Микрофлюидный пиколитровый биореактор для микробного анализа одиночных клеток: изготовление, настройка и эксплуатация системы

Краткое содержание

В этом протоколе описывается изготовление, настройка и базовая эксплуатация микрофлюидного пиколитерного биореактора (PLBR) для анализа одиночных клеток прокариотических микроорганизмов. Промышленно значимые микроорганизмы были проанализированы в качестве доказательства принципа, позволяющего получить представление о скорости роста, морфологии и фенотипической гетерогенности за определенные периоды времени, что вряд ли возможно с помощью традиционных методов.

Аннотация

В этом протоколе подробно описано изготовление, экспериментальная настройка и основная работа недавно представленного микрофлюидного пиколитерного биореактора (PLBR). PLBR может быть использован для анализа отдельных бактерий и микроколоний с целью исследования биотехнологических и микробиологических вопросов, касающихся, например, роста клеток, морфологии, реакции на стресс и производства метаболитов или белков на уровне отдельных клеток. Устройство имеет непрерывный поток среды, что обеспечивает постоянные условия окружающей среды для исследований возмущений, но в дополнение к этому позволяет быстро менять среду, а также колебать условия для имитации любой желаемой ситуации окружающей среды. Для изготовления одноразовых устройств кремниевая пластина, содержащая структуры SU-8 субмикрометрового размера, послужила репликационной формой для быстрого литья полидиметилсилоксана. Чипы были вырезаны, собраны, соединены и установлены на полностью автоматизированный микроскоп с высоким разрешением, подходящий для покадровой визуализации, мощного инструмента для пространственно-временного анализа клеток. Здесь биотехнологический платформенный организм Corynebacterium glutamicum был посажен в PLBR, а рост клеток и внутриклеточная флуоресценция отслеживались в течение нескольких часов, раскрывая зависящую от времени популяционную гетерогенность на уровне отдельных клеток, что невозможно с помощью обычных методов анализа, таких как проточная цитометрия. Помимо понимания изготовления устройств, кроме того, демонстрируется подготовка предкультуры, загрузка, улавливание бактерий и культивирование PLBR отдельных клеток и колоний. Эти устройства добавят новое измерение в микробиологические исследования для анализа зависящих от времени явлений отдельных бактерий в условиях жесткого контроля окружающей среды. Благодаря простоте и относительно короткому процессу изготовления, технология может быть легко адаптирована в любой лаборатории микрофлюидики и просто адаптирована к конкретным потребностям.

Введение

Интервальная микроскопия - это мощный инструмент для изучения живых клеток in vivo¹. Между тем, коммерчески доступные полностью автоматизированные платформы микроскопии, включая термически индуцированную компенсацию дрейфа фокуса, обычно применяются в биологических исследованиях для изучения зависимых от времени явлений, начиная от рака и исследований нейронных клеток и заканчивая тканевой инженерией и динамическими исследованиями с отдельными дрожжевыми или бактериальными клетками^.

Обычно прозрачные луночные планшеты, агаровые прокладки или просто предметные стекла для микроскопии применяются для создания среды для культивирования клеток во время покадровой визуализации⁷. Несмотря на то, что эти простые системы подходят для определенных исследований, они имеют очень ограниченный контроль над условиями окружающей среды и не допускают более сложных возмущений или четко определенных и быстрых изменений среды. Одноразовые микрофлюидные чипы, производимые в рамках массового производства, были представлены на рынке недавно^{, но} в основном они предназначены для более крупных типов эукариотических клеток. Несмотря на то, что рост можно отслеживать, четко определенные исследования роста, касающиеся, например, точного захвата клеток, размера колонии, направления роста и способности к удалению клеток, ограничены. Микрофлюидные среды обитания и реакторы, в которых клетки бактерий культивируются в 3D-средах^{, имеют} недостатки при проведении количественных исследований на уровне отдельных клеток. В то время как общая популяционная гетерогенность может быть проанализирована, многие параметры клеток не могут быть точно определены с помощью разрешения для одной клетки, поскольку рост не ограничивается монослоями.

Это ограничение послужило толчком к разработке микросистем, позволяющих культивировать клетки в четко определенных каналах и средах обитания, при этом клетки растут в плоских монослоях с разрешением одной клетки и особенно жестким контролем над подачей среды и условиями окружающей среды^6,11,12. Было продемонстрировано несколько примеров микрофлюидных систем для культивирования бактериальных клеток^12-14. Бактерии обычно демонстрируют очень быстрые темпы роста и нуждаются в микрофлюидных структурах в диапазоне нескольких микрометров и ниже, особенно когда для микроскопии требуются монослои клеток. Keymer et al. продемонстрировал рост и распространение штаммов E. coli в микроискусственных ландшафтах^15,16. Поскольку их интересовала динамика популяций, они не проводили исследования с разрешением для одной клетки.

Мы разработали пиколитерный биореактор (PLBR)¹³, который в настоящее время применяется для исследования различных биотехнологических показателей эффективности, таких как рост¹⁷ и анализ продуктивности флуоресцентной связи на уровне одиночных клеток^18,19. Настоящее микрофлюидное устройство позволяет управлять реактором окружающей среды при определенном объеме культуры примерно на один пиколитр и одновременно вести непрерывное наблюдение за отдельными клетками. По сравнению с открытыми однослойными коробчатыми системами^11,14, где одна или две стороны открыты для канала подачи материала, PLBR позволяет осуществлять контролируемое улавливание и культивирование. Конструкция позволяет выращивать бактерии в течение длительного времени без риска образования нескольких смежных колоний в одной большой популяции. Кроме того, система включает в себя области культивирования высотой 1 мкм (в порядке диаметра клетки) для ограничения роста бактерий до клеточных монослоев. В отличие от этого, каналы подачи в 10 раз глубже, чтобы свести к минимуму гидравлическое сопротивление.

По сравнению с миниатюрными системами периодического выращивания²⁰, данная система позволяет выращивать растения с постоянными параметрами окружающей среды благодаря непрерывному потоку среды. Кроме того, такие параметры окружающей среды, как состав среды, температура, скорость потока и газообмен, можно легко контролировать и изменять в течение нескольких секунд. Это позволяет проводить специальные исследования клеточной реакции на изменения окружающей среды, касающиеся, например, доступности питательных веществ или стрессовых стимулов. Потребность в уменьшенных объемах среды, а именно в диапазоне всего нескольких микролитров, позволяет исследователям проводить новые исследования, например, возмущение клеток во время покадровой визуализации с супернатантом крупномасштабных экспериментов, раскрывающих реакцию клеток в этих специфических^{условиях окружающей} среды. Биореактор с пиколитером представляет собой надежную систему, которая строго контролирует биофизические условия и управляется с помощью высокоточных шприцевых насосов и автоматизированной светлой и флуоресцентной микроскопии для покадровой визуализации. Здесь мы представляем полный протокол, включая проектирование устройств, изготовление и примеры приложений.

Протокол

1. Изготовление пластин

1. Спроектируйте микрофлюидное устройство, содержащее входы, выходы, основные каналы и PLBR (рис. 1A), с помощью программного обеспечения CAD.
2. Конструкция, представленная в этом протоколе (рис. 2), состоит из двух входных отверстий для посева, градиентного генератора для смешивания двух различных субстратов, одного выходного отверстия и шести массивов PLBR. Каждая матрица содержит 5 PLBR, в результате чего в одном микрофлюидном устройстве образуется 30 параллельных PLBR.
3. Создание фотошаблона литографии, содержащего желаемые схемы расположения микросхем (рисунок 1B). Фотошаблон был изготовлен методом электронно-лучевого письма с субмикронным разрешением. Используемая маска состояла из слоя хрома на стеклянной пластине 5 в²<. Примечание: выполните все следующие шаги в условиях чистого помещения класса 100 или выше (блок-схема процесса показана на рисунках 3А и 3В).
4. Очистите кремниевую пластину размером 4 в кремнии пираньей (соотношение серной кислоты и перекиси водорода 10:1) и фтористоводородной кислотой в течение нескольких минут (внимание: опасные химические вещества). Промойте деионизированной (DI) водой в течение примерно 10 секунд.
5. Обезвоживайте в течение 20 минут при температуре 200 °C.
6. Отжим слой фоторезиста 1 мкм SU-8 2000.5 на пластину (^1-й слой) (4 мл резиста, отжим 10 сек с, v = 500 об/мин и a = 100 об/мин, отжим 30 сек с v = 1 000 об/мин и a = 300 об/мин).
7. Поместите пластину с покрытием на конфорку при температуре 95 °C, чтобы удалить избыток растворителя (1,5 мин при 65 °C, 1,5 мин при 95 °C и 1 мин при 65 °C; в идеале используйте две конфорки).
8. Вставьте^1-й слой фотошаблона (здесь захватывающие области пиколитровых реакторов) и поместите пластину внутрь юстировщика маски и подвергните пластину воздействию 350-400 нм (вакуумный контакт, 64 мДж/см², t = 3 сек, I = 7 мВт/см²).
9. Выполните запекание после выдержки на горячей плите при температуре 95 °C, чтобы начать полимеризацию SU-8 (1 мин при 65 °C, 1 мин при 95 °C и 1 мин при 65 °C). Примечание: после этого шага можно увидеть структуры в слое СУ-8.
10. Поместите пластину в ванну с проявителем SU-8 на 1 минуту и переложите пластину во вторую емкость со свежим проявителем SU-8 на несколько секунд.
11. Промойте пластину в изопропаноле для удаления проявителя SU-8 и высушите пластину с помощью потока азота вафельного прядильного станка.
12. Выпекать вкрутую в течение 10 минут при температуре 150 °C.
13. Отжим слой фоторезиста 9 мкм SU-8 2010 на пластину (^2-йслой) (дозируй 4 мл резиста, отжим 10 сек при v = 500 об/мин, a = 100 об/мин, и отжим 30 с при v = 4 000 об/мин, a = 300 об/мин).
14. Поместите пластину с SU-8 на конфорку при температуре 95 °C, чтобы удалить избыток растворителя (15 минут при 65 °C, 45-60 минут при 95 °C и 10 минут при 65 °C). Примечание: следует обратить внимание на морщины и пузыри. Если пластину нагреть до 95 °C, испарившийся растворитель может быть заключен в крошечные пузырьки газа.
15. Вставьте фотошаблон с нужным расположением (здесь основные каналы подачи питательных веществ) и пластину в выравниватель маски и выставьте до 350-400 нм (жесткий контакт, 64 мДж/см², t = 10 сек, I = 7 мВт/см²)
16. Проведите запекание после выдержки на конфорке при температуре 95 °C для завершения полимеризации SU-8 (5 мин при 65 °C, 3:30 мин при 95 °C, 3 мин при 65 °C). Примечание: после этого шага можно увидеть структуры в слое СУ-8.
17. Поместите пластину в ванну с проявителем СУ-8 на 45 секунд, переложите пластину во второй контейнер со свежим проявителем СУ-8 и проявите в течение 60 секунд.
18. Промойте пластину в течение 20 секунд изопропанолом, чтобы удалить остатки проявителя SU-8, и высушите пластину азотом под давлением.
19. Наконец, сильно выпекайте при 150 °C. В результате получается окончательная пластина (рисунок 1С), которая будет использоваться в качестве основной формы для формования PDMS.
20. Выполните измерения с помощью профилометра (рис. 3C) для проверки высоты конструкции SU-8. Примечание: неточности в высоте структуры могут привести к неэффективному захвату клеток или потере клеток во время культивирования.

2. Производство полидиметилсилоксановых чипов

Примечание: Все следующие шаги должны быть идеально выполнены в условиях ламинарного потока, чтобы частицы пыли не мешали процессу изготовления (схема процесса показана на рисунке 4).

1. Приготовьте смесь основы полидиметилсилоксана (PDMS) и отвердителя в соотношении 10:1. Тщательно перемешайте до получения однородного раствора, который выглядит непрозрачным. Подготовьте столько, сколько требуется для нужной высоты слоя (здесь 3 мм).
2. Дегазируйте смесь PDMS в течение примерно 30 минут под небольшим вакуумом, пока все пузырьки не исчезнут.
3. Подготовьте формовочное устройство (или чашку Петри) с соответствующей пластиной SU-8 и залейте в нее смесь PDMS (рисунок 1D).
4. Выпекать PDMS в течение 3 часов при температуре 80 °C в духовке.
5. Аккуратно отклейте плиту PDMS от пластины. Разрежьте плиту на отдельные щепки с помощью чистого и острого скальпеля.
6. Промойте стружку в ванне с н-пентаном в течение 90 минут, а затем в двух ваннах для мытья ацетоном (по 90 минут каждая). Высушите чипсы в течение ночи, чтобы удалить остатки растворителя. Внимание: выполняйте стирку PDMS под вытяжным шкафом. Примечание: во время промывки н-пентаном мономеры и димеры удаляются из отвержденного PDMS, и размер стружки может временно удвоиться во время процедуры промывки.
7. Храните микрофлюидные чипы PDMS в закрытых контейнерах до завершения эксперимента.
8. Непосредственно перед экспериментом проделайте входное и выходное отверстия в микросхеме PDMS с помощью иглы (или дырокола) диаметром несколько меньшего диаметра, чем соединители, которые используются для соединения трубок с микросхемой PDMS.
9. Тщательно очистите микрофлюидный чип PDMS изопропанолом и с помощью скотча удалите любые частицы пыли, которые могут прилипнуть к структурированной стороне PDMS. Используйте скотч несколько раз, пока на чипе не будет видно ни одной частицы.
10. Последовательно очистите предметное стекло толщиной 170 мкм ацетоном и изопропанолом. Наконец, очистите деионизированной водой и высушите азотом под давлением.
11. Перед активацией плазмы прогрейте плазмоочиститель и запустите плазму в течение примерно 300 сек. Стеклостек с плазменным окислением и чип PDMS (мощность 50 Вт, время = 25 сек, расход кислорода = 20 см·см).
12. Выровняйте PDMS и стеклянную стружку перед склеиванием. Наконец, осторожно поместите микросхему PDMS на предметное стекло (рис. 1E). PDMS и стекло склеиваются в течение нескольких секунд. Примечание: не надавливайте пинцетом на верхнюю часть чипа PDMS во время процесса склеивания. Это может привести к так называемому обрушению крыши каналов и небольших конструкций.
13. Чтобы укрепить соединение, запекайте окончательную стеклянную стружку PDMS в течение 10 секунд при температуре 80 °C.

3. Приготовление бактериальной культуры

Примечание: Все культуры должны быть приготовлены в стерильной фильтрованной среде, чтобы предотвратить накопление нежелательных частиц, которые могут помешать во время выращивания.

1. Используйте агаровую пластину, содержащую нужные организмы (в данном случае, C. glutamicum ATCC 13032) и инокулируйте одну колонию в 20 мл свежей среды BHI, инкубируйте в течение ночи (≈ 8-14 часов) при 30 °C на вращающемся вибростенде (120 об/мин).
2. Перенесите 10 μл прекультуры в желаемую среду (здесь CGXII²¹), которая будет использоваться во время микрофлюидного культивирования, и дайте клетке вырасти в течение ночи при 30 °C на вращающемся вибростенде (120 об/мин).
3. Перенесите желаемое количество клеточной суспензии (от 10 до 500 мкл, в зависимости от начала эксперимента) в нужную среду (здесь CGXII²¹), которая будет использоваться во время микрофлюидного культивирования клеток. Примечание: лучше всего использовать для посева клетки из ранней логарифмической фазы. Для культуры C. glutamicum наилучшая оптическая плотность (OD₆₀₀) при посеве составила 0,5-2.
4. Перенесите 1 мл бактериальной культуры в стерильную пробирку объемом 2 мл. Примечание: это следует делать сразу после сборки микрофлюидного чипа PDMS, чтобы свести к минимуму время переноса между встряхиванием колбы и микрофлюидным выращиванием. Как правило, время переноса составляет около 15 минут и должно быть как можно меньше, чтобы предотвратить влияние на метаболизм, вызванное ограничением кислорода и изменениями температуры.

4. Экспериментальная установка

Примечание: Все шаги выполняются с помощью инвертированного микроскопа.

1. Запустите микроскоп-инкубатор за 2 часа до начала эксперимента для прогрева системы. Примечание: микроскопия должна быть оснащена полноразмерным инкубатором для контроля температуры и, при желании, расхода газа. Дополнительный контроль влажности не требуется, так как система чипов постоянно наполняется средой.
2. Откройте систему инкубатора, выберите нужную цель и при необходимости добавьте на мишень погружное масло.
3. Установите чип внутрь чипхолдера. При необходимости закрепите стеклянную пластину клейкой лентой во избежание сколов при работе сцены.
4. Центрируйте образец на микроскопе и сфокусируйтесь на массивах PLBR.
5. Соедините входные и выпускные отверстия соответствующими трубками (Рисунок 1F). Подсоедините трубки к резервуару для отходов. Репрезентативный чип можно увидеть на рисунке 4D.
6. Вставьте шприцы в насосы и запустите поток среды. Используйте среду, буфер или, при необходимости, раствор для покрытия и промойте микрофлюидные каналы в течение примерно 1 часа. Примечание: раствор для покрытия используется для покрытия стенок каналов для предотвращения неспецифической адгезии клеток.
7. Для E. coli 0,1% раствор BSA используется для покрытия стенок канала. Для C. glutamicum покрытие не требуется. После процедуры нанесения покрытия промойте стружку средним предварительным затравом ячеек.
8. Перед посевом и культивацией клеток убедитесь, что не происходит утечек и что температура постоянна.

5. Посев бактериальных клеток в микрофлюидное устройство

1. Убедитесь, что нужные растворы бактерий доступны в соответствующих шприцах, подключенных к трубке.
2. Отсоедините буфер или раствор для покрытия и подсоедините суспензию ячейки к микросхеме. Чтобы свести к минимуму мертвый объем, нежелательные пузырьки воздуха и сократить время эксперимента, меняйте иглу целиком, а также трубки, а не только шприцы.
3. Вводите суспензию клеток в каналы с объемной скоростью потока 200 нл/мин до тех пор, пока большая часть PLBR не будет заполнена желаемым количеством клеток (рис. 5A). Примечание: оптимальные результаты посева зависят от штамма бактерий, наружного диаметра₆₀₀ и питательной среды предкультуры. Эти параметры должны быть адаптированы для повышения эффективности улавливания и времени до тех пор, пока достаточное количество ячеек не будет захвачено в структурах реактора. Для C. glutamicum обычно использовали клеточную суспензию OD₆₀₀ 0,5-2; для E. coli OD₆₀₀ составлял от 0,5 до 1.
4. Если заполнено только небольшое количество PLBR, увеличьте расход до 800-1 200 нл/мин.
5. Отсоедините суспензию ячеек и подсоедините питательную среду к чипу (рисунок 5В). Следите за тем, чтобы во время смены среды не появлялись пузырьки воздуха. Перфузируйте свежей питательной средой со скоростью 100 нл/мин.

6. Покадровая съемка

1. Выберите определенные PLBR для покадровой съемки. Как правило, в начале эксперимента выбираются PLBR, которые содержат одну материнскую клетку. Количество областей интереса, которые можно исследовать в одном эксперименте, зависит от желаемой частоты кадров и микроскопической конфигурации.
2. Выберите подходящую частоту кадров в зависимости от количества PLBR. Убедитесь, что микроскоп может обрабатывать желаемое количество ROI в интервале времени.
3. Выберите подходящие наборы фильтров (в данном случае YFP). Автоматически закрывайте затвор во время движения сцены и после каждого измерения интервальной съемки, чтобы предотвратить обесцвечивание хромофора.
4. Настройте последовательность покадровой микроскопии и начните эксперимент.
5. После того, как все PLBR зарастут, эксперимент может быть остановлен, микрофлюидный чип PDMS может быть отброшен и эксперимент может быть оценен.

7. Анализ

Примечание: Следующие шаги или части процедуры могут быть выполнены вручную или с помощью программ анализа изображений, таких как ImageJ и т.д.

1. Определите интересующие PLBR, в которых выращивание удовлетворяет всем желаемым критериям, например, количество материнских клеток, положение материнских клеток и т. д.
2. Чтобы определить скорость роста одной микроколонии, подсчитайте количество клеток в каждом временном интервале.
3. Рассчитайте максимальный темп роста, построив график зависимости времени от ln (номера ячейки). Наклон графика представляет собой скорость роста в [1/ч] (см. рис. 6).
4. Анализ флуоресцентных данных сильно зависит от проведенного эксперимента. В этом отчете был выбран пример, иллюстрирующий гетерогенность между различными изогенными микроколониями между колониями и между клетками (см. рисунок 7).

Результаты

Изготовление устройств

Микрофлюидная система PLBR состоит из одного слоя PDMS, прикрепленного к тонкому стеклянному чипу, подходящему для микроскопии высокого разрешения. Производство состоит из двух основных этапов: во-первых, изготовление мастер-репликации (рисунки 1A, 1B и 1C) и, во-вторых, изготовление чипа (рисунки 1D, 1E и 1F). Согласно протоколу, для создания мастер-формы используются стандартные методы фотолитографической микрофабрикации. Лаборатории, не имеющие чистых помещений, могут приобрести коммерчески доступные мастер-формы SU-8 по индивидуальному заказу. С помощью повторяющегося формования PDMS (рис. 1A, 1B и 1C ) можно изготовить сотни одноразовых чипов. Формование PDMS и сборка чипов могут быть выполнены в любой лаборатории и не требуют чистых помещений, однако рабочие места с ламинарным потоком воздуха являются преимуществами.

Процесс начинается с проектирования микрофлюидной системы чипов. Как правило, программное обеспечение САПР используется для проектирования микрофлюидного чипа (Рисунок 1A). После CAD электронная лучевая запись генерирует маску (рис. 1B) с субмикронным разрешением. В настоящем исследовании была создана 5-дюймовая хромовая маска, которая была использована для литографии пластин СУ-8. Конечный кремний — пластина SU—8 используется для формования PDMS (рис. 1D). После стадии обжига плита PDMS разрезается на стружку, которая необратимо приклеивается к стеклянным стеклам (Рисунок 1E). Наконец, трубка подсоединена (Рисунок 1F).

На рисунке 2 подробно показана конструкция микрофлюидной системы. Он состоит из двух посевных отверстий, градиентного генератора для смешивания различных субстратов или сред и одного выходного отверстия. Основные каналы имеют размеры 50 μм x 10 μм (Ш x В). Каждое устройство состоит из шести массивов PLBR, содержащих по 5 PLBR в каждом. В результате получается 30 параллельных реакторов внутри одного микрофлюидного устройства.

Рисунок 3 иллюстрирует производство мастер-репликации. Как подробно описано в протоколе, первый слой SU-8 изготавливается с помощью литографии SU-8 (рис. 3A). Аналогичная процедура применяется для второго слоя (рисунок 3B). Для проверки геометрии канала мы исследовали высоту PLBR и основных каналов с помощью профилометра. В примере, показанном на рисунке 3C, был измерен первый слой (культивационный слой). Здесь слой имеет постоянную высоту 1200 нм, что подходит для выращивания C. glutamicum в среде BHI.

Рисунок 4 иллюстрирует процедуру формования PDMS, начиная со смешивания PDMS (Рисунок 4A), за которым следует процесс формования (Рисунок 4B) и, наконец, этап склеивания (Рисунок 4C). На рисунке 4D показан окончательный микрофлюидный чип, включающий в себя стеклянную пластину толщиной 170 мкм, чип PDMS (высотой 3 мм) с входами и выходами и стальные иглы, соединенные с трубкой. После эксперимента чип можно утилизировать, и обширная очистка не требуется. Кроме того, он прост в сборке и обращении. Никакой сложной и трудной процедуры пломбирования не требуется.

Принцип устройства

На рисунке 5 показан принцип работы реакторной системы. Клетки вводятся в микрофлюидное устройство, и отдельные клетки остаются в ловушке внутри PLBR просто из-за взаимодействий между клеткой и стенкой. Из-за разницы в гидродинамическом сопротивлении канала и PLBR внутри PLBR происходит лишь минимальный поток. После посева PLBR (рис. 5A) фаза роста и наблюдения начинается с перехода от раствора бактерии к питательной среде (рис. 5B). После того, как PLBR разрастаются (рис. 5C), эксперимент обычно останавливают, и можно проанализировать покадровые изображения. Для получения информации о механизмах улавливания и профиле потока в PLBR читатель может обратиться к Grünberger et al.¹³ для получения более подробной информации.

Анализ темпов роста

Данная система может быть применена для изучения различных видов бактерий в отношении различных биологических параметров, таких как рост, морфология или флуоресцентный сигнал. В первом примере C. glutamicum, промышленно значимый производственный организм, культивировали в стандартных условиях культивирования (T=30 °C, среда CGXII²¹). На рисунке 6А показаны кривые роста, полученные из трех изогенных микроколоний. Экспоненциальный рост поддерживается до тех пор, пока PLBR не будут заполнены, что указывает на отсутствие ограничения питательных веществ. На рисунке 6B показаны четыре изображения покадровой микроскопии DIC растущей колонии C. glutamicum.

Флуоресцентный анализ

Для флуоресцентной микроскопии одиночных клеток исследователи часто используют специфические флуоресцентные белки, например, GFP или производные, чтобы связать определенный фенотип, представляющий интерес, с измеримым выходом (флуоресцентным сигналом). Чтобы продемонстрировать применимость PBLR для флуоресцентных покадровых исследований, мы исследовали флуоресцентное излучение штамма C. glutamicum, продуцирующего плазмидный гибридный белок YFP-TetR под контролем промотора Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)^18,22. Известно, что в присутствии низких концентраций индукторов (IPTG) экспрессияP-tac приводит к значительным межклеточным вариациям изогенных бактериальных популяций. Начиная с одной прекультуры, прослеживали рост и флуоресценцию одиночных клеток для нескольких изогенных микроколоний. Как видно на рисунке 7, мы наблюдали фенотипическую гетерогенность между различными микроколониями и гетерогенность на уровне одной клетки внутри колоний, начиная с одной материнской клетки. Одна колония (рис. 7B, PLBR 1) показала почти полное отсутствие флуоресцентного излучения, в то время как клетки PLBR 2 продемонстрировали низкое флуоресцентное излучение из-за базальной экспрессии yfp-tetR от промотораP-tac. В PLBR 3 флуоресцентное излучение было значительно сильным по сравнению с другими колониями, и наблюдалось широкое распределение популяции. Этот пример демонстрирует применимость PBLR для исследований с интервальной флуоресцентной микроскопией. По сравнению с проточной цитометрией, в которой флуоресценция отдельных клеток может быть определена в один момент времени, существующие системы позволяют отслеживать клетки и изучать флуоресценцию одиночных клеток в реальном времени на протяжении многих поколений.

Рисунок 1.Обзор процесса производства чипов PLBR. Изготовление мастер-форм: начиная с (А) Проектирования, (Б) Изготовления литографической маски и (В) Производства пластин. Производство PDMS-стеклянной стружки: начиная с (D) формования PDMS, за которым следует (E) склеивание стекла и PDMS и (F) окончательная сборка стружки.

Рисунок 2. Конструкция микросхемы PLBR. (A) Чертеж САПР всего микрофлюидного чипа; (B) Увеличение выбранных положений топологии: Топология содержит два средних входных отверстия (a1), градиентный генератор со смесительными каналами (a2) и 6 параллельных PLBR-матриц (b1). b2 показан один PLBR, который встроен в канал для жидкости шириной 100 мкм. PLBR имеет внутренний диаметр 40 мкм и питательные каналы шириной 2 мкм. Входное отверстие для посева имеет длину 40 мкм. Розовый цвет представляет первый слой (область ловли и культивации), а синий цвет представляет второй слой (транспорт жидкости).

Рисунок 3.Иллюстрация процесса изготовления двухслойных пластин. (A) Изготовление первого слоя, содержащего захватывающие структуры; (B) Изготовление второго слоя, содержащего каналы для жидкости, входные и выпускные отверстия; (C) Репрезентативные профили поверхности первого слоя. При этом высота первого слоя составила 1200 нм и используется для выращивания C. glutamicum в сложной среде.

Рисунок 4.Изготовление устройства и репрезентативного чипа. Иллюстрация процесса формования PDMS: (A) смешивание и дегазация PDMS; (B) формование PDMS; (C) разблокирование пресс-формы, резка и склеивание стружки. Окончательный чип (Воспроизведено с разрешения Королевского химического общества¹³): (D) фотография микросхемы PDMS с 2 входами и 1 выходом; (E) CAD-изображение шести параллельных массивов, содержащих по 5 PLBR каждая; (F) Сэм-изображение одного PLBR.

Рисунок 5. Принцип работы системы PLBR. (А) Фаза посева; (В) Фаза роста бактериальных микроколоний; (C) Фаза переполнения. Воспроизводится с разрешения Королевского химического общества13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Рисунок 6.Определение скорости роста микроколоний C. glutamicum WT. (A) График роста трех культивирований PLBR и результирующие экспоненциальные кривые (Части воспроизведены с разрешения Королевского химического общества)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Покадровая съемка растущей колонии C. glutamicum.

Рисунок 7. Анализ популяционной гетерогенности на основе PBLR. Показано, как C. glutamicum экспрессирует слияние yfp-tetR под контролем промотора Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) в отсутствие индуктора IPTG. а) экспериментальный рабочий процесс; (B) Три изогенные микроколонии, демонстрирующие гетерогенность от колонии к колонии и гетерогенность от клетки к клетке; (C) Распределение флуоресценции одиночных клеток в соответствующих микроколониях.

Рисунок 8. Сканирующие электронные изображения различных PLBR. Изображения SEM, показывающие входные отверстия для посева для оптимизации эффективности улавливания. (A) Входные отверстия для посева лагера (B) Меньшие входные отверстия для посева (C) Большие «открытые» входные отверстия для посева (D) Два входных отверстия для посева.

шаг	проблема	Возможная причина	решение
Изготовление пластин	Улавливание пузырьков воздуха в SU-8 во время мягкого выпекания	Повышение температуры до быстрого	Выпекать при температуре 95 °C и 65 °C несколько раз
Изготовление пластин	Исчезающие и разрушенные конструкции СУ-8	Неоптимальная технология изготовления; механические нагрузки в конструкциях СУ-8	Оптимизируйте такие параметры, как время выпечки, время выдержки
Изготовление пластин	Слои SU-8 с малой или большой или неравномерной толщиной слоя	Проблема при нанесении отжима покрытия	Проверка параметров прядильного аппарата и патрона пластины
Склеивание и сборка чипов	Разрушающиеся PLBR	Параметры склеивания PDMS не оптимальны	Отрегулируйте мощность, время воздействия плазмы и время запекания после склеивания
Склеивание и сборка чипов	Загрязненные структуры и частицы в PLBR	Чип не был должным образом очищен	Наклейте скотч для очистки поверхности
Склеивание и сборка чипов	Недостаточное склеивание PDMS со стеклом	Неоптимальные параметры склеивания или недостаточная очистка	Проверьте настройки кислородной плазмы
Микрофлюидный эксперимент	Утечка жидкости	Входное/выпускное отверстие не было пробито должным образом	Оптимизация процесса пробивки отверстий
Микрофлюидный эксперимент	Много мелких частиц PDMS во время наполнения	Отверстие не было пробито должным образом	Оптимизация процесса пробивки отверстий
Микрофлюидный эксперимент, биологический аспект	Отсутствие роста клеток	Остатки растворителя от процедуры очистки	Промывайте стружку более тщательно перед загрузкой ячейки или дайте растворителю испариться перед склеиванием
Микрофлюидный эксперимент, биологический аспект	Изменение темпов роста	Различные причины	Проверка предкультуры и температуры
Микрофлюидный эксперимент, биологический аспект	Морфология клеток изменяется в процессе культивирования	Ограничение питательных веществ или температурный сдвиг	Проверьте инкубатор и поток
Микрофлюидный эксперимент, технический аспект	Дрейф положения во время покадровой микроскопии	Колебания температуры	Проверяйте температурный профиль перед экспериментами до полного исчезновения колебаний
Микрофлюидный эксперимент, технический аспект	Потеря клеток во время культивирования	Немного большая высота реактора	Оптимизация высоты реактора
Микрофлюидный эксперимент, технический аспект	Отсутствие треппинга	Слишком малая высота реактора	Оптимизация высоты реактора

Таблица 1. Устранение неполадок. В этой таблице обобщены критические аспекты, распространенные ошибки и возможные решения в ходе экспериментальной работы.

Обсуждение

Мы описали изготовление, экспериментальную установку и связанные с этим процедуры работы микрофлюидного PDMS-устройства, содержащего несколько (PLBRs) для анализа одиночных клеток бактерий.

Микропроизводство с использованием методов мягкой литографии позволяет быстро корректировать размеры устройства для различных размеров и морфологии бактерий. В настоящее время мы оптимизируем биореактор пиколитер с точки зрения культивирования различных микробных организмов и производительности культивирования. Для повышения эффективности улавливания также оптимизируется геометрия реактора. На рисунке 8 показаны четыре новых устройства PLBR, которые в настоящее время проверены. На всех рисунках посевной канал был переработан с учетом ширины и формы. На практике это, по-видимому, влияет на количество клеток, которые находятся в ловушке, но требует дальнейших исследований. Значительное повышение эффективности улавливания также было достигнуто за счет включения дополнительных переливных каналов, что привело к увеличению конвекционного потока через реактор и увеличению числа улавливаемых ячеек. Однако в то же время увеличивается риск вымывания клеток во время культивирования.

Устройство является интересной альтернативой макромасштабному выращиванию, которое десятилетиями использовалось для исследования процессов роста и производства на уровне отдельных клеток. Тем не менее, у него есть несколько важных требований: для параллельного мониторинга нескольких биореакторов пиколитер обязательна полностью моторизованная микроскопическая установка с высоким разрешением и компенсацией дрейфа фокуса. Кроме того, необходима инкубационная система для поддержания желаемой постоянной температуры выращивания на протяжении всех измерений.

Мы достигаем 95% успеха в производстве устройств. Основные проблемы связаны с неэффективным соединением PDMS со стеклом, обрушением крыши PDMS или утечкой жидкости (см. Таблицу 1 для поиска и устранения большинства возникающих проблем). Хотя экспериментальная работа частично проводится в нестерильных условиях, мы редко видим загрязнение во время экспериментов из-за закрытой жидкостной системы. Микрофлюидные устройства PDMS оптически прозрачны, поэтому могут использоваться для визуализации in vivo с высоким разрешением. Несмотря на то, что PDMS кажется идеальным для этого применения, он обладает высоким сродством к гидрофобным молекулам, что ограничивает использование растворителей, которые широко используются в биокаталитических процессах всей клетки. Тем не менее, существуют подходящие покрытия для адаптации протокола к таким видам применения.

Предложенный PLBR хорошо подходит для пространственно-временного анализа клеточных и даже субклеточных событий различного рода бактерий. Основное преимущество данного подхода заключается в возможности количественной оценки роста микроколоний напрямую, в отличие от традиционных методов. Кроме того, PLBR позволяет культивировать в определенных и постоянных условиях. Поскольку система позволяет использовать небольшое количество реагентов или материалов, она обладает такими преимуществами, как недорогая, настраиваемая и поддающаяся высокой производительности. В традиционных методах при анализе культивирования микроорганизмов учитываются средние значения по всей популяции. Кроме того, существующие методы требуют ручного отбора проб, что может привести к ухудшению качества проб и, следовательно, к ошибкам при измерении. PLBR открывает новые перспективы для развития биопроцессов и анализа популяционной гетерогенности в микробиологии. PLBR является многообещающим инструментом для различных применений в области разработки биопроцессов и может быть применен в различных областях исследований, например, в анализе межклеточной гетерогенности, анализе конкретных клеточных кластеров в клеточных линиях, скрининге штаммов микробной продукции и исследовании клеточных фенотипов в режиме реального времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кремниевая пластина диаметром 100 мм, P/BOR < 100>	Si-MAT, Кремниевые материалы, Германия
Фоторезист SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Германия
Фоторезист SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Германия
SU-8 Разработчик mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Германия
Полидиметилсилоксан (PDMS) Sylgard 184 Набор	силиконовых эластомеровDow Corning; Farnell GmbH, Германия
Диспенсерные иглы Precision Tips  27 G; ID = 0,2 мм, OD = 0,42 мм	Nordson EFD Deutschland, Германия
Стеклянные пластины D263 T eco, 30 мм x 25 мм x 0,17 мм	Schott AG, Германия
Дырокол AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 мм, OD = 0,76 мм	Saint Gobain; VWR International GmbH, Германия
Одноразовые шприцы – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 мл	B. Braun Melsungen AG, Германия	552-183143
Шприцы, 1 мл шприцы из стерильного стекла	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Германия
Chemicals
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
Urea	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
Biotin	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
Procatechuic acid	Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия
BHI	Becton, Dickinson
Cells
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Германия
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Германия
Оборудование
очистки вафель SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Выравниватель маски MA-6	Горячая плита Карла Зюсса
HP30A - 2			Торри Пайнс
Печь Memmert UN 200	Memmert
Очиститель плазмы FEMTO	Diener Electronics, Германия
neMESYS шприцевые насосы	Cetoni GmbH, Германия
Магнитная мешалка CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Микроскоп Nikon Eclipse Ti	Микроскоп
Микроскоп инкубатор	Pecon GmbH, Германия
Центрифуга minispin plus " Черная линия"	Eppendorf	9776501
Фотометр BioPhotometer plus	Eppendorf	6132000008
Shake колба/инкубатор 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Германия
Профилометр, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco