Методическая статья

Анализ SNARE-опосредованного слияния мембран помощью ферментативного анализа слияния клеток

DOI:

10.3791/4378

⸱

19 октября 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали анализ слияния клеток, который количественно SNARE-опосредованных событий слияние мембран активированным выражение β-галактозидазы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействий SNARE (ы oluble N-этилмалеимид-чувствительных факторов повторного ttachment белком рецептор) белков на пузырьках (V-SNAREs) и на цели мембран (т-SNAREs) катализирует внутриклеточные везикулы слияния 1-4. Восстановление анализы имеют важное значение для рассечения механизмов и регуляции обмена SNARE-опосредованного слияния мембран 5. В анализе слияния клеток 6,7, Малый белки экспрессируются эктопически на поверхности клетки. Эти "перевернул" SNARE белков диск клетка-клетка слияния, демонстрируя, что SNAREs достаточно, чтобы слиться клеточных мембран. Поскольку анализ слияния клеток основана на микроскопическом анализе, он менее эффективен, когда используется для анализа нескольких В-и Т-SNARE взаимодействия количественно.

Здесь мы описываем новую анализа 8, что количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы. ДваКомпоненты Tet-Off экспрессии генов системы 9 используются в качестве считывания системы: тетрациклин-контролируемой трансактиватор (TTA) и репортера плазмиды, который кодирует ген LacZ под контролем тетрациклин-ответ элемент (TRE-LacZ). Мы трансфекции TTA в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернутый V-SNARE белков на поверхности клетки (В-клетки) и трансфекции TRE-LacZ в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернулся T-SNARE белков на поверхности клетки (Т-клетки) . SNARE-зависимых слияние В-и Т-клеток приводит к связыванию TTA, чтобы TRE, транскрипционной активации LacZ и экспрессии β-галактозидазы. Активность β-галактозидазы количественно использованием колориметрическим методом по поглощению при 420 нм.

Пузырька связанных мембранных белков (вампиры) являются V-SNAREs, которые находятся в различных пост-Гольджи везикулярного отсеков 10-15. Выражая 1 вампиров, 3, 4, 5, 7 и 8 на том же уровне, мы сравниваем их слияние мембрандеятельности с использованием ферментативного анализа слияния клеток. На основании спектрометрических измерений этого анализа предлагается количественный подход к анализу SNARE-опосредованного слияния мембран и высокой пропускной исследований.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток и трансфекция

  1. COS-7 клетки культивировали в среде Игла изменения Орла (DMEM) с добавлением 4,5 г / л глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
  2. Трансфекции плазмиды делается с Lipofectamine в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (Invitrogen).

2. Флуоресценция Микроскопический анализ сотовых Выражение SNARE поверхности

  1. За день до трансфекции, 3 × 10 4 COS-7 клеток высевали на стерильные 12-мм стекла покровные (Fisher Scientific), содержащийся в 24-луночных планшетах.
  2. Для V-клеток в каждой лунке, 0,25 мкг плазмиды, кодирующей TTA (pTet-Off, CLONTECH) является котрансфицировали с 0,25 мкг плазмиды, которые выражают перевернулся вампиров.
  3. Для Т-клеток в каждой лунке, 0,25 мкг плазмиды, кодирующей TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) является котрансфицировали с 0,25 мкг каждой из плазмид, которые выражают перевернулся SNAP-25 и syntaxins 1 или 4.
  4. Через 24 часа после тransfection, клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS + + (PBS дополнена 0,1 г / л CaCl 2 и 0,1 г / л MgCl 2) в течение 10 мин, а затем блокируется в 10% FBS в PBS + + в течение 30 мин.
  5. Клетки инкубируют в течение 1,5 часа с анти-Myc моноклональных антител 9Е10 (чистый культуре супернатанта гибридомы).
  6. После четырех промывок PBS + +, клетки инкубировали в течение 1 часа с FITC-конъюгированные вторичные антитела (Jackson Immunoresearch Laboratories) в разведении 1:500.
  7. После четырех промывок PBS + +, меченых клеток установлены в Продли Золотой antifade реагента (Invitrogen).
  8. Конфокальная изображений, собранных на лазерном Olympus сканирующей конфокальной микроскопии. Изображения обрабатываются с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop.

3. FACS анализ сотовых Выражение SNARE поверхности

  1. За день до трансфекции, 2 × 10 5 COS-7 клетки высевают в каждую лунку 6-луночных планшетах.
  2. Через 24 часа после траnsfection с перевернулся SNARE, pTet-Off и PBI-G плазмиды, клетки фиксировали 1% параформальдегидом в PBS + + в течение 15 мин, а затем блокируется в 10% FBS в PBS + + в течение 15 мин.
  3. Клетки инкубировали с анти-Myc моноклональных антител 9Е10 в течение 60 мин.
  4. После трех промывок PBS + +, клетки помечены FITC-конъюгированных вторичных антител (1:200 разведение) в течение 45 мин.
  5. После трех промывок PBS + +, клетки соскабливают плит с сотовым скребком.
  6. 15000 клеток анализировали с помощью цитометра FACSCalibur потока (BD Biosciences). Средняя интенсивность флуоресценции каждого образца, полученные с использованием CellQuest Pro программное обеспечение.

4. Ферментативный анализ слияния клеток

  1. За день до трансфекции, 1,2 × 10 6 COS-7 клетки высевают в каждой 100-мм блюдо культуры ткани, и 2 × 10 5 COS-7 клетки высевают в каждую лунку 6-луночных планшетах.
  2. Для V-клеток, 0,5 - 5 мкг каждого из flippред VAMP плазмиды котрансфицировали с 5 мкг pTet-офф в клетках в каждой 100-мм культуры блюдо. Управление клетки котрансфицировали с пустой вектор pcDNA3.1 (+) и pTet-офф. Для предотвращения N-гликозилирования из 1 вампиров, 4, 5, 7 и 8, tunicamycin (10 мкг / мл), входит в культуру клеток среды при трансфекции.
  3. Для Т-клеток в каждую лунку 6-луночные планшеты, 1 мкг перевернулся SNAP-25 плазмиды и PBI-G являются котрансфицировали с 0,5 мкг перевернулся syntaxin1 плазмиды или 0,05 мкг перевернулся syntaxin4 плазмиды.
  4. Через 24 часа после трансфекции, V-клетки отделяются от культуры блюд с ферментом без клеточная диссоциация буфер (Invitrogen). Отдельный клетки считаются с гемацитометре и ресуспендировали в HEPES-буфера DMEM с добавлением 10% FBS, 6,7 мкг / мл tunicamycin и 0,67 мМ DTT.
  5. 4,8 × 10 5 ресуспендировали V-клеток в каждую лунку добавляют, уже содержащий Т-клеток.
  6. После 6, 12 или 24 часа в сутки крыса 37 ° С в 5% СО 2 , выражение β-галактозидазы измеряется с помощью β-галактозидазы ферментов тест-системы с корреспондентом буфера для лизиса в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (Promega). Короче говоря, клетки дважды промывали PBS, а затем лизируют в буфере для лизиса Reporter. Клеточные лизаты смешивают с равным объемом Анализ 2 × буфера. В пустой управления, буфер Reporter Лизис смешивается с Пробирной 2 × буфера.
  7. Через 90 мин, колориметрические реакцию останавливают добавлением 1 М карбоната натрия.
  8. Поглощение при 420 нм измеряют с помощью HITACHI 100-40 спектрофотометр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для разработки количественного анализа слияния клеток, мы воспользуемся сильной активации транскрипции путем связывания TTA, чтобы TRE. В отсутствие TTA, транскрипцию гена LacZ в TRE-LacZ молчит. Когда TTA присутствует, он связывается с TRE и активирует транскрипцию LacZ. Рисунке 1 показана схема ферментативного анализа слияния клеток. TTA трансфицируют в V-клетки, которые экспрессируют V-SNARE белков на поверхности клетки, и TRE-LacZ трансфицируют в Т-клетки, которые...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оригинальный анализ слияния клеток 6 определяет SNARE-опосредованных событий слияние клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы опишем инновационного анализа, который количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы и спектрометрических измерений. С помощью этого анализа, мы регулярно анализируем 15 - 20 В-и Т-SNARE сочетания в одном эксперименте. Использование проточной цитометрии для оценки SNARE выражении на поверхности клетки, мы титровать уров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается запуск средств из Университета Луисвилл и CA135123 из Национальных институтов здравоохранения (CH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагентов и оборудования Компания Номер в каталоге
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 клеток ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-
PBI-G Clontech 6150-1
липофектамина Invitrogen 18324-012
Фермент без клеточная диссоциация решения Invitrogen 13151-014
Кролик анти-TET Repressor поликлональных антител Millipore AB3541
FITC-конъюгированные осла анти-мышиных IgG (H + L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Олимп FV1000
FACSCalibur проточной цитометрии BD Biosciences
β-галактозидазы ферментов тест-системы с корреспондентом буфера для лизиса Promega E2000
Модель 100-40 UV-VIS спектрофотометр Hitachi C740843

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238(2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tet OffVAMPCOS 7

Похожие статьи