. Инкубируйте ресуспендированных, precleared экстракт белка с Ni-NTA матрицы в течение 2 часов при комнатной температуре.
  8. Вымойте Ni-NTA матрица с добычей буфера, содержащего 12 мМ имидазола.
  9. Элюируйте белка медленно с 15 мл элюции буфером, содержащим 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, 8 М мочевины, 1 мМ PMSF, 5 мМ ЭДТА и 10 мМ β-ME.
  10. Диализировать белка поэтапно в PBS рН 7,4, содержащем 10 мМ β-ME.

Из 1 л бактериальной культуры, начиная можно выделить до 50 мг рекомбинантного DISC1 (598-785), протЭйн.

α-синуклеина рефолдинг

Для экспериментов с α-синуклеина, 500 мкг рекомбинантного белка (Sigma-Aldrich, США) растворяли в PBS в концентрации 1 мг / мл. Для получения олигомеров, рефолдинг была выполнена в течение ночи при 37 ° C, как описано в предыдущей публикации 10.

5. Маркировка рекомбинантного DISC1 (598-785) с DyLight594

  1. До последующего процесса маркировки, DISC1 (598-785) белка быть освобождены от β-ME. Таким образом, белок диализуют 3 раза PBS рН 7,4 в разведении 1:2000.
  2. Метка 1 мг DISC1 (598-785) с DyLight 594 малеимида (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, растворить 1 мг / мл белка в PBS рН 7,4 и добавьте 5 мМ TCEP восстановить бесплатное тиоловых групп. Добавить 20 мкл ДМФ растворяли краски реакции и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
  3. Диализировать белка 3 х в PBS рН7,4 при соотношении 1:2000 в течение 2 часов каждая.

Для дальнейшего повышения чистоты меченых белков Его 6-отмеченных привязку очистки на Ni-NTA колонке выполняется.

  1. Вымойте 1 мл Ni-NTA матрицы (Qiagen, Германия) с 10 мл PBS рН 7,4.
  2. Применение меченых, диализуют белка в колонну и дайте ему поработать над колонной медленно.
  3. Вымойте белка с 3 х 20 мл PBS рН 7,4
  4. Элюируйте белка с PBS рН 7,4, 500 мМ имидазола по каплям при мониторинге цветные полосы на Ni-NTA колонке для уменьшения объема элюата.
  5. Диализировать элюата 3 х до 10 мМ NaPi рН 7,4 в разведении 1:2000 в течение 2 часов каждая.
  6. С помощью стерильного шприца 0,45 мкм фильтр для фильтрации элюата, аликвоты в 5 х 100 мкл образцов и оснастки замораживание в жидком азоте. Общее количество белка должно составлять 0,5 - 1 мкг / мл в каждый 100 мкл.

дополнительно концентрATION шаг

  1. Для стереотаксической инъекции крыс, белок был сосредоточен 10-кратный в скорости переменного тока (Eppendorf Концентратор 5301). Окончательные условия буфер 100 мМ NaPi.

α-синуклеина маркировки

Маркировки и очистки (Ni-NTA колонке) рекомбинантного α-синуклеина был выполнен параллельно с DISC1 (598-785). Общее исходное вещество было 500 мкг вместо 1 мг для DISC1 (598-785).

6. Лечение получателя SH-SY5Y Клетки с Маркированный рекомбинантного DISC1 (598-785) Протеин

  1. Семенной 5x10 4 получателем SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы конститутивно выражения GFP-DISC1 (598-854) на стерильные покровные стекла в каждую лунку 24-луночный планшет.
  2. Добавить меченого белка в среде для культивирования клеток в концентрации 5-10 мкг / мл и инкубируют в течение 48-72 часов.
  3. Вымойте клетки: 3 х PBS рН 7,4 и утолить добычеellular флуоресценции с 0,04% трипановым синим в течение 5 мин.
  4. Исправить клетки с 4% PFA в PBS рН 7,4 в течение 10 мин на льду, мыть один раз стерильной H 2 O и установить покровные на предметные стекла с золотой продлить с DAPI монтаж среды (Invitrogen, США).
  5. Подтвердите поглощение / вторжения экзогенно применяется рекомбинантный белок по колокализации работу с белками выраженных клеток реципиента в Z-стек изображения, создаваемые при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Тем не менее, набор эндогенного белка не может быть обнаружено по существу параллельно с вторжением хозяин клеточного белка, Z-стек изображений все еще может подтвердить инвазивный характер белка.

В нашем примере рек. DISC1 (598-785) * по крайней мере в части новобранцев растворимые GFP с метками DISC1 (598-854) белок выразил в клетку-хозяина (рис. 5А). Для рекомбинантного α-синуклеина вторжения, но не призыв показано на рисунке (рис. 5б). Представленные фотографии были сделанына Zeiss LSM 510 конфокальной или Zeiss AxioVision Apotome2 микроскоп.

Введение концентрированного (около 4 мкл 2,5 мкг / мкл), обозначенный DISC1 (598-785) * в MPFC результаты в распространении белка вокруг места инъекции, которые могут быть обнаружены даже после перфузии животных с 4% PFA в PBS рН 7,4 с родамина filterset. В нашем примере DISC1 (598-785) занимают различные числа нейронов и могут быть проверены с Z-стека изображений (рис. 6).

В целом, введение белков, отличных от тех, которые используются здесь, не обязательно приводят к клеточной вторжения. Вторжение событие существенно зависит от природы белка, тем не менее, чистый очистка является необходимым условием для дальнейшего анализа.

7. Представитель Результаты

Aggresomes, состоящий из рекомбинантного FL DISC1-EGFP очищенный из клеток NLF вторглись получателя SH-SY5Y сеООО с низкой эффективностью (около 0,3% 5), как показано на колокализации с конфокальной микроскопии (рис. 3). Как сообщалось ранее, DISC1 (598-785) выразили и очищают от E. палочки образуется мультимеров 4 были одинаково клетки-инвазивных при КПД около 20% 5 (рис. 5А) похож на α-синуклеина, который был использован в параллельном качестве положительного контроля (рис. 5В). Маркированный рекомбинантного DISC1 (598-785) выразили и очищают от E. палочка была также клетки-инвазивной для нейронов в естественных условиях, когда мультимерные белка стереотаксически вводят в медиальной префронтальной коре крыс (рис. 6; Pum, Bader, Хьюстон, Korth, не опубликовано).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Клеток нейробластомы NLF временно выражения FP-DISC1 (красный). Красные флуоресцентные aggresomes может быть детеИДКТК в клетках.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Очищенный mRFP с метками DISC1 aggresomes после очистки в градиенте сахарозы.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Флуоресцентная картина вторглись aggresomes. mRFP с метками flDISC1 aggresomes были очищены и инкубировали с SH-SY5Y клеток нейробластомы гиперэкспрессией растворимые GFP с метками DISC1 (598-854). Поглощения меченого aggresomes контролируется Z-стек изображений на Laser-Scan микроскоп (Zeiss LSM 510).

figure-protocol-4
Рисунок 4. SEC-профиль рек. DISC1 (598-785), содержащих S704 и C704 одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP). Оба варианта показывают нарушение приказал олигомеризации и формирования высокого молекулярного веса мультimers (красная стрелка). Эта картина изменилась с момента публикации Leliveld и соавт., Биохимии 2009 года.

figure-protocol-5
Рисунок 5. Флуоресцентные Z-стек картина инвазивных DyLight-меченых рекомбинантных DISC1 (598-785). SH-SY5Y клеток нейробластомы выразив растворимой GFP-DISC1 (598-854) инкубируют с меченым, рекомбинантного белка в концентрации 5 мкг / мл. (A) Красный агрегатов показывает вторжение в Рек. DISC1 (598-785), белки и желтые точки показывают набора растворимых GFP-DISC1 (598-854) в агрегатах. (B) рекомбинантного α-синуклеина (красный) проникает в клетки без набора с частотой около 20%. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-protocol-6
Рисунок 6. Иммунофлуоресцентного картинувводили меченый, рекомбинантный DISC1 (598-785) белка. Z-стек изображений подтверждает наличие рек. DISC1 (598-785) белков в нейронах коры головного мозга крысы окрашивали антителами против нейронов ядер (NeuN, зеленый).

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе мы описываем очистки mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes из трансфицированных линии клеток нейробластомы, подготовка и маркировки рекомбинантного белка DISC1 видов и их применение в клеточной вторжения экспериментов клетки реципиента в пробирке и в естественных условиях.

Очистка родной mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes была разработана с протоколами, чтобы изолировать тело Леви-структур и крупных агрегатов 13, 14, но изменен, чтобы избежать использования моющих средств и минимизировать риск ложных положительных клеток вторжения, которые могут возникнуть в связи с моющим средством при содействии проницаемости мембран.

Одним из возможных улучшение будущем может быть, чтобы еще больше повысить чистоту aggresomes с помощью ультразвука полностью отделить оставшиеся мембраны и цитоскелета от aggresomes. При увеличении общей чистоты, общее количество событий вторжения, зафиксированного на большой aggresomes маУ быть увеличена 5. Если ограниченное определение из предложенных 3-фазный сахарозы является достаточным для aggresomes других видов белка должна быть проверена, в этом смысле протокол изложенные здесь следует рассматривать в качестве отправной точки для индивидуальной оптимизации. Очищенный aggresomes оказались весьма надежными в наших руках, дополнительные шаги стирки (без моющих средств), чтобы устранить следы сахарозы не значительно уменьшить общий выход.

В предыдущей публикации мы рассказали, что олигомер сборки DISC1 зависит от различных областей мультимеризацию в С-концом 4 (рис. 4). Мы выбрали этот фрагмент для рекомбинантного растворимого выражение в E. палочки и последующих и Ni-NTA очистки. Чтобы следить за его мультимеризацию и сравнить его клетки инвазивность с описанным клеточного белка, как инвазивные α-синуклеина, мы обозначили DISC1 (598-785) с флуоресцентным красителем DyLight594, и сравнил ееклеточных инвазивность с одинаково помечены α-синуклеина. Клеточных инвазивности рекомбинантного DISC1 фрагмент резко возросло по сравнению с родным, полная длина DISC1 aggresomes, вероятно, из-за меньшего размера и намного выше чистота. Опять же, чистота, кажется, играет решающую роль в клеточной инвазии.

В нашем примере инвазивных aggresomes работу растворимого белка гомолог линии клеток-мишеней, который был рекомбинантно выражается в растворимые, то есть клетки-дисперсной форме. Выражение флуоресцентного белка (GFP например, или RFP) в клеточной линии получателем является преимуществом, так как позволяет колокализации инвазивных aggresomes и рекомбинантных белков в пределах клетки получателя с помощью Z-стек изображений.

Cell-инвазивной DISC1 aggresomes и многомерные фрагменты выразил и очищают от E. палочка может стать определяющей чертой белка конформационного заболевания, связанные с DISC1, DISC1opathies 15.

Поиск и устранение неисправностей:

Температура aggresome выход после очистки сахарозы градиент:

Градиента сахарозы введена в данный протокол хорошо работает с eGFP/mRFP-DISC1 (Флорида) aggresomes. Aggresomes, состоящие из других белков может быть переменных размеров, следовательно, концентрации сахарозы должна быть оптимизирована за счет других пользователей.

Вашем очистки рекомбинантных белков:

Любой бактериальных загрязнений в процессе очистки рекомбинантного белка также будут помечены в последующих шагов протокола. Чтобы избежать загрязнений, запустить белка на SDS-PAGE и убедитесь, что рекомбинантного белка не менее 95% чистой окрашиванием Кумасси-Blue. Для обеспечения высокого качества и урожайности, протокол должен быть оптимизированы для каждого индивидуального белка.

Температура маркировке EFтивность рекомбинантных белков:

Любые загрязнения, которые содержат бесплатные SH-групп снизит эффективную маркировку белка. Таким образом, обширная диализа и Ni-NTA основе очистки является обязательным.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Нейрон-Eranet обнаружить (BMBF 01EW1003) в СК и JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033), чтобы CKVB поддерживается грантом Forschungskommission медицинского факультета Университета Дюссельдорфа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагент имя Компания Номер в каталоге Комментарии
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093 Средний зависит от линии клетки-хозяина. Оптимальная линия клеток получателя должны быть определены пользователем.
DMEM/F-12 Invitrogen 11320-033 Средний зависит от клеточной линии получателя. Оптимальная линия клеток получателя должны быть определены пользователем.
PBS Invitrogen 14190-250
Metafectene Biontex T020-1.0 Другие реагентов трансфекции может работать как хорошо, но не были протестированы с нашим протоколом.
Ni-NTA агарозы Qiagen 30210 Эксперименты проводились с Ni_NTA агарозном от Qiagen, другие поставщики должны работать также.
ДНКазы I Roche 04716728001 Существует не нужно для РНКазы бесплатно ДНКазы в процессе очистки aggresomes.
Сахароза Sigma-Aldrich S0389
Opti-MEM Invitrogen 31985-062 Сыворотка среде без работы, а
Пенициллина / стрептомицина Invitrogen 15140122 Дополнение для SH-SY5Y и НФО среде
Номера для основных аминокислот (NEAA) Sigma-Aldrich M7145 Дополнение для SH-SY5Y среде
Трипанового синего 0,4% Sigma-Aldrich T8154 Токсичный реагент
DyLight 594 млнleimide Thermo Fisher Scientific- 46608 Снижение красителя цистеина реактивной чтобы сформировать устойчивые связи тиоэфир. Также доступен в другом цвете.
Продлить Золото с DAPI Invitrogen P36935 Это antifade mountant жидкость дал превосходные результаты в наших руках.
Коктейль ингибитор протеазы Roche 11873580001 Растворите 1 столовую в 500 мкл H 2 O для 100X решение.
Синтетический-синуклеина Сигма S7820 Сложите, как описано в тексте.
Таблица специфических реагентов.
Precellys 24 Бертен технологий 03119.200.RD000 Мы не тестировали другие механические однороднойnizers кроме этого. Другие моющие средства бесплатный метод гомогенизации может работать как хорошо, но не были испытаны для этого протокола.
5301 Концентратор (SpeedVac) Eppendorf 5301 000.210 Только необходимо, если белка должно быть сосредоточено.
LSM 510 и AxioVision Apotome2 Zeiss См. каталог производителей Оба микроскопы питать способность выполнять Z-стек изображений. Это является предпосылкой для твердых и серьезной оценки вторжения событий.
Клеточные культуры пластмассы Nunc 10 см блюд # 172958, 24-луночные планшеты # 142475 Использование различных пластмасс могут повлиять на взаимодействие рекомбинантных белков или aggresomes и пластмассовых поверхностей. Мы не тестировали материалы, кроме тех, описано здесь.
Таблица конкретных материалов и оборудования.
Номер Буфер имя содержание Комментарии
1. Бактериальные среднего роста 16 г / л Bacto Триптон, 10 г / л Bacto дрожжевого экстракта, 5 г / л NaCl, 5 мМ-аргинин-HCl, 5 мМ MgSO4, 100 мкг / мл carbencillin, 35 мкг / мл хлорамфеникола Рост бактерий к OD 600: 0.6-0.8 индуцируют экспрессию с 1 мМ IPTG.
2. Бактериальные буфера ресуспендирования 50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ PMSF, 1% TX-100, 250 мкг / мл лизоцима, 20 мМ MgCl 2 и 400 мл U/50 ДНКазы I Resupend бактериальных гранул из 1 л Овеrnight культуры в 50 мл буфера ресуспендирования.
3. Буфера экстракции белков 50 мМ Трис рН 8,0, 5 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 8 М мочевины и 10 мм б-ME
4. Ni-NTA колонке промывочного буфера 50 мМ Трис рН 8,0, 5 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 8 М мочевины и 10 мм б-ME, 12 мМ имидазола Измененный буфере для экстракции с 12 мМ имидазола добавил.
5. Ni-NTA колонке буфера элюирования 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, 8 М мочевины, 1 мМ PMSF, 5 мМ ЭДТА и 10 мМ б-ME Элюирования буфер содержит 10 мМ б-ME, которая диализу позже.
6. PBS 8 г / л NaCl, 0,2 г / л KCl, 1,44 г / л Na 2 HPO 4, 0,24 г / л KH 2 PO 4, приспособиться к рН 7,4
7. Маркировка буфер PBS, содержащем 5 мМ TCEP
Таблица рецептов.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  2. St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
  3. Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
  4. Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).
  5. Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
  6. Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
  7. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
  8. Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
  9. Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
  10. Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
  11. Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
  12. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
  13. Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
  14. Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
  15. Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DISC1konDISC1

Похожие статьи