Методическая статья

Улучшенный протокол для лазерных микродиссекции человека панкреатических островков от хирургических образцах

DOI:

10.3791/50231

⸱

6 января 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лазерная микродиссекции является метод, который позволяет восстановление выделенных ячеек незначительное количество паренхимы. Здесь мы опишем протокол для приобретения человеческих панкреатических островков из операционного материала, который будет использоваться для транскриптомных исследований. Наш протокол улучшает внутреннее аутофлюоресценции человека бета-клетки, способствуя тем самым их коллекции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лазерная микродиссекция (ЛМД) - это метод, который позволяет восстановить выбранные клетки и ткани из незначительных количеств паренхимы 1,2. Препарированные клетки могут быть использованы для различных исследований, таких как транскриптомные или протеомные исследования, оценка ДНК или хромосомный анализ 2,3. Особенно сложным применением ЛМД является транскриптомный анализ, который, из-за лабильности РНК 4, может быть особенно заметен при вскрытии клеток из тканей, богатых РНКазами, таких как поджелудочная железа. Протокол микродиссекции, который позволяет быстро идентифицировать и собирать клетки-мишени, имеет важное значение в этих условиях, чтобы сократить время работы с тканями и, следовательно, обеспечить сохранение РНК.

Здесь мы описываем протокол получения бета-клеток поджелудочной железы человека из хирургических образцов для использования в транскриптомных исследованиях 5. Небольшие кусочки поджелудочной железы размером около 0,5-1см3 вырезали из здоровых краев резецированных образцов поджелудочной железы, помещали в соединение Tissue-Tek O.C.T., немедленно замораживали в охлажденном 2-метилбутане и хранили при -80 °C до разрезания. Сорок серийных секций толщиной 10 мкм разрезали на криостате при температуре -20 °С, переносили по отдельности на предметные стекла, сушили внутри криостата в течение 1-2 мин и хранили при -80 °С.

Непосредственно перед процедурой лазерной микродиссекции, срезы фиксировали в ледяном холоде, свежеприготовленный 70% этанол в течение 30 секунд, промывали 5-6 погружениями в ледяную воду, обработанную DEPC, и обезвоживали двумя одноминутными инкубациями в ледяном 100% этаноле с последующим добавлением ксилола (который используется для обезвоживания тканей) в течение 4 минут; затем срезы тканей сушили на воздухе в течение 3-5 минут. Важно, Все этапы, за исключением инкубации в ксилоле, выполнялись с использованием ледяных реагентов - модификация по сравнению с ранее описанным протоколом 6. Использование ледяных реагентов приводило к выраженному увеличению собственной автофлуоресценции бета-клеток и облегчало их распознавание. Для микродиссекции каждый раз обезвоживали четыре среза: два помещали в обернутую фольгой пробирку объемом 50 мл, чтобы защитить ткань от влаги и обесцвечивания; Оставшиеся два были немедленно микропрепарированы. Эта процедура была выполнена с помощью прибора PALM MicroBeam (Zeiss) в режиме Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC). Выполнение диссекции бета-клеток/островков из четырех криосечений занимало не более 40-60 минут. Клетки собирали в один AdhesiveCap и лизировали с помощью 10 мкл лизисисного буфера. Каждый отдельный образец РНК для транскриптомного анализа был получен путем объединения 10 микродиссектированных образцов клеток с последующей экстракцией РНК с помощью набора Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Этот протокол улучшает собственную автофлуоресценцию бета-клеток человека, тем самым способствуя их быстрому и точному распознаванию и сбору. Дальнейшее совершенствование этой процедуры может позволить препарировать фенотипически различные бета-клетки, что может иметь последствия для лучшего понимания изменений, связанных с диабетом 2 типа.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Замораживание человеческих тканей поджелудочной железы

  1. Удалить жировой ткани, кровеносные сосуды, нервы и не паренхиматозной ткани с помощью скальпеля и пинцета, и сократить ткани поджелудочной железы на куски (~ 0.5-1 кубов см).
  2. Поместите один кусок ткани поджелудочной железы в центре Cryomold, и покроют его полностью с холодным Tissue-Tek соединение октября Положить Cryomold в банку, дно которой покрыто предварительно охлажденный 2-метилбутан и оснастки замораживание в жидком азоте. Хранить замороженные образцы при -80 ° C.

2. Подготовка замороженных срезов

  1. Надевайте перчатки во все меры, чтобы избежать денатурации РНК.
  2. Очистите криостата нож, держатель образца и кисть с холодными 100% этанола и РНКазы в гостях. Поместите замороженные ткани внутри криостата.
  3. Подождите, пока ткань, нож и щеточка достигают -20 ° C. Этикетка SuperFrost Plus слайдов и предварительно охладить их внутри криостата камере в ожиданиидля тканей достичь -20 ° C.
  4. Применить Tissue-Tek октября Соединение на держатель образца и поместить замороженной ткани на вершине.
  5. После того, Tissue-Tek октября Соединение заморожен обрезать cryoblock и удалите излишки Tissue-Tek соединение октября с лезвием бритвы.
  6. Вырезать в общей сложности 40 последовательных 10 мкм кусочки от блока ткани поджелудочной железы. Кроме того, мы рекомендуем резки начального и среднего среза должны быть сохранены для обзора рисунков поджелудочной железы раздел, который может способствовать выявлению островки в пределах ломтики во время микродиссекции процесса.
  7. Передача секций от лезвия ножа в центре SuperFrost Plus слайдов, нажав на обратной стороне слайда пальцем (покрытые перчатки), чтобы разогреться только региона, к которому разделе будем придерживаться.
  8. Высушите разделах 1-2 мин внутри криостата при температуре -20 ° C, после чего положить их в коробку слайдов размещены на сухом льду. Хранить разделахпри -80 ° C.
  9. Если необходимо, протрите лезвие ножа с бумажными полотенцами и холодным 100% этанола.

3. Обезвоживание замороженных срезов

  1. Подготовка реагентов: налить 30 мл свежеприготовленного 70% этанола, 30 мл DEPC обработанной воды, 2x30 мл 100% этанола и 30 мл ксилола в 50 мл пробирки Cellstar (Соколов); холод и держать все реагенты (за исключением ксилола) на льду.
  2. Очистите рабочее пространство под капотом со 100% этанола и RNaseZAP.
  3. Процесс две cryosections следующим образом: закрепить в ледяной 70% этанола в течение 30 сек, промыть 5-6 быстрых провалов в ледяную DEPC обработанной воды, обезвоживают в два раза в течение 1 мин в ледяной 100% этанола, инкубировать в течение 4 мин в ксилоле при комнатной температуре (25 ° C), и сухой воздух в течение 3-5 мин. Повторите этот шаг с другой парой cryosections.
  4. Вставьте две сушеные cryosections спина к спине в 50 мл Cellstar трубка обернута алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света и влаги.
<р = класса "jove_title"> 4. Лазерная Microdissection бета-клеток с PALM Microbeam, Zeiss

  1. Очистите микроскоп с RNaseZAP и смонтировать клей Cap в RoboMover.
  2. Установить следующие параметры: набор фильтров 09 (возбуждение: 450-490 нм, эмиссия> 515 нм), AutoLPC режиме, 50% лазерной энергии, 65% лазерного фокуса, 100% лазерная скорости, 5 мкм, расстояние между AutoLPC выстрелов, 6 мкм расстоянии к линии, рабочая высота: -10100.
  3. Вставьте один слайд на сцене.
  4. Найдите аутофлуоресцентной бета-клетки под микроскопом визуализации (5x или 10x объектив).
  5. Переключитесь на 40x объектив, выберите бета-клеток с "Freehand" Выбор инструмента и microdissect их с помощью лазера.
  6. Захват ткани из четырех обезвоженной cryosections в одном AdhesiveCap.
    Комментарий 1: время, чтобы рассекать бета-клеток одного обезвоженной cryosection не должна быть больше, чем 10-20 минут, чтобы избежать регидратации срезов тканей, которое может привести вДеградации РНК.
    Комментарий 2: проверить успешность процесса микродиссекции путем визуального осмотра после переезда на сцену, чтобы контрольно-пропускной пункт.

5. Лизис микродиссекции Beta Ткань сотовый Обогащенный

  1. Снимите AdhesiveCap от RoboMover.
  2. Внесите 10 мкл буфера для экстракции (ВБ, PicoPure выделения РНК Kit, Arcturus) в крышку AdhesiveCap и инкубировать ее вверх дном при 42 ° С в течение 30 мин.
  3. Спином вниз на 10000 XG и поставить лизат на сухом льду. Хранить при температуре -80 ° C до выделения РНК выполняют.
  4. Повторите шаги 3.) До 5.) Со всеми другими разделами.

6. Экстракция РНК

  1. Смешайте все десять 10 мкл лизатов
  2. Приступить к изоляции РНК, работая при комнатной температуре в соответствии с протоколом PicoPure выделения РНК Kit, Арктур, используя Добыча соотношении 1:1 Buffer (ВБ) до 70% этанола (в том числе лечение ДНКазой).

7. Анализ РНК

  1. Используйте 1 мкл РНК для анализа качества и количества использованием Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). Количественная оценка делается по отношению к стандартным РНК загружается параллельно на чипе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на рисунке 1, модифицированный протокол обезвоживания привели к улучшению бета автофлуоресценции клеток по сравнению с предыдущим опубликован протокол 6. Применение описанного протокола, каждый из 39 хирургических образцах поджелудочной железы был использован для создания 40 последовательных cryosections в среднем 31'544'704 мкм 3 ткани / поджелудочной железы образца (диапазон: 8'742'390 - 81'522'153 мкм 3) Как показано в таблице 1. Это пред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем надежный подход для лазерных микродиссекции (LMD) человеческих островков от хирургического образца поджелудочной железы. При условии, что LMD микроскопа доступно, эта процедура может быть реализована в любой научно-исследовательского учреждения выполнения частичного pancreatectomies, тем самым увеличивая доступ к человеческому материалу островок из обоих, не страдающих диабетом и сахарным диабетом 2 типа субъектов. Это особенно актуально, учитывая недостаток pancreata предлагаемых для островок изоляции. Бла...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотим поблагодарить всех наших коллег, которые предоставили помощь, советы и критические входа на различных этапах этого проекта. Производство этого видео статьи была поддержана за счет средств IMIDIA ( http://www.imidia.org ), немецкого министерства образования и научных исследований (BMBF) к немецким центром исследований диабета (DZD, http://www.dzd -ev.de ) и Университетской больницы Карл Густав Карус в Технологическом университете Дрездена. Работы, ведущей к данной публикации получило поддержку со стороны Инновационные инициативы лекарственных средств совместного проекта по гранту соглашения N ° 155005 (IMIDIA), ресурсы которого состоят из финансового вклада Седьмой рамочной Европейского Союза, Программы (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в натуральном выражении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
2-метилбутан (изопентан) ROTH 3927,1
AdhesiveCap (непрозрачный, 500 мкл) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar труб (50 мл) Greiner Bio-One 210 261 с поддержкой юбки
Cellstar труб (50 мл) Greiner Bio-One 227,261
Диэтиловый pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Сухой лед
Этанол абсолютная VWR 20821.310
Жидкий азот
Кисть
PALM Microbeam ZEISS
Peel-A-Way вложение форм (усеченный), 12 х 12 мм ProSciTech RR12 Самые активные 22x22 мм, глубина 21 мм
Арктур ​​PicoPure Frozen выделения РНК Kit Applied Biosystems KIT 0204
Зажим
Бритва
РНКазы ДНКазой Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Скальпель /хирургические лезвия Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus слайды адгезии микроскопом Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 мм
Tissue-Tek октября соединение Сакура 4583 или 0807000022
Пинцет BRAUN BD168R
Ксилол VWR 28975.291

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962(2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Laser MicrodissectionPancreatic IsletsHuman TissueTissue PreparationCryosectioningAutofluorescence DetectionRNA PreservationTranscriptomic AnalysisPALM MicroBeamAdhesiveCap Collection

Похожие статьи