В Vivo Imaging Systems (ИВИС) Обнаружение Нейро-инвазивная Вирус энцефалита

Allison Poussard; Michael Patterson; Katherine Taylor; Alexey Seregin; Jeanon Smith; Jennifer Smith; Milagros Salazar; Slobodan Paessler

doi:10.3791/4429

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo Imaging Systems (ИВИС) Обнаружение Нейро-инвазивная Вирус энцефалита

20.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4429

⸱

2 декабря 2012 г.

Allison Poussard^*¹ , Michael Patterson^*¹ , Katherine Taylor¹ , Alexey Seregin¹ , Jeanon Smith¹ , Jennifer Smith¹ , Milagros Salazar¹ , Slobodan Paessler¹

¹Experimental Pathology, University of Texas Medical Branch

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Используя люциферазы и в естественных систем визуализации (ИВИС) в качестве нового средства выявления заболевания до появления клинических конечных точках события происходят. ИВИС позволили нам визуализировать в реальном времени вторжения вирусов энцефалита в течение нескольких дней, обеспечивая более точное заболевание моделью для будущих исследований. Это также позволило нам выявить потенциальные защитные свойства противовирусных препаратов и вакцин быстрее, чем в настоящее время применяются животных моделях. Возможность использования отдельных животных в течение нескольких моментов времени обеспечивает уменьшить животное требований, затрат и общей заболеваемости на животных использовались обеспечения более гуманного и более научными средствами болезни исследовании.

Аннотация

Современные достижения в области технологий визуализации способствовать дальнейшему развитию и совершенствованию на пути вирусных исследований выполнена. Первоначально предложенный Расселом и Burch в 3Rs Юма (замена, восстановление, уточнение), использование животных моделей в научных исследованиях находится под постоянным давлением для выявления новых методологий для уменьшения использования животных при одновременном повышении научной точностью и скоростью. Одна из основных задач для директора Юма, однако, в том, как обеспечить исследования являются статистически точным при одновременном снижении животных заболеваемости и общего числа. Исследования Эффективность вакцины в настоящее время требуют большого количества животных для того, чтобы считать статистически значимым и часто приводит к высокой заболеваемости и смертности конечные точки для определения иммунной защиты. Мы использовали в естественных систем визуализации (ИВИС) в сочетании с ферментом светлячков биолюминесцентного постепенно отслеживать вторжения в центральной нервной системе (ЦНС) по ENCEphalitic вируса в мышиной модели. Как правило, болезнь протекает относительно медленно, однако репликация вируса происходит быстро, особенно в ЦНС, и может привести к часто летальный исход. После интраназального заражения мышей с TC83-Luc, ослабленный венесуэльского конского энцефалита штамма вируса изменены, чтобы выражает гена люциферазы, мы находимся в состоянии представить себе репликации вируса в мозг по крайней мере за три дня до развития клинических симптомов заболевания. Используя CNS вторжением в качестве ключевой энцефалита конечной точкой развития болезни мы в состоянии быстро определить терапевтическую вакцину и защиты от TC83-Люк инфекции до появления клинических симптомов. С технологией ИВИС мы можем продемонстрировать быстрое и точное тестирование препарата терапии и вакцин при одновременном сокращении численности животных и заболеваемости.

Протокол

1. Подготовка животных

Животное прибытия: По прибытию на уровень животного биобезопасности 2 (ABSL2) объектов, позволяют животным не менее 2 дней, чтобы привыкнуть к новой среде. После этого периода отдыха, осмотра животных, чтобы оценить их здоровья и общего физического облика.
1. При использовании флуоресцентных журналистам важно, чтобы разместить всех животных предметов на люцерну бесплатно диету, чтобы ограничить количество GI автофлуоресценции и фонового сигнала.
Бритье животных: Для улучшения биолюминесцентного сигнала обнаружено от черепно области во время съемки; брить головы всех животных. Anesthetize животных смесью кислорода и испаряется изофлурана. Как только животные полностью под наркозом, использовать электрические ножницы для бритья головы. После завершения бритья, вернуть животных в их клетки и наблюдать за полное восстановление от последствий наркоза.
Bio Медик данныхСистемы (BMDS) транспондера вставки (состоится после бритья мышей, в то время как животные полностью под наркозом): Для менее инвазивные средства для отслеживания температуры имплантата запрограммированных BMDS беспроводной транспондер подкожно в область спины каждой мыши. Эти транспондеры позволяют беспроводной идентификации и регистрации температуры. После имплантации транспондера, применяются ветеринарно-класс ткани клеем к ране.
Базовая коллекция: Перед инфекции, записывать температуру и вес базовой для всех животных. Сбор крови для уменьшения налета нейтрализации (PRNT) анализ через ретроорбитального (RO) кровотечение в то время как мыши под анестезией. После сбора крови, применяют ветеринарные мазь с антибиотиком глаза, чтобы уменьшить возможные вторичные бактериальные инфекции. Данная базовая коллекция должна быть завершена с учетом в несколько раз животные находятся под наркозом из-за стресса на мышах. Будущие коллекции RO сhould быть завершена после съемки, в то время как мыши все еще находится под наркозом. Максимальная крови, собранной из RO должно быть около 200 мкл.
Инфекция: Место мышей под наркозом, как описано выше. Инокулировать через интраназально с применением дозы 5х10 ⁶ до 5x10 ⁷ БОЕ TC83-люциферазы в общем объеме 40 мкл разбавляют фосфатным буферным раствором (PBS) посредством интраназального заражения. После инфекции, поместите мышь в пределах их жильем клетку и наблюдать восстановление.

2. Животное изображений

Предупреждение: Держите мышь в рамках своих жилищных единиц, шкаф биологической безопасности (BSC), или XIC окна сдерживания во все времена. Утвержденный БББ для этого протокола являются Тип Класс II B1 или B2.

Inject всех животных с 10 мкл на грамм массы тела внутрибрюшинно (IP) люциферин в концентрации 15 мг / мл.
1. Мышей, получавших Ampligen должны быть injecteIP D в дозе 12,5 мг / кг массы тела при -4 часа после инфицирования или +48 часа после инфицирования на основе их группы.
До инъекции люциферин, отделить мышей на группы по три для обеспечения правильной посадки в XIC-3 сдерживания окно.
1. Для всех изображений, использование глазных мазей / смазкой, чтобы предотвратить высыхание роговицы в течение всей процедуры.
Откройте программу LivingImage и нажмите Initialize для подготовки изображений коробке; набор автоматически экономии, время экспозиции, чтобы автоматически (время экспозиции на авто это новая функция программного обеспечения LivingImage 3.2 и новее), просматривать поле C, и фильтр, чтобы открыть; поле зрения основана на количество мышей вы изображений и фильтр может быть оптимизирован, которые необходимы для других проектов визуализации.
Убедитесь, что воздушный фильтр уголь еще не истек, кислородный бак полон, и изофлурана резервуар заполнен. Поместите небольшие полоски изоленты в XIC-3 яsolation ящик, который помогает с сокращением движения животных во время съемки.
Inject мышей с IP люциферин, как описано в разделе 2.1 и место в Isoflurane камеры индукции (при открытой крышке) в течение 3-5 мин.
Через 5 мин, закрыть крышкой индукции камеру и начать поток изофлурана. Анестетика работает на примерно 3-5%, при этом установленный расход кислорода при приблизительно 2,0 л / мин. После полного бессознательного ждать еще 30 сек и передачу мышей XIC-3 изоляции коробки. Убедитесь, что кабинет биобезопасности используются позволяет для безопасной очистки изофлюрана так как эта процедура будет включать в себя потерю изофлуран от индукции камеры (блок ИВИС содержит свой собственный пассивный ярмарка канистры и XIC-3 сдерживания окна напрямую подключается к в / из розетки для обеспечения содержащейся анестетика потока).
1. Передача мышей основе чипа / номер группы в XIC-3 изоляции коробки с изофлуран разъем прилагаетсяг открыть. Установите мышей, чтобы они изложены в лежачем положении грудины с руководителями осторожно опираясь на полоски ленты.
Протрите XIC окна сдерживания этанола, спрей руки и нижнюю часть XIC-3 с cavicide, и передать в камеру ИВИС изображения. Снова наркоз для сдерживания окно однажды внутри блока изображения.
Через 10 мин после инъекции люциферин, изображения мышей через живой образ программного обеспечения.
После первоначального изображения с открытым фильтром, инициировать DLIT 3-мерной визуализации с использованием анализа последовательностей изображений и мастер установки для люциферазы светлячка биолюминесцентного. Это изображение процесс займет 4-5 мин и должна быть завершена в поле зрения соответствующих по количеству мышей лучшего.
1. Экс-анализ естественных условиях можно следующим вскрытия и сбор мозга. Поместите мозга на стерильную чашку Петри, капельно 50-100 мкл складе люциферин на вершине, и место в IMAненности ВИЧ варьируется окно.
Завершение второго открытого фильтра изображение на 15-17 мин после инфицирования после завершения визуализации DLIT. Обеспечить анализ последовательности выключен, и в поле зрения настройки фильтров и возвращается к предыдущим настройкам.

3. Вернуться мышах и анализ данных

Выключить изофлурана испаритель и передать XIC окна сдерживания обратно в шкаф биологической безопасности.
Поместите мышь обратно в свою жилищную единицу, закрыть сверху, опрыскивать внешний вид с соответствующим дезинфицирующим средством и местом обратно на корпус стойки.
1. Убедитесь, мыши полностью выздоровели от наркоза.
Повторите описанную выше процедуру в качестве эксперимента требуется до визуализации завершен.
Лечить BSC, выключить оборудование, и передать все данные за пределами расположения лабораторию для дальнейшего анализа.
Анализ данных и создания 3-мерных изображений, основанные на результатах ИВИС ИМПлизинг LivingImage программного обеспечения.
1. Убедитесь, что изображение в правильной ориентации и освещенности / цветовой баланс установлен. В палитре инструментов варианты включают настройки изображения, исправительных учреждений, изображения информации и ROI Tools.
2. Использование ROI формы для определения конкретных уровней сигналов основан на месте.
3. Реконструкция рельефа поверхности, чтобы выделить корпуса мыши, инициализировать 3D-реконструкция DLIT, а также использовать линейную подходят для установки органа карты топографические реконструкции.
Далее вирусного анализа титрования может быть завершена путем сбора крови и органов. Титрование в этом исследовании была выполнена путем гомогенизации тканей головного мозга в модифицированной орлов среде (MEM). Гомогенат серийно разводили и мы инфицированы 6 хорошо пластину Vero клеток в течение 1 часа. Клетки были покрыты 1,5% agarose/2xMEM наложения и инкубировали в течение 2 дней при температуре 37 градусов. Клетки фиксировали 10% формалином в течение 30 мин и окрашиваликристаллический фиолетовый.