Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование Reverse Phase белка массивы (RPPA) изучить Изменение экспрессии белков в отдельных рака почки сотовых

33.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50221

⸱

22 января 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Edinburgh Urological Cancer Group, University of Edinburgh, 2School of Medicine, University of St Andrews, 3Division of Pathology, University of Edinburgh, 4MRC Human Genetics Unit, MRC IGMM, University of Edinburgh, 5Department of Pathology, Western General Hospital, 6Breakthrough Breast Cancer Research Unit, University of Edinburgh, 7St Bartholomew's Cancer Institute, Experimental Cancer Medicine Centre, Queen Mary University of London

В этой статье

Краткое содержание

RPPA позволяет экспрессии белка сотен образцов, напечатанных на нитроцеллюлозные слайды на допрос одновременно, с использованием флуоресцентно меченых антител. Этот метод был применен для изучения влияния препарата неоднородности лечения в течение ясно рак почек.

Аннотация

В настоящее время не существует лечебного лечения метастатического светлоклеточного почечно-клеточного рака, наиболее распространенного варианта заболевания. Считается, что ключевым фактором резистентности к этому лечению является молекулярная сложность заболевания 1. Таргетная терапия, такая как ингибитор тирозинкиназы (ИТК)-сунитиниб, была использована, но только 40% пациентов реагируют на терапию, причем у подавляющего большинства этих пациентов рецидив наступает в течение 1 года 2. Таким образом, вопрос о внутренней и приобретенной резистентности у пациентов с почечно-клеточным раком является весьма актуальным 3.

Для изучения устойчивости к ИТК, с конечной целью разработки эффективных, персонализированных методов лечения, требуется последовательное исследование тканей после определенного периода таргетной терапии, подход, который оказался успешным при хроническом миелоидном лейкозе 4. Однако применение такой стратегии при почечно-клеточном раке осложняется высоким уровнем как межопухолевой, так и внутриопухолевой гетерогенности, что является особенностью почечно-клеточной карциномы5,6, а также других солидных опухолей 7. Межопухолевая гетерогенность, обусловленная транскриптомными и генетическими различиями, хорошо известна даже у пациентов со схожими проявлениями, стадией и степенью опухоли. Кроме того, очевидно, что в ПКР наблюдается большая морфологическая (внутриопухолевая) гетерогенность, которая, вероятно, представляет еще большую молекулярную гетерогенность. Детальное картирование и категоризация опухолей ПКР с помощью комбинированного морфологического анализа и классификации Фурмана позволяет выбрать репрезентативные области для протеомного анализа.

Анализ RCC8 на основе белка привлекателен из-за его широкой доступности в патологических лабораториях; однако его применение может быть проблематичным из-за ограниченной доступности специфических антител 9. Из-за того, что Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) работает методом дот-блоттинга, специфичность антител должна быть предварительно подтверждена; В связи с этим строгий контроль качества используемых антител имеет первостепенное значение. Несмотря на это ограничение, формат блоттинга позволяет проводить миниатюризацию анализа, что позволяет печатать сотни образцов на одном предметном стекле из нитроцеллюлозы. Затем напечатанные слайды могут быть проанализированы аналогично западному анализу с использованием целевых специфических первичных антител и флуоресцентно меченных вторичных антител, что позволяет проводить мультиплексирование. Дифференциальная экспрессия белка во всех образцах на предметном стекле может быть проанализирована одновременно путем сравнения относительного уровня флуоресценции более экономичным и высокопроизводительным способом.

Протокол

1. Определение морфологических и молекулярных опухоли гетерогенность

  1. Опухоль удалена от -80 ° C морозильнике и хранится на сухом льду.
  2. Разделите опухоли на секции примерно на 1 см 3. Карта исходное положение каждой опухоли раздел по отношению друг к другу и этикетку с уникальным именем. Магазин образцов в отдельных криопробирки при -80 ° С до готовности к употреблению.
  3. Пальто образцов в октябре и сократить в криостат при -22 ° C.
  4. Образцы окрашивали гематоксилином и эозином counterstaining метод.
  5. Микроскопический анализ замороженных срезах, чтобы убедиться, что они имеют ccRCC природы, жизнеспособной опухоли и для сортировки (низкий класс, высокий класс или смешанной низкого / высокого класса, сложно дифференцировать Фурман классы с 1 по 4 на замороженный участок). Рисунок 1 & B (H & E окрашивание высокого низкого и смешанного класса).
  6. Выберите до 4 образцов из каждой морфологически различные области внутри каждой опухоли для экстракции белков.

2. Белки извлечения из образцов опухолей

  1. Вырезать опухоль выборки из октябре
  2. Место 50-75 мг ткани в 2 мл пробирки с 990 мкл буфера для лизиса [50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ EGTA (рН 8,5), 150 мМ NaCl] дополнена апротинин (Sigma A6279) (10 мг / мл), смесью для ингибирования фосфатаз 2 (Sigma, P5716), смесью для ингибирования фосфатаз 3 (Sigma, P0044) и коктейль ингибиторов протеаз (Roche, 11836153001).
  3. Добавить один 5 мм стальной шар в каждую пробирку и гомогенизируют при 50 Гц в течение 5 мин дважды, используя TissueLyser, проверка уровня гомогенизации после каждого 5-минутного периода.
  4. Передача гомогенизированный образец нового 2 мл трубки с помощью пипетки выходя из стальной шарик позади.
  5. Добавить 10 мкл Тритон Х-100 в каждом образце до центрифугирования при 13000 х г в течение 30 мин при 4 ° C.
  6. Передача супернатантов на свежий труб микроцентрифуге.
  7. Определение концентрации белка использовании BCA анализа (рис. 2).
  8. Нормализация концентрации белка в концентрации 1 мг / мл.

3. Антитела проверки

  1. Подготовка образцов белка (выдержка из подходящих линий клеток или тканей) для вестерн-блот и работают на 10% SDS-PAGE гель.
  2. Передача образцов на нитроцеллюлозные мембраны в течение ночи при 4 ° C.
  3. Блок мембраны в Li-Cor Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Развести первичных антител в Li-Cor Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) на производителей рекомендуется разбавление обычно 1 на 1000.
  5. Инкубируйте мембраны в первичных антител в течение ночи при 4 ° C.
  6. Убедитесь, что на 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 1 мл Tween20 / 1л PBS).
  7. Вымойте мембраны в PBS-T при комнатной температуре в течение 5 мин (x3).
  8. Развести флуоресцентно-меченых вторичных антител в Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) 0,01% ДСН при разведении 1:10000 (1,5 μl/15 мл).
  9. Инкубируйте мембраны в среднемАнтитела при комнатной температуре в течение 45 мин при осторожном встряхивании - это важно для защиты мембраны от света до тех пор, как он был окончательно сканирования.
  10. Вымойте мембраны в PBS-T при комнатной температуре в течение 5 мин (x3), сохраняя мембраны в темноте.
  11. Вымойте мембраны в PBS при комнатной температуре в течение 5 мин (x3), чтобы удалить остатки Tween20, опять поддержанию мембраны в темноте.
  12. Ли мембраны квартира на кусок фильтровальной бумаги в темноте и дайте высохнуть на воздухе - позволяет мембрана высохнуть может усилить сигнал и снизить фон, но сделать его бесполезным для зачистки и повторного зондирования.
  13. Сканирование мембраны на сканер Odyssey Licor. Держите мембраны в темноте до тех пор, как он был отсканирован.
  14. Только выберите антитела, которые генерируют одну преобладает группа при правильной молекулярной массой. Рисунке 3 приведены примеры допустимых и недопустимых антител для использования с RPPA.

4. RPPA Printing

  1. Белки лизатов были замечены на нитроцеллюлозные-стекла с покрытием слайды (Fastslides-ватман) с помощью Microgrid II роботов корректировщик. Слайдах использованы содержал 2 колодки, на котором образцы были замечены. Каждая площадка была замечена с идентичными образцами, в данном случае 100 образцов. Другие доступные форматы включают в себя 1, 8 и 16 слайдов площадку. Чем выше число площадок меньшего количества образцов, которые могут быть выставлены на каждого.
  2. Серия из пяти 2-кратные разведения были сделаны из каждого образца и каждый из них был затем обнаружен в трех экземплярах (в результате чего в общей сложности 15 мест в образце).

5. RPPA детекции белка

  1. Мокрый слайды более Licor блокирующего буфера (разбавленный 50:50 в PBS). Выдержите при комнатной температуре в течение 1 часа на качающейся платформе.
  2. Подготовка 800 мкл первичных антител в Licor блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) в нужной концентрации и держать на льду.
  3. Установите слайды либо (I) один клип Chip кадровили (II) четыре "FastFrame" отсек держателя слайдов, так что уплотнение образуется между горкой и инкубационной камере.
  4. Удалите остатки буфера из колодцев и добавить 600 мкл первичных антител в соответствующие лунки.
  5. Поместите слайд-шоу и камеру в герметичный мокрого окна и инкубировать на качающейся платформе течение ночи при 4 ° C.
  6. Убедитесь, что на 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 100 мкл Tween 20/100 мл PBS).
  7. Удалить слайды из холодной комнате и осторожно удалить первичных антител из каждой лунки.
  8. Добавить 600 мкл PBS-T и мыть слайды на качающейся платформе при комнатной температуре в течение 5 мин (X3).
  9. Подготовка флуоресцентно-меченых вторичных антител путем разбавления в Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) 0,01% SDS в разведении 1:2000 (1 мкл / 2 мл) в первой инстанции.
  10. Удалите буфер из колодцев и добавить 600 мкл флуоресцентно-меченого вторичного антитела к соответствующим скважин. Инкубируйте вторичные антитела при комнатной температуре в течение 45 мин при осторожном встряхивании - этоВажно, чтобы защитить мембрану от света до тех пор, как он был окончательно сканирования.
  11. Удалить вторичные антитела из хорошо и кратко стирки (x3) в 600 мкл PBS-T при комнатной температуре. Удалить слайд с носителем, трансфер в подходящую емкость и промыть более PBS-T в течение 15 мин, сохраняя мембраны в темноте.
  12. Удалить PBS-T и дальнейшей промывки мембранных PBS при комнатной температуре в течение 15 мин для удаления остаточных Твин-20, снова поддержанию мембраны в темноте.
  13. Высушите Fastslide в 50 ° C духовке в течение 10 мин, а затем сканировать на Li-Cor Odyssey сканера. Держите слайд в темноте, пока не будут отсканированы.
  14. Сканирование слайдов при 680 нм и / или 800 нм в зависимости от вторичными антителами / Антитела используются. В течение двух-определение цвета всегда использовать высоко перекрестно адсорбированных вторичными антителами, чтобы минимизировать перекрестную реактивность. Тщательный отбор первичных и вторичных антител, необходимых для двухцветного обнаружения. Первостепенное значение имеет выборразличных видов хозяев (например, кроликов и мышей) для двух первичных антител. Это позволяет дискриминация анти-кролик и анти-мышиных вторичные антитела, которые помечены краской с легко различимыми спектров излучения.
  15. Файлы изображений сохраняются как. Файлы TIFF. Рисунке 4 (изображение сканируемых файлов).

6. Анализ данных

  1. Запустите программу MicroVigene (VigeneTech, Карлайл, штат Массачусетс, США).
  2. Открыть. TIFF-файл, содержащий изображение сканирования слайдов RPPA.
  3. Выберите предопределенный файл шаблона, который будет иметь сетку для наложения на изображение слайда RPPA.
  4. Нажмите Определить регионы (ROI) кнопки, чтобы вызвать Grid.
  5. Установите сетку на местах RPPA. Рис. 6а (изображение сетки на изображении).
  6. Нажмите кнопку Выбрать все, чтобы выделить все ROI.
  7. Нажмите кнопку Найти все. MicroVigene будет автомматически найти ROI, найти места, вычитание фона, удалить пыль и количественно пятна.
  8. Нажмите на кривой Посмотреть разведение кнопку, чтобы открыть результаты для всех образцов на слайде RPPA.
  9. Нажмите кнопку Сохранить, разведение данных.
  10. Поскольку каждый образец напечатан на 5 баллов разбавления каждый в трех экземплярах есть 15 очков, чтобы проанализировать, что снижает риск ошибок и улучшает качество подгонки кривой. MicroVigene производит 4-параметров логистической логарифмической модели "Supercurve" алгоритм (рис. 6б), которая включает в себя все места, чтобы произвести сигмовидной кривой антиген-антитело кинетики. Предполагается, что тот же антиген-антитело кинетику связывания происходит в каждом образце месте, даже в разных образцах, таким образом, принимая все пятна на массив, чтобы соответствовать общей кривой ответ может повысить доверие кривой 10,11
    Y = + ((BA) / (1 + Е (C * D-Ln (X)))
    где х dilutioп фактор и Y является интенсивность сигнала.
    Образцы могут быть сравнительный анализ с помощью y0 значение, которое в нашем анализе соответствовало значению у в середине Х значения после преобразования тех, на supercurve.
  11. Экспорт данных в Microsoft Excel и земельный участок y0 как показано на рисунке 7.
  12. Внутриопухолевые дисперсии белка рассчитывается отдельно для необработанных и обработанных пациентов в рамках ANOVA. Разница распределения объединения данных из всех анализируемых белков сравнивали теста Манна-Уитни (МВт). Внутриопухолевые отклонений для отдельных белков сравнивали с помощью F-теста, где предположения нормальности и гомоскедастичность, состоявшихся соответственно оценивается с помощью Lillefours и Fligner испытаний; ложных открытий (FDR) коррекция была применена 12. Дифференциальная экспрессия белка между необработанных и обработанных образцов пациентов был протестирован для каждого белка использованием Стьюдента-тест, где нормальность и гомоскедастичность предположенииы были выполнены, в противном случае MWT было выполнено; FDR был применен комбинированный над значениями Т-тест и MWT 12. Значение экспрессии белка и корреляции Пирсона дисперсии для белков были оценены с использованием стандартного подхода [R ссылка] и FDR применяется 12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Пример отсканированных слайдов RPPA можно увидеть на рисунке 4 (I) и с 680 и 800 нм каналов показано на рисунке. Разделение изображений по длине волны, рисунок 4 (II) позволяет каждой площадки на слайде RPPA должны быть проанализированы и индивидуальных экспрессии белка определяется рисунке 4 (III). Как видно на рисунке 4 (III) выражение индивидуальных белков через образцов является уникальным с Gelsolin имеющих высокий уровень экспрессии по слайду по с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод RPPA представленные здесь представляет собой высококачественную альтернативу пропускной способности широко используется, но сравнительно низкой пропускной западной техники блот-анализа белка. Метод позволяет сотни образцов, чтобы быть полуколичественным анализируются и сравниваются одновременно позволяет прямое сравнение ключевых белков в широком выборе клеточных линий и тканей. Мультиплексирование с различными видами антитело дополнительно увеличивает мощность методика, позволяющая нескольким антитела, которые бу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Работа авторов FCO, DF, JN, DJH и GDS упомянутых выше финансируется за счет главного офиса ученый, номер гранта: ETM37 и при поддержке Cancer Research UK экспериментальный центр медицины Рак. Работа AL финансируется за счет Королевского колледжа хирургов в Эдинбурге Robertson Trust, Мелвилл целевой для ухода и лечения рака и Совет по медицинским исследованиям. IO при поддержке Королевского общества Эдинбурга стипендий Правительства шотландского cofunded Мари Кюри действия и Великобритании Medical Research Council. Авторы хотели бы поблагодарить SCOTRRCC со-заявителей и сотрудников за полезные обсуждения на некоторые из тем, обсуждаемых в данной статье.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге
апротинин Сигма A6279
фосфатазы ингибитором коктейль 2 Сигма P5726
фосфатазы ингибитором коктейль 3 Сигма P0044
коктейль ингибиторов протеаз Roche 11836153001
Triton X-100 Triton-X T8787
Li-Cor Odyssey блокирующего буфера Li-Cor 927-40000
TissueLyser Qiagen 85600
Microgrid II роботов корректировщик Biorobotics
FastFrame четыре бухты держатель слайдов Ватман 10486001
БЫСТРО Slide - 2-Pad Ватман 10485317
IRDye 680LT козьего анти-IgG мыши Licor 926-68020
IRDye 800CW козьего анти-IgG кролика Licor 926-32211

Ссылки

  1. Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
  2. Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
  3. Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52(2010).
  4. Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
  5. Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
  6. Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49(2012).
  7. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  8. O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557(2012).
  9. Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
  10. Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
  11. Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53(2011).
  12. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Использование Reverse Phase белка массивы (RPPA) изучить Изменение экспрессии белков в отдельных рака почки сотовых
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.