В этом протоколе описывается изготовление, настройка и базовая эксплуатация микрофлюидного пиколитерного биореактора (PLBR) для анализа одиночных клеток прокариотических микроорганизмов. Промышленно значимые микроорганизмы были проанализированы в качестве доказательства принципа, позволяющего получить представление о скорости роста, морфологии и фенотипической гетерогенности за определенные периоды времени, что вряд ли возможно с помощью традиционных методов.
Методическая статья
Микрофлюидный пиколитровый биореактор для микробного анализа одиночных клеток: изготовление, настройка и эксплуатация системы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом протоколе подробно описано изготовление, экспериментальная настройка и основная работа недавно представленного микрофлюидного пиколитерного биореактора (PLBR). PLBR может быть использован для анализа отдельных бактерий и микроколоний с целью исследования биотехнологических и микробиологических вопросов, касающихся, например, роста клеток, морфологии, реакции на стресс и производства метаболитов или белков на уровне отдельных клеток. Устройство имеет непрерывный поток среды, что обеспечивает постоянные условия окружающей среды для исследований возмущений, но в дополнение к этому позволяет быстро менять среду, а также колебать условия для имитации любой желаемой ситуации окружающей среды. Для изготовления одноразовых устройств кремниевая пластина, содержащая структуры SU-8 субмикрометрового размера, послужила репликационной формой для быстрого литья полидиметилсилоксана. Чипы были вырезаны, собраны, соединены и установлены на полностью автоматизированный микроскоп с высоким разрешением, подходящий для покадровой визуализации, мощного инструмента для пространственно-временного анализа клеток. Здесь биотехнологический платформенный организм Corynebacterium glutamicum был посажен в PLBR, а рост клеток и внутриклеточная флуоресценция отслеживались в течение нескольких часов, раскрывая зависящую от времени популяционную гетерогенность на уровне отдельных клеток, что невозможно с помощью обычных методов анализа, таких как проточная цитометрия. Помимо понимания изготовления устройств, кроме того, демонстрируется подготовка предкультуры, загрузка, улавливание бактерий и культивирование PLBR отдельных клеток и колоний. Эти устройства добавят новое измерение в микробиологические исследования для анализа зависящих от времени явлений отдельных бактерий в условиях жесткого контроля окружающей среды. Благодаря простоте и относительно короткому процессу изготовления, технология может быть легко адаптирована в любой лаборатории микрофлюидики и просто адаптирована к конкретным потребностям.
Введение
Интервальная микроскопия - это мощный инструмент для изучения живых клеток in vivo1. Между тем, коммерчески доступные полностью автоматизированные платформы микроскопии, включая термически индуцированную компенсацию дрейфа фокуса, обычно применяются в биологических исследованиях для изучения зависимых от времени явлений, начиная от рака и исследований нейронных клеток и заканчивая тканевой инженерией и динамическими исследованиями с отдельными дрожжевыми или бактериальными клетками.
Обычно прозрачные луночные планшеты, агаровые прокладки или просто предметные стекла для микроскопии применяются для создания среды для культивирования клеток во время покадровой визуализации7. Несмотря на то, что эти простые системы подходят для определенных исследований, они имеют очень ограниченный контроль над условиями окружающей среды и не допускают более сложных возмущений или четко определенных и быстрых изменений среды. Одноразовые микрофлюидные чипы, производимые в рамках массового производства, были представлены на рынке недавно, но в основном они предназначены для более крупных типов эукариотических клеток. Несмотря на то, что рост можно отслеживать, четко определенные исследования роста, касающиеся, например, точного захвата клеток, размера колонии, направления роста и способности к удалению клеток, ограничены. Микрофлюидные среды обитания и реакторы, в которых клетки бактерий культивируются в 3D-средах, имеют недостатки при проведении количественных исследований на уровне отдельных клеток. В то время как общая популяционная гетерогенность может быть проанализирована, многие параметры клеток не могут быть точно определены с помощью разрешения для одной клетки, поскольку рост не ограничивается монослоями.
Это ограничение послужило толчком к разработке микросистем, позволяющих культивировать клетки в четко определенных каналах и средах обитания, при этом клетки растут в плоских монослоях с разрешением одной клетки и особенно жестким контролем над подачей среды и условиями окружающей среды6,11,12. Было продемонстрировано несколько примеров микрофлюидных систем для культивирования бактериальных клеток12-14. Бактерии обычно демонстрируют очень быстрые темпы роста и нуждаются в микрофлюидных структурах в диапазоне нескольких микрометров и ниже, особенно когда для микроскопии требуются монослои клеток. Keymer et al. продемонстрировал рост и распространение штаммов E. coli в микроискусственных ландшафтах15,16. Поскольку их интересовала динамика популяций, они не проводили исследования с разрешением для одной клетки.
Мы разработали пиколитерный биореактор (PLBR)13, который в настоящее время применяется для исследования различных биотехнологических показателей эффективности, таких как рост17 и анализ продуктивности флуоресцентной связи на уровне одиночных клеток18,19. Настоящее микрофлюидное устройство позволяет управлять реактором окружающей среды при определенном объеме культуры примерно на один пиколитр и одновременно вести непрерывное наблюдение за отдельными клетками. По сравнению с открытыми однослойными коробчатыми системами11,14, где одна или две стороны открыты для канала подачи материала, PLBR позволяет осуществлять контролируемое улавливание и культивирование. Конструкция позволяет выращивать бактерии в течение длительного времени без риска образования нескольких смежных колоний в одной большой популяции. Кроме того, система включает в себя области культивирования высотой 1 мкм (в порядке диаметра клетки) для ограничения роста бактерий до клеточных монослоев. В отличие от этого, каналы подачи в 10 раз глубже, чтобы свести к минимуму гидравлическое сопротивление.
По сравнению с миниатюрными системами периодического выращивания20, данная система позволяет выращивать растения с постоянными параметрами окружающей среды благодаря непрерывному потоку среды. Кроме того, такие параметры окружающей среды, как состав среды, температура, скорость потока и газообмен, можно легко контролировать и изменять в течение нескольких секунд. Это позволяет проводить специальные исследования клеточной реакции на изменения окружающей среды, касающиеся, например, доступности питательных веществ или стрессовых стимулов. Потребность в уменьшенных объемах среды, а именно в диапазоне всего нескольких микролитров, позволяет исследователям проводить новые исследования, например, возмущение клеток во время покадровой визуализации с супернатантом крупномасштабных экспериментов, раскрывающих реакцию клеток в этих специфическихусловиях окружающей среды. Биореактор с пиколитером представляет собой надежную систему, которая строго контролирует биофизические условия и управляется с помощью высокоточных шприцевых насосов и автоматизированной светлой и флуоресцентной микроскопии для покадровой визуализации. Здесь мы представляем полный протокол, включая проектирование устройств, изготовление и примеры приложений.
Протокол
1. Изготовление пластин
- Спроектируйте микрофлюидное устройство, содержащее входы, выходы, основные каналы и PLBR (рис. 1A), с помощью программного обеспечения CAD.
- Конструкция, представленная в этом протоколе (рис. 2), состоит из двух входных отверстий для посева, градиентного генератора для смешивания двух различных субстратов, одного выходного отверстия и шести массивов PLBR. Каждая матрица содержит 5 PLBR, в результате чего в одном микрофлюидном устройстве образуется 30 параллельных PLBR.
- Создание фотошаблона литографии, содержащего желаемые схемы расположения микросхем (рисунок 1B). Фотошаблон был изготовлен методом электронно-лучевого письма с субмикронным разрешением. Используемая маска состояла из слоя хрома на стеклянной пластине 5 в2<. Примечание: выполните все следующие шаги в условиях чистого помещения класса 100 или выше (блок-схема процесса показана на рисунках 3А и 3В).
- Очистите кремниевую пластину размером 4 в кремнии пираньей (соотношение серной кислоты и перекиси водорода 10:1) и фтористоводородной кислотой в течение нескольких минут (внимание: опасные химические вещества). Промойте деионизированной (DI) водой в течение примерно 10 секунд.
- Обезвоживайте в течение 20 минут при температуре 200 °C.
- Отжим слой фоторезиста 1 мкм SU-8 2000.5 на пластину (1-й слой) (4 мл резиста, отжим 10 сек с, v = 500 об/мин и a = 100 об/мин, отжим 30 сек с v = 1 000 об/мин и a = 300 об/мин).
- Поместите пластину с покрытием на конфорку при температуре 95 °C, чтобы удалить избыток растворителя (1,5 мин при 65 °C, 1,5 мин при 95 °C и 1 мин при 65 °C; в идеале используйте две конфорки).
- Вставьте1-й слой фотошаблона (здесь захватывающие области пиколитровых реакторов) и поместите пластину внутрь юстировщика маски и подвергните пластину воздействию 350-400 нм (вакуумный контакт, 64 мДж/см², t = 3 сек, I = 7 мВт/см²).
- Выполните запекание после выдержки на горячей плите при температуре 95 °C, чтобы начать полимеризацию SU-8 (1 мин при 65 °C, 1 мин при 95 °C и 1 мин при 65 °C). Примечание: после этого шага можно увидеть структуры в слое СУ-8.
- Поместите пластину в ванну с проявителем SU-8 на 1 минуту и переложите пластину во вторую емкость со свежим проявителем SU-8 на несколько секунд.
- Промойте пластину в изопропаноле для удаления проявителя SU-8 и высушите пластину с помощью потока азота вафельного прядильного станка.
- Выпекать вкрутую в течение 10 минут при температуре 150 °C.
- Отжим слой фоторезиста 9 мкм SU-8 2010 на пластину (2-йслой) (дозируй 4 мл резиста, отжим 10 сек при v = 500 об/мин, a = 100 об/мин, и отжим 30 с при v = 4 000 об/мин, a = 300 об/мин).
- Поместите пластину с SU-8 на конфорку при температуре 95 °C, чтобы удалить избыток растворителя (15 минут при 65 °C, 45-60 минут при 95 °C и 10 минут при 65 °C). Примечание: следует обратить внимание на морщины и пузыри. Если пластину нагреть до 95 °C, испарившийся растворитель может быть заключен в крошечные пузырьки газа.
- Вставьте фотошаблон с нужным расположением (здесь основные каналы подачи питательных веществ) и пластину в выравниватель маски и выставьте до 350-400 нм (жесткий контакт, 64 мДж/см², t = 10 сек, I = 7 мВт/см²)
- Проведите запекание после выдержки на конфорке при температуре 95 °C для завершения полимеризации SU-8 (5 мин при 65 °C, 3:30 мин при 95 °C, 3 мин при 65 °C). Примечание: после этого шага можно увидеть структуры в слое СУ-8.
- Поместите пластину в ванну с проявителем СУ-8 на 45 секунд, переложите пластину во второй контейнер со свежим проявителем СУ-8 и проявите в течение 60 секунд.
- Промойте пластину в течение 20 секунд изопропанолом, чтобы удалить остатки проявителя SU-8, и высушите пластину азотом под давлением.
- Наконец, сильно выпекайте при 150 °C. В результате получается окончательная пластина (рисунок 1С), которая будет использоваться в качестве основной формы для формования PDMS.
- Выполните измерения с помощью профилометра (рис. 3C) для проверки высоты конструкции SU-8. Примечание: неточности в высоте структуры могут привести к неэффективному захвату клеток или потере клеток во время культивирования.
2. Производство полидиметилсилоксановых чипов
Примечание: Все следующие шаги должны быть идеально выполнены в условиях ламинарного потока, чтобы частицы пыли не мешали процессу изготовления (схема процесса показана на рисунке 4).
- Приготовьте смесь основы полидиметилсилоксана (PDMS) и отвердителя в соотношении 10:1. Тщательно перемешайте до получения однородного раствора, который выглядит непрозрачным. Подготовьте столько, сколько требуется для нужной высоты слоя (здесь 3 мм).
- Дегазируйте смесь PDMS в течение примерно 30 минут под небольшим вакуумом, пока все пузырьки не исчезнут.
- Подготовьте формовочное устройство (или чашку Петри) с соответствующей пластиной SU-8 и залейте в нее смесь PDMS (рисунок 1D).
- Выпекать PDMS в течение 3 часов при температуре 80 °C в духовке.
- Аккуратно отклейте плиту PDMS от пластины. Разрежьте плиту на отдельные щепки с помощью чистого и острого скальпеля.
- Промойте стружку в ванне с н-пентаном в течение 90 минут, а затем в двух ваннах для мытья ацетоном (по 90 минут каждая). Высушите чипсы в течение ночи, чтобы удалить остатки растворителя. Внимание: выполняйте стирку PDMS под вытяжным шкафом. Примечание: во время промывки н-пентаном мономеры и димеры удаляются из отвержденного PDMS, и размер стружки может временно удвоиться во время процедуры промывки.
- Храните микрофлюидные чипы PDMS в закрытых контейнерах до завершения эксперимента.
- Непосредственно перед экспериментом проделайте входное и выходное отверстия в микросхеме PDMS с помощью иглы (или дырокола) диаметром несколько меньшего диаметра, чем соединители, которые используются для соединения трубок с микросхемой PDMS.
- Тщательно очистите микрофлюидный чип PDMS изопропанолом и с помощью скотча удалите любые частицы пыли, которые могут прилипнуть к структурированной стороне PDMS. Используйте скотч несколько раз, пока на чипе не будет видно ни одной частицы.
- Последовательно очистите предметное стекло толщиной 170 мкм ацетоном и изопропанолом. Наконец, очистите деионизированной водой и высушите азотом под давлением.
- Перед активацией плазмы прогрейте плазмоочиститель и запустите плазму в течение примерно 300 сек. Стеклостек с плазменным окислением и чип PDMS (мощность 50 Вт, время = 25 сек, расход кислорода = 20 см·см).
- Выровняйте PDMS и стеклянную стружку перед склеиванием. Наконец, осторожно поместите микросхему PDMS на предметное стекло (рис. 1E). PDMS и стекло склеиваются в течение нескольких секунд. Примечание: не надавливайте пинцетом на верхнюю часть чипа PDMS во время процесса склеивания. Это может привести к так называемому обрушению крыши каналов и небольших конструкций.
- Чтобы укрепить соединение, запекайте окончательную стеклянную стружку PDMS в течение 10 секунд при температуре 80 °C.
3. Приготовление бактериальной культуры
Примечание: Все культуры должны быть приготовлены в стерильной фильтрованной среде, чтобы предотвратить накопление нежелательных частиц, которые могут помешать во время выращивания.
- Используйте агаровую пластину, содержащую нужные организмы (в данном случае, C. glutamicum ATCC 13032) и инокулируйте одну колонию в 20 мл свежей среды BHI, инкубируйте в течение ночи (≈ 8-14 часов) при 30 °C на вращающемся вибростенде (120 об/мин).
- Перенесите 10 μл прекультуры в желаемую среду (здесь CGXII21), которая будет использоваться во время микрофлюидного культивирования, и дайте клетке вырасти в течение ночи при 30 °C на вращающемся вибростенде (120 об/мин).
- Перенесите желаемое количество клеточной суспензии (от 10 до 500 мкл, в зависимости от начала эксперимента) в нужную среду (здесь CGXII21), которая будет использоваться во время микрофлюидного культивирования клеток. Примечание: лучше всего использовать для посева клетки из ранней логарифмической фазы. Для культуры C. glutamicum наилучшая оптическая плотность (OD600) при посеве составила 0,5-2.
- Перенесите 1 мл бактериальной культуры в стерильную пробирку объемом 2 мл. Примечание: это следует делать сразу после сборки микрофлюидного чипа PDMS, чтобы свести к минимуму время переноса между встряхиванием колбы и микрофлюидным выращиванием. Как правило, время переноса составляет около 15 минут и должно быть как можно меньше, чтобы предотвратить влияние на метаболизм, вызванное ограничением кислорода и изменениями температуры.
4. Экспериментальная установка
Примечание: Все шаги выполняются с помощью инвертированного микроскопа.
- Запустите микроскоп-инкубатор за 2 часа до начала эксперимента для прогрева системы. Примечание: микроскопия должна быть оснащена полноразмерным инкубатором для контроля температуры и, при желании, расхода газа. Дополнительный контроль влажности не требуется, так как система чипов постоянно наполняется средой.
- Откройте систему инкубатора, выберите нужную цель и при необходимости добавьте на мишень погружное масло.
- Установите чип внутрь чипхолдера. При необходимости закрепите стеклянную пластину клейкой лентой во избежание сколов при работе сцены.
- Центрируйте образец на микроскопе и сфокусируйтесь на массивах PLBR.
- Соедините входные и выпускные отверстия соответствующими трубками (Рисунок 1F). Подсоедините трубки к резервуару для отходов. Репрезентативный чип можно увидеть на рисунке 4D.
- Вставьте шприцы в насосы и запустите поток среды. Используйте среду, буфер или, при необходимости, раствор для покрытия и промойте микрофлюидные каналы в течение примерно 1 часа. Примечание: раствор для покрытия используется для покрытия стенок каналов для предотвращения неспецифической адгезии клеток.
- Для E. coli 0,1% раствор BSA используется для покрытия стенок канала. Для C. glutamicum покрытие не требуется. После процедуры нанесения покрытия промойте стружку средним предварительным затравом ячеек.
- Перед посевом и культивацией клеток убедитесь, что не происходит утечек и что температура постоянна.
5. Посев бактериальных клеток в микрофлюидное устройство
- Убедитесь, что нужные растворы бактерий доступны в соответствующих шприцах, подключенных к трубке.
- Отсоедините буфер или раствор для покрытия и подсоедините суспензию ячейки к микросхеме. Чтобы свести к минимуму мертвый объем, нежелательные пузырьки воздуха и сократить время эксперимента, меняйте иглу целиком, а также трубки, а не только шприцы.
- Вводите суспензию клеток в каналы с объемной скоростью потока 200 нл/мин до тех пор, пока большая часть PLBR не будет заполнена желаемым количеством клеток (рис. 5A). Примечание: оптимальные результаты посева зависят от штамма бактерий, наружного диаметра600 и питательной среды предкультуры. Эти параметры должны быть адаптированы для повышения эффективности улавливания и времени до тех пор, пока достаточное количество ячеек не будет захвачено в структурах реактора. Для C. glutamicum обычно использовали клеточную суспензию OD600 0,5-2; для E. coli OD600 составлял от 0,5 до 1.
- Если заполнено только небольшое количество PLBR, увеличьте расход до 800-1 200 нл/мин.
- Отсоедините суспензию ячеек и подсоедините питательную среду к чипу (рисунок 5В). Следите за тем, чтобы во время смены среды не появлялись пузырьки воздуха. Перфузируйте свежей питательной средой со скоростью 100 нл/мин.
6. Покадровая съемка
- Выберите определенные PLBR для покадровой съемки. Как правило, в начале эксперимента выбираются PLBR, которые содержат одну материнскую клетку. Количество областей интереса, которые можно исследовать в одном эксперименте, зависит от желаемой частоты кадров и микроскопической конфигурации.
- Выберите подходящую частоту кадров в зависимости от количества PLBR. Убедитесь, что микроскоп может обрабатывать желаемое количество ROI в интервале времени.
- Выберите подходящие наборы фильтров (в данном случае YFP). Автоматически закрывайте затвор во время движения сцены и после каждого измерения интервальной съемки, чтобы предотвратить обесцвечивание хромофора.
- Настройте последовательность покадровой микроскопии и начните эксперимент.
- После того, как все PLBR зарастут, эксперимент может быть остановлен, микрофлюидный чип PDMS может быть отброшен и эксперимент может быть оценен.
7. Анализ
Примечание: Следующие шаги или части процедуры могут быть выполнены вручную или с помощью программ анализа изображений, таких как ImageJ и т.д.
- Определите интересующие PLBR, в которых выращивание удовлетворяет всем желаемым критериям, например, количество материнских клеток, положение материнских клеток и т. д.
- Чтобы определить скорость роста одной микроколонии, подсчитайте количество клеток в каждом временном интервале.
- Рассчитайте максимальный темп роста, построив график зависимости времени от ln (номера ячейки). Наклон графика представляет собой скорость роста в [1/ч] (см. рис. 6).
- Анализ флуоресцентных данных сильно зависит от проведенного эксперимента. В этом отчете был выбран пример, иллюстрирующий гетерогенность между различными изогенными микроколониями между колониями и между клетками (см. рисунок 7).
Результаты
Изготовление устройства
Микрофлюидная система PLBR изготавливается путем приклеивания одного слоя PDMS к тонкому стеклянному чипу, подходящему для микроскопии высокого разрешения. Процесс изготовления состоит из двух основных этапов: во-первых, создания мастер-формы (Рисунки 1A, 1B и 1C), и во-вторых, изготовления самого чипа (Рисунки 1D, 1E и 1F). Согласно протоколу, для создания мастер-формы используются стандартные методы фотолитографического микропроизводства. Лаборатории, не имеющие доступа к чистым помещениям, могут приобрести коммерчески доступные специализированные мастер-формы из SU-8. Методом многократного отлива из PDMS (Рисунки 1A, 1B и 1C) можно изготовить сотни одноразовых чипов. Отливка PDMS и сборка чипов могут быть выполнены в любой лаборатории и не требуют наличия чистых помещений, однако предпочтительно использование рабочих мест с ламинарным потоком воздуха.
Процесс начинается с проектирования системы микрофлюидного чипа. Обычно для проектирования микрофлюидного чипа используется программное обеспечение САПР (Рисунок 1A). После САПР с помощью электронно-лучевого литографа с субмикронным разрешением создается маска (Рисунок 1B). В настоящем исследовании была создана хромовая маска толщиной 5 нм, которая использовалась для литографии пластины SU-8. Готовая кремниевая пластина с SU-8 используется для формования PDMS (Рисунок 1D). После этапа запекания блок PDMS разрезается на чипы, которые необратимо прикрепляются к стеклянным предметным стеклам (Рисунок 1E). В завершение подключаются трубки (Рисунок 1F).
Рисунок 2 детально демонстрирует конструкцию микрофлюидной системы. Она состоит из двух входов для посева, генератора градиента для смешивания различных субстратов или сред и одного выхода. Основные каналы имеют размеры 50 µm x 10 µm (Ш x В). Каждое устройство состоит из шести массивов PLBR, содержащих по 5 PLBR в каждом. Таким образом, внутри одного микрофлюидного устройства расположены 30 параллельных реакторов.
Рисунок 3 иллюстрирует процесс изготовления мастер-формы для репликации. Как подробно описано в протоколе, первый слой SU-8 создается с помощью литографии SU-8 (Рисунок 3A). Аналогичная процедура применяется для второго слоя (Рисунок 3B). Для проверки геометрии каналов мы исследовали высоту PLBR и основных каналов с помощью профилометра. В примере, показанном на Рисунке 3C, был измерен первый слой (слой для культивирования). Здесь слой имеет равномерную высоту 1,200 nm, подходящую для культивирования C. glutamicum в среде BHI.
Рисунок 4 иллюстрирует процедуру формования из PDMS, начиная со смешивания PDMS (Рисунок 4A), затем процесса формования (Рисунок 4B) и, наконец, этапа склеивания (Рисунок 4C). На Рисунке 4D показан готовый микрофлюидный чип, состоящий из стеклянной пластины толщиной 170 µm, чипа из PDMS (высотой 3 mm) с входными и выходными отверстиями и стальных игл, подключенных к трубкам. После проведения эксперимента чип можно утилизировать; тщательная очистка не требуется. Кроме того, устройство легко собирать и эксплуатировать. Сложная и трудоемкая процедура заполнения не требуется.
Принцип работы устройства
Рисунок 5 демонстрирует принцип работы системы реактора. Клетки вводятся в микрофлюидное устройство, и отдельные клетки остаются захваченными внутри PLBR за счет взаимодействий с клеточной стенкой. Из-за разницы в гидродинамическом сопротивлении канала и PLBR внутри PLBR происходит лишь минимальный поток. После заселения PLBR (Рисунок 5A) фаза роста и наблюдения инициируется заменой бактериального раствора на питательную среду (Рисунок 5B). Когда PLBR полностью зарастают (Рисунок 5C), эксперимент обычно останавливают, после чего можно проанализировать изображения таймлапс-съемки. Для получения более подробной информации о механизмах захвата и профиле потока внутри PLBR читателю рекомендуется обратиться к работе Grünberger et al.13 .
Анализ скорости роста
Данную систему можно применять для изучения различных видов бактерий в отношении разных биологических параметров, таких как рост, морфология или флуоресцентный сигнал. В первом примере C. glutamicum, промышленно значимый продуцент, культивировали в стандартных условиях культивирования (T=30 °C, среда CGXII21). На рисунке 6A показаны кривые роста, полученные от трех изогенных микроколоний. Экспоненциальный рост сохраняется до заполнения PLBR, что указывает на отсутствие ограничения по питательным веществам. На рисунке 6B представлены четыре изображения растущей колонии C. glutamicum, полученные с помощью таймлапс-микроскопии в дифференциально-интерференционном контрасте (DIC).
Флуоресцентный анализ
Для флуоресцентной микроскопии одиночных клеток исследователи часто используют специфические флуоресцентные белки, например GFP или его производные, чтобы связать интересующий фенотип с измеряемым результатом (флуоресцентным сигналом). Чтобы продемонстрировать применимость PBLR для исследований тайм-лапс флуоресценции, мы изучили флуоресцентную эмиссию штамма C. glutamicum, продуцирующего плазмидно-кодируемый слитый белок YFP-TetR под контролем промотора Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)18,22. Известно, что при низких концентрациях индуктора (IPTG) экспрессия с Ptac приводит к значительной вариабельности между клетками в изогенных бактериальных популяциях. Начиная с одной прекультуры, мы наблюдали за ростом и флуоресценцией одиночных клеток нескольких изогенных микроколоний. Как видно на Рисунке 7, мы наблюдали фенотипическую гетерогенность между разными микроколониями, а также гетерогенность на уровне одиночных клеток внутри колоний, произошедших от одной материнской клетки. Одна колония (Рисунок 7B, PLBR 1) почти не проявляла флуоресцентной эмиссии, в то время как клетки PLBR 2 демонстрировали слабую флуоресцентную эмиссию из-за базальной экспрессии yfp-tetR с промотора Ptac. В PLBR 3 флуоресцентная эмиссия была значительно сильнее по сравнению с другими колониями и наблюдалось широкое распределение популяции. Этот пример демонстрирует применимость PBLR для исследований методом тайм-лапс флуоресцентной микроскопии. По сравнению с проточной цитометрией, при которой флуоресценция одиночных клеток может быть определена в один момент времени, данная система позволяет отслеживать клетки и изучать флуоресценцию одиночных клеток в режиме реального времени на протяжении многих поколений.
Рисунок 1. Обзор процесса производства чипа PLBR. Изготовление мастер-формы: начиная с (A) проектирования, (B) изготовления литографической маски и (C) производства пластины. Производство чипа из ПДМС и стекла: начиная с (D) формования ПДМС с последующим (E) прикреплением стекла и ПДМС и (F) окончательной сборкой чипа.
Рисунок 2. Конструкция чипа PLBR. (A) CAD-чертеж всего микрофлюидного чипа; (B) Увеличенное изображение отдельных участков схемы: схема содержит два входа для среды (a1), генератор градиента с каналами смешивания (a2) и 6 параллельных массивов PLBR (b1). На фрагменте b2) показан один PLBR, встроенный в жидкостный канал шириной 100 µm. PLBR имеет внутренний диаметр 40 µm и каналы для питательных веществ шириной 2 µm. Длина входного отверстия для посева составляет 40 µm. Розовым цветом обозначен первый слой (область захвата и культивирования), синим цветом — второй слой (транспорт жидкости).
Рисунок 3. Иллюстрация процесса изготовления двухслойной пластины. (A) Изготовление первого слоя, содержащего удерживающие структуры; (B) Изготовление второго слоя, содержащего жидкостные каналы, входы и выходы; (C) Репрезентативные профили поверхности первого слоя. В данном случае высота первого слоя составила 1,200 nm; он используется для культивирования C. glutamicum в комплексной среде.
Рисунок 4. Изготовление устройства и пример чипа. Иллюстрация процесса формования ПДМС: (A) смешивание и дегазация ПДМС; (B) формование ПДМС; (C) извлечение из формы, резка и склеивание чипа. Готовый чип (воспроизведено с разрешения Royal Society of Chemistry13): (D) фотография ПДМС-чипа с 2 входами и 1 выходом; (E) CAD-изображение шести параллельных массивов, каждый из которых содержит 5 PLBR; (F) СЭМ-изображение одного PLBR.
Рисунок 5. Принцип работы системы PLBR. (A) Фаза посева; (B) Фаза роста бактериальных микроколоний; (C) Фаза перелива. Воспроизведено с разрешения Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.
Рисунок 6. Определение скорости роста микроколоний C. glutamicum дикого типа (WT). (A) График роста трех культур в PLBR и полученные экспоненциальные кривые (части воспроизведены с разрешения Royal Society of Chemistry)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Изображения растущей колонии C. glutamicum в режиме таймлапс.
Рисунок 7. Анализ гетерогенности популяции на основе PBLR. Показан штамм C. glutamicum, экспрессирующий слитый белок yfp-tetR под контролем промотора Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) в отсутствие индуктора IPTG. (A) Схема хода эксперимента; (B) Три изогенных микроколонии, демонстрирующие межколониальную и внутриклеточную гетерогенность; (C) Распределение флуоресценции отдельных клеток внутри соответствующих микроколоний.
Рисунок 8. СЭМ-изображения различных PLBR.** СЭМ-изображения, демонстрирующие входные отверстия для посева с целью оптимизации эффективности захвата. (A) Более крупные входные отверстия для посева (B) Более мелкие входные отверстия для посева (C) Более крупные «открытые» входные отверстия для посева (D) Два входных отверстия для посева.
| Этап | Проблема | Возможная причина | Решение |
| Изготовление пластины | Пузырьки воздуха в SU-8 во время предварительного отверждения | Слишком быстрый подъем температуры | Провести отверждение при 95 °C и 65 °C несколько раз |
| Изготовление пластины | Исчезновение или разрушение структур из SU-8 | Неоптимальная процедура изготовления; механическое напряжение в структурах из SU-8 | Оптимизировать такие параметры, как время отверждения и время экспозиции |
| Изготовление пластины | Слишком низкая, высокая или неравномерная толщина слоев SU-8 | Проблема при центрифугировании (spin-coating) | Проверить параметры центрифуги и зажим пластины |
| Склейка и сборка чипа | Коллапс PLBR | Неоптимальные параметры склейки PDMS | Отрегулировать мощность, время воздействия плазмы и время отверждения после склейки |
| Склейка и сборка чипа | Загрязнение структур и наличие частиц в PLBR | Чип был очищен ненадлежащим образом | Использовать клейкую ленту для очистки поверхности |
| Склейка и сборка чипа | Недостаточное приклеивание PDMS к стеклу | Неоптимальные параметры склейки или недостаточная очистка | Проверить настройки кислородной плазмы |
| Микрофлюидный эксперимент | Утечка жидкости | Отверстие входа/выхода было пробито неправильно | Оптимизировать процесс пробивания отверстий |
| Микрофлюидный эксперимент | Появление множества мелких частиц PDMS при заполнении | Отверстие было пробито неправильно | Оптимизировать процесс пробивания отверстий |
| Микрофлюидный эксперимент, биологический аспект | Отсутствие роста клеток | Остатки растворителя после процедуры очистки | Более тщательно промыть чип перед загрузкой клеток или дать растворителю испариться до склейки |
| Микрофлюидный эксперимент, биологический аспект | Изменение темпов роста | Различные причины | Проверить прекультуру и температуру |
| Микрофлюидный эксперимент, биологический аспект | Изменение морфологии клеток в процессе культивирования | Ограничение питательных веществ или скачок температуры | Проверить инкубатор и поток |
| Микрофлюидный эксперимент, технический аспект | Дрифт положения при тайм-лапс микроскопии | Колебания температуры | Проверить температурный профиль перед экспериментами до полного исчезновения осцилляций |
| Микрофлюидный эксперимент, технический аспект | Потеря клеток в процессе культивирования | Слишком большая высота реактора | Оптимизировать высоту реактора |
| Микрофлюидный эксперимент, технический аспект | Отсутствие захвата клеток | Слишком низкая высота реактора | Оптимизировать высоту реактора |
Таблица 1. Поиск и устранение неисправностей. В этой таблице обобщены критические аспекты, распространенные ошибки и возможные способы их решения в ходе экспериментальной работы.
Обсуждение
Мы описали изготовление, экспериментальную установку и связанные с этим процедуры работы микрофлюидного PDMS-устройства, содержащего несколько (PLBRs) для анализа одиночных клеток бактерий.
Микропроизводство с использованием методов мягкой литографии позволяет быстро корректировать размеры устройства для различных размеров и морфологии бактерий. В настоящее время мы оптимизируем биореактор пиколитер с точки зрения культивирования различных микробных организмов и производительности культивирования. Для повышения эффективности улавливания также оптимизируется геометрия реактора. На рисунке 8 показаны четыре новых устройства PLBR, которые в настоящее время проверены. На всех рисунках посевной канал был переработан с учетом ширины и формы. На практике это, по-видимому, влияет на количество клеток, которые находятся в ловушке, но требует дальнейших исследований. Значительное повышение эффективности улавливания также было достигнуто за счет включения дополнительных переливных каналов, что привело к увеличению конвекционного потока через реактор и увеличению числа улавливаемых ячеек. Однако в то же время увеличивается риск вымывания клеток во время культивирования.
Устройство является интересной альтернативой макромасштабному выращиванию, которое десятилетиями использовалось для исследования процессов роста и производства на уровне отдельных клеток. Тем не менее, у него есть несколько важных требований: для параллельного мониторинга нескольких биореакторов пиколитер обязательна полностью моторизованная микроскопическая установка с высоким разрешением и компенсацией дрейфа фокуса. Кроме того, необходима инкубационная система для поддержания желаемой постоянной температуры выращивания на протяжении всех измерений.
Мы достигаем 95% успеха в производстве устройств. Основные проблемы связаны с неэффективным соединением PDMS со стеклом, обрушением крыши PDMS или утечкой жидкости (см. Таблицу 1 для поиска и устранения большинства возникающих проблем). Хотя экспериментальная работа частично проводится в нестерильных условиях, мы редко видим загрязнение во время экспериментов из-за закрытой жидкостной системы. Микрофлюидные устройства PDMS оптически прозрачны, поэтому могут использоваться для визуализации in vivo с высоким разрешением. Несмотря на то, что PDMS кажется идеальным для этого применения, он обладает высоким сродством к гидрофобным молекулам, что ограничивает использование растворителей, которые широко используются в биокаталитических процессах всей клетки. Тем не менее, существуют подходящие покрытия для адаптации протокола к таким видам применения.
Предложенный PLBR хорошо подходит для пространственно-временного анализа клеточных и даже субклеточных событий различного рода бактерий. Основное преимущество данного подхода заключается в возможности количественной оценки роста микроколоний напрямую, в отличие от традиционных методов. Кроме того, PLBR позволяет культивировать в определенных и постоянных условиях. Поскольку система позволяет использовать небольшое количество реагентов или материалов, она обладает такими преимуществами, как недорогая, настраиваемая и поддающаяся высокой производительности. В традиционных методах при анализе культивирования микроорганизмов учитываются средние значения по всей популяции. Кроме того, существующие методы требуют ручного отбора проб, что может привести к ухудшению качества проб и, следовательно, к ошибкам при измерении. PLBR открывает новые перспективы для развития биопроцессов и анализа популяционной гетерогенности в микробиологии. PLBR является многообещающим инструментом для различных применений в области разработки биопроцессов и может быть применен в различных областях исследований, например, в анализе межклеточной гетерогенности, анализе конкретных клеточных кластеров в клеточных линиях, скрининге штаммов микробной продукции и исследовании клеточных фенотипов в режиме реального времени.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить техника Агнес Мюллер-Шрёер за ее ценный вклад. Эта работа была частично выполнена на наноэлектронной установке имени Гельмгольца (HNF) в Forschungszentrum Jülich GmbH. Авторы благодарны за щедрую помощь и поддержку.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кремниевая пластина диаметром 100 мм, P/BOR < 100> | Si-MAT, Кремниевые материалы, Германия | ||
| Фоторезист SU-8 2000.5 | Micro Resist Technology GmbH, Германия | ||
| Фоторезист SU-8 2010 | Micro Resist Technology GmbH, Германия | ||
| SU-8 Разработчик mr DEV- 600 | Micro Resist Technology GmbH, Германия | ||
| Полидиметилсилоксан (PDMS) Sylgard 184 Набор | силиконовых эластомеровDow Corning; Farnell GmbH, Германия | ||
| Диспенсерные иглы Precision Tips 27 G; ID = 0,2 мм, OD = 0,42 мм | Nordson EFD Deutschland, Германия | ||
| Стеклянные пластины D263 T eco, 30 мм x 25 мм x 0,17 мм | Schott AG, Германия | ||
| Дырокол AKA 5130-B-90 | Harris Uni-Core | ||
| Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 мм, OD = 0,76 мм | Saint Gobain; VWR International GmbH, Германия | ||
| Одноразовые шприцы – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 мл | B. Braun Melsungen AG, Германия | 552-183143 | |
| Шприцы, 1 мл шприцы из стерильного стекла | INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Германия | ||
| Chemicals | |||
| (NH4)2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| Urea | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| MgSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| MOPS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| FeSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| MnSO4• H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| ZnSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| CuSO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| NiCl2• 6H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| CaCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| Biotin | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| Procatechuic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия | ||
| BHI | Becton, Dickinson | ||
| Cells | |||
| Corynebacterium glutamicum ATTC 13032 | DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Германия | ||
| Escherichia coli MG 1655 | DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Германия | ||
| Оборудование | |||
| очистки вафель SSEC 3300 | Solid State Equipment LLC | ||
| Spin Coater SPIN150 -NPP | SPS Europe B.V. | ||
| Выравниватель маски MA-6 | Горячая плита Карла Зюсса | ||
| HP30A - 2 | Торри Пайнс | ||
| Печь Memmert UN 200 | Memmert | ||
| Очиститель плазмы FEMTO | Diener Electronics, Германия | ||
| neMESYS шприцевые насосы | Cetoni GmbH, Германия | ||
| Магнитная мешалка CB 162 | Stuart | VWR 442-0304 | |
| Микроскоп Nikon Eclipse Ti | Микроскоп | ||
| Микроскоп инкубатор | Pecon GmbH, Германия | ||
| Центрифуга minispin plus " Черная линия" | Eppendorf | 9776501 | |
| Фотометр BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132000008 | |
| Shake колба/инкубатор 3031 | GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Германия | ||
| Профилометр, Dektak 150 Stylus Profiler | Veeco |
Ссылки
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).
- Wei, P., et al. Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells. Nature. 488, 384-388 (2012).
- Park, S., et al. Influence of topology on bacterial social interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).
- Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging. BioTechniques. 44, 91-95 (2008).
- Kobel, S. A., et al. Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps. Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).
- Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. Dynamic single cell culture array. Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).
- Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response. Science. 334, 366-369 (2011).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Fritzsch, F. S. O., et al. Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments. Lab Chip. 13, 397-408 (2013).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. Streaming Instability in Growing Cell Populations. Phys. Rev. Lett. 104, (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).
- Grunberger, A., et al. A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level. Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).
- Walden, M., Elf, J. Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution. Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. Computation of mutual fitness by competing bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).
- Grunberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13, (2012).
- Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids. Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb. Cell Fact. 8, (2009).
- Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).
- Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3. J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).
Перепечатки и разрешения
