Полный и обновленный "Коловратки поликультуры Метод" для выращивания первого кормления данио рерио

Краткое содержание

Личинки данио-рерио приспособлены к питанию зоопланктоном. Извлечь выгоду из этой природной особенности можно в лаборатории, выращивая сначала кормящихся рыб вместе в одной системе с живыми морскими коловратками. Эта стратегия «поликультуры» способствует высокому росту и выживаемости с минимальными трудозатратами и беспокойством личинок.

Аннотация

Рыбка данио (Danio rerio) является модельным организмом, значение которого возрастает во многих областях науки. Одним из наиболее сложных технических аспектов выращивания этого вида в лабораторных условиях является выращивание личинок первого кормления до ювенильной стадии с высокими темпами роста и выживаемости. Основная задача управления в этот период развития заключается в том, чтобы поставлять рыбе высокопитательные корма практически на постоянной основе без ущерба для качества воды. Поскольку личинки данио-рерио хорошо приспособлены к питанию мелким зоопланктоном в толще воды, живые кормовые объекты, такие как брахионидные коловратки, артемия и парамеций, широко признаны в качестве предпочтительных кормов, по крайней мере, до тех пор, пока рыбы не достигнут стадии молоди и не смогут эффективно питаться переработанными рационами. Этот протокол описывает метод, при котором только что вылупившиеся личинки данио культивируются вместе с живыми морскими коловратками (Brachionus plicatilis) в одной и той же системе. Такой поликультурный подход обеспечивает рыбу богатым питательными веществами источником живого корма «по требованию» без образования химических отходов в количествах, которые в противном случае ограничивали бы продуктивность. Важно отметить, что, поскольку система использует как естественную высокую продуктивность коловраток, так и поведенческие предпочтения рыб, трудозатраты, связанные с обслуживанием, невелики. В следующем протоколе подробно описана обновленная пошаговая процедура, которая включает в себя производство коловраток (масштабируемое до любого желаемого уровня) для использования в поликультуре личинок и коловраток данио-рерио, что способствует максимальной производительности в течение первых 5 дней экзогенного кормления.

Введение

Данио (Danio rerio) является выдающимся лабораторным животным используется в растущем числе научных дисциплин, в том числе, но не ограничиваясь генетики развития, токсикологии, поведения, аквакультуры, регенеративной биологии и моделирования многих человеческих расстройств ^{1 - 5.} Хотя вид сравнительно легко поддерживать в лаборатории, существует ряд проблем управления, связанных с их культурой ^6. Наиболее известным из них является личиночной разведение, особенно когда рыба впервые начинают кормить после инфляции газ мочевого пузыря ^7. В нормальных условиях, контролируемых, это событие происходит в развития ~ 5 дней после оплодотворения (DPF), с учетом следующих 3 - 5 дней роста является особенно критической ^7. Центральный техническая трудность на этом этапе является адекватно отвечать питательные требования первого личинок кормления - элементы подачи должна быть соответствующего размера, Digesвержены, привлекательный, и доступны на почти постоянной основе, не создавая чрезмерного отходов в культивирования танков. Исторически это было достигнуто, как правило, путем предоставления многочисленных небольших количеств корма для рыбы в резервуарах, наряду с обычной водообмена ^8,9. Хотя эти методы в какой-то степени успешными, они неэффективны, требуют высоких затрат труда, и вернуться только переменную и ограниченные темпы роста и выживания ^10.

В природе, по-видимому данио личинки питаются обильными небольшой зоопланктона настоящее время в толще воды ^11. По этой причине, larviculture протоколы, которые включают живые каналы, такие как Рагатесшт, коловраток и Artemia обычно наиболее эффективным ^7. В 2010 году, лучшее и соавторы показали, что можно было выращивать личинок данио в статическом, солоноватой воды наряду с морских коловраток за первые 5 дней экзогенного питания ^12. Этот подход, который использоватьES естественный высокая производительность коловраток культур, чтобы обеспечить достаточное, очень питательный добычу, не загрязняя воду, дает очень высокие темпы роста личинок и выживания с низкой трудоемкости ^12,13. В последние годы все большее число лабораторий по всему миру приняли изменения этого протокола, и сейчас многие культивирования коловраток в непрерывном режиме, чтобы поддержать детские системы ^14.

За последние несколько лет, как методы коловратки / данио поликультуры и производства коловратки были уточнены и улучшены, чтобы стать более стандартизированными и легко масштабируемым. Эта статья предусматривает шаг за шагом инструкции для 1) непрерывный и надежный производства коловраток и 2) создание коловратки / данио системы поликультуры используется для поддержки высоких темпов роста рыбы в течение первых 5 дней экзогенного питания.

Протокол

1. Коловратки Культура

1. Основные компоненты системы культуры, используя сосуд 100 л культуры
   1. Соберите все компоненты, необходимые для установки коловраток культуры. Установка коловраток культура состоит из сосуда для культивирования (CV), чтобы расти коловраток; подобный сосуд для поддержания feedout коловраток (feedout культура сосудов, FCV); с круглым дном вылупления банку (поток водохранилище, FR) для хранения корма водоросли смеси (АСМ); подачи воздуха (АС) для аэрации резюме, FCV и FR; перистальтический насос с таймером замера (ФЭУ) для управления доставку корма водорослей в CV и FCV; и фильтр нить частиц (FPF), который сидит внутри CV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список расходных материалов и компонентов обеспечивается в список материалов.
2. Конфигурация
   1. Поднимите резюме и FCV на стенде или столе так, что культуры могут быть легко собраны с помощью дренажный штуцер в сборник продолжениеainer (Рисунок 1). Использование гибкий шланг подачи воздуха для подключения как к длине жесткой трубке в каждом культуральном сосуде. Убедитесь, что трубка достаточно долго, чтобы подавать воздух в нижней части CV или FCV.
   2. Использование воздушной линии малой мощности для подключения как к длине жесткой трубке, который простирается до нижней части FR, содержащей AFM. Установите клапан в каждой воздушной линии для регулирования потока воздуха. Подключите FR на ФЭУ с доставкой корма трубки, и запустить трубопровод от ФЭУ в отверстие, просверленное в стороне CV / FCV, ближе к началу. Рисунок 1.
3. Запускать
   1. Заполните культурального сосуда до 90% доступного объема с обратным осмосом воды (RO). Если РО не доступен, используйте чистую, дехлорированию муниципальной воды; Однако, оценка риска биологической защиты должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что никакие потенциально патогенные организмы не присутствуют в исходной воде. ПРИМЕЧАНИЕ: Такой анализ может быть проведенлюбой квалифицированный тестирования воды лаборатории.
   2. Доза культурального сосуда воду с аквариума соли достичь соленость 15 г / л. Установите воздушный поток в емкость так, чтобы она поддерживает "кипения", а затем медленно добавляют измеренное количество соли в сосуде для культивирования, пока не растворится полностью аэрацией. Продолжить аэрации воды в течение> 1 часа, чтобы гарантировать, что он полностью кислородом.
   3. Сделайте смесь корма водоросли. К 3 л чистой, свежей дехлорированию (0 частей на миллион) воды добавить 100 г NaHCO ₃ и 100 г аммиака (нейтрализатор hydroxymethylsulfonate натрия). Этот последний реагент обеспечивает дополнительное преимущество нейтрализации остаточного хлора из водопроводной воды или остатков отбеливающих веществ из дезинфекции питательной оборудования. Это имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы эти соединения полностью растворяют. Затем добавить 1 л концентрата водорослей (биомассы сухого веса ~ 15%). Добавить сырьевой смеси в FR и хранят при температуре 4 ° С.
   4. Добавить закваски 5 - 10 млн коловратки Brachionus plicatilis к резюме, содержащие газированную 15 г / л Соленость воды. Если коловратки были охлажденным во время транспортировки или хранения, они должны быть постепенно (в течение 30 мин или дольше) приспособиться к температуре воды в культуральный сосуд (25 - 27 ° C).
   5. Включите PMT и начать прокачку канал водорослей в коловраток сосуда для культивирования. Использование функции таймера ФЭУ, установить скорость доставки подачи смеси водорослей, так что ~ 1,6 мл водорослей исходной смеси подается на миллион коловраток в культуре, за день. Распределите кормление небольшими порциями через равные промежутки времени в течение периода 24 ч; Чем чаще кормления, тем лучше.
   6. Калибровка скорости доставки насоса вручную поворотом на ФЭУ в течение установленного периода (например, 1 мин) и собирают водоросли, что насосы в течение этого интервала в мерный цилиндр или стакан. Например, если в дозах PMT 5 мл водорослей в 1 мин, затем дозы были бы5 мл водорослей / мин.
   7. Рассчитать необходимое ежедневное скорость подачи путем умножения количества коловраток, присутствующих в миллионах, в 1,6 мл. Например, коловратка культура с численности населения 100 млн коловратках потребует ~ 160 мл корма в сутки (100 х 1,6 мл).
   8. Установите PMT дозировать общую суточную потребность корма на регулярные промежутки времени в течение периода 24 ч. Например, доставка из ежедневного количества корма 160 мл может быть доставлено в порциями каждые 3 ч в течение 24 ч с использованием набора PMT со скоростью дозирующего насоса 5 мл / мин в течение 4 мин, 8 раз в день (5 мл / мин х 4 мин = 20 мл х 8 кормление = 160 мл).
   9. Разрешить культура расти, пока не генерирует необходимую населения, как правило, в течение 48 - 72 ч, до сбора урожая. В 24 ч после запуска, добавьте ваты фильтры частиц в сосуд для культивирования и начать нормальную обслуживания.
4. Обслуживание
   Примечание: Культура работает в непрерывном режиме и требует Routinе технического обслуживания, что в идеале должна быть выполнена в то же время каждый день, в следующей последовательности.
   1. Заполните FCV до 90% доступного объема чистой, дехлорированная пресную воду, которым вводили 10 г / л аквариумной соли. Убедитесь, что вода хорошо перемешивается, и что все соли полного растворения. Установите поток воздуха в сосуд таким образом, что он поддерживает "кипеть" подвижного. Измерить соленость при помощи рефрактометра и гарантировать, что соленость 10 г / л. Это имеет решающее значение для достижения этой цели и не превышать его.
   2. Образец коловраток в резюме: Убедитесь, что культура является также смешанные, затем собрать 3 образца в 2 - 3 мл каждого помощью пипетки передачи или autopipettor, из разных частей культуры. Объедините эти образцы в трубке или флакон удобного размера (например, 10 мл).
   3. Передача 1 - 2 мл комбинированного образца на чашку Петри таким образом, чтобы его можно визуализировать при вскрытии микроскопом. Проверьте качество культуры (плавание поведение изколовратки, наличие отдельных яиц, загрязняя простейшие).
   4. Иммобилизации коловраток в оставшихся в сочетании образца добавлением 100 мкл 50% -ного раствора йода Lugols к образцу. В течение нескольких секунд после добавления Lugols соблюдать коловраток, чтобы остановить плавание. Теперь, легко подсчитать коловраток.
      Примечание: этанол, разбавленный отбеливатель или уксус можно использовать вместо Lugols. Уксус (2 капли / 10 мл) имеет преимущества быть неопасные, не теряя силы в хранении как отбеливатель и йода решений может, и не делает договор коловратки, поэтому корона ресничек и "ноги" остаются продлен и животные выглядят более естественно.
   5. Обеспечить, чтобы образец хорошо перемешивается (иммобилизованные коловратки будет быстро оседают), а затем быстро принимать мл подвыборку ~ 2 в пластмассовом пипетки и выдаваемых 1 мл в Седжвик-стропильных подсчета слайд (20 х 50 1 мм квадраты) (рис 2 ). Использование рассекает микроскоп или соединение, рассчитывать неповрежденные коловраток и тОБЩИЙ количество яиц, прикрепленных к этим коловраток (рисунок 2). Граф, как большая часть области, как слайд-стоит рассчитывать ~ 100 коловраток. Рассчитать количество коловраток в мл, и записать это в таблице или журнале.
   6. Урожай ~ 30% от объема коловраток в резюме: Удалить подачу воздуха и мулине фильтр, медленно откройте клапан в нижней части резюме и дайте воде стечь в планктона коллектора с сито 53 мкм. Сбор воды из нижней части коллектора после фильтрации в ведро или слив. Используйте нежный умеренной потока, чтобы избежать повреждения коловраток. Не позволяйте коловратки сушить на экране.
   7. По соображениям согласованности, целесообразно установить FCV со стандартным номером коловраток каждый день. Таким образом, на основе известной плотности CV коловратка и сбора объема, регулировать громкость общее FCV до получения однородной конечной плотности (например., 1500 коловратки / мл). Добавить заготовленную ротиFERS к FCV: Осторожно передачи коловраток с экрана сбора использования промывающего бутылку с чистой соленой водой (10 - 15 г / л). Обратить экран над FCV и мыть коловраток в FCV с нежным потоком соленой воды. Начните PMT доставить корм (~ 1,57 мл на миллион коловраток в день) в FCV.
   8. Скраб весь внутренность CV с чистой, мягкой нейлоновой щеткой или чистящей площадки.
   9. Создать новую смесь 15 г / л воды путем добавления соответствующего количества соли в отмеренное количество чистой воды обратного осмоса в 5 галлонов ведро, чтобы заменить объем воды теряется урожай. Добавьте соль к воде в ведре и перемешать энергично, пока она полностью не растворится, а затем добавить к CV.
   10. Использование спрей высокого давления в раковине, промыть фильтр мулине, пока он не свободен от мусора, а затем вернуть его в резюме.
   11. Регулировка скорости подачи водорослей подаваемого в CV, изменяя продолжительность каждой дозирующей случае, в соответствии с ежедневной подсчета коловраток / мл.С помощью расчетов, приведенные в шаге 1.3.8, выше, чтобы определить соответствующее количество корма будет доставлено.
   12. Примерно 24 часа спустя, повторить процесс. Сначала уборки коловраток оставшиеся в FCV (которые не были необходимы для предыдущий день) таким же образом, как описано выше (этапы 1.4.2 - 1.4.10). Концентрат их в 2 л свежей, чистой воды (дехлорированию 5 г / л соли). Они могут храниться при температуре 4 ° С в качестве резервного питания, или на корм поздние стадии рыбы, за то, что описано в данном протоколе.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол позволяет до 2 - 3 дней сниженным содержанием культуры (с нормальной автоматической подачи), потому что коловратки в CV может терпеть бездействие урожаев без серьезных последствий.

2. поликультуры

1. Настроить
   1. Сбор эмбрионов данио из события нереста путем заливки породил эмбрионов через ситечко, а затем аккуратно промывая стерильных мксч воды (или любой другой, не загрязненных источником соответствующим условного раствора; например, эмбрион среднего, Е3, и т.д.) из промывной бутылки в чашках Петри.
   2. Инкубируйте эмбрионов на 25 - 28 ° C в чашках Петри при плотности 40 - 50 эмбрионов на чашку в течение 5 дней.
   3. Начните фазу поликультура на 5-й день после оплодотворения, или когда больше, чем 90% вылупившихся личинок активно плавать в толще воды.
2. Прививка
   1. Добавить 500 мл коловратки культуры непосредственно из FCV до 3,5 л питомника бак; включение коловраток культуры воды обеспечивает подачу водорослей, который поддерживает содержание питательных из коловраток во поликультуры.
   2. Аккуратно влить личинок из одной чашки Петри в детском бака. Убедитесь, что нет личинки остаются в блюдо.
   3. Добавить 500 мл чистой, кондиционированной рыбы воды из системы рециркуляционного или специального источника воды в бак для достижения конечного объема 1 л и окончательное Salinity 5 г / л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот соленость важно, потому что данио выживание личинок будет негативному воздействию, если соленость> 7 г / л и выживания коловраток будет негативному воздействию, если соленость <2 г / л.
3. Поликультуры фаза
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза поликультура должен длиться до 4 дней после инокуляции (в общей сложности 5 дней, что соответствует 5-9 дней после оплодотворения).
   1. Соблюдайте поликультура бак по крайней мере, один раз в день в течение этого периода для того, чтобы коловратки и рыбы присутствуют и растет. Убедитесь, что коловратки могут видеть по всей толще воды. Убедитесь, что в Fishs также видны в толще воды, плавая среди коловраток.
   2. Начните нормальный поток воды через бак. Поместите экран или перегородка над сливной порт для обеспечения личинок не вымываются из резервуара.
      Примечание: В конце этого этапа, рыба будет достаточно большим, чтобы потреблять крупные предметы, такие как добычу Artemiaнауплии или обработанные предметы подача в диапазоне размеров от 75 - 125 мкм.
      Примечание: динамика коловратка населения внутри представительного поликультуры бака были измерены путем отбора проб / подсчета коловраток из резервуара таким же образом, как описано в шагах 1.4.2 - 1.4.5. Это было сделано один раз в день с начала фазы поликультуры, пока она не была завершена.

Результаты

Система непрерывного коловраток культура описано здесь является динамичным, и это нормально для числа коловраток колебаться в небольшой степени в течение долгого времени, если есть изменения в повседневной ставки кормления и уборки. Население коловраток в одном из активных культур в объектах аквакультуры в больнице Бостона Детский, поддерживается в порядке, описанном выше, наблюдали в течение 30 дней (Рисунок 3). Плотность культуры среднее течение этого периода было 932 ...

Обсуждение

Успешная реализация метода поликультуры коловраток для кормления личинок данио раннего требует эффективных протоколов для двух задач: установление и поддержание системы непрерывного коловраток культуры, чтобы накормить рыбу, и культивирование первой кормления личинок данио вместе с коловраток в одном танке.

Установка для непрерывного соленой коловратки производственной системы для лабораторий данио, впервые описанных Лоуренса и соавторов ¹⁴ была изменена и расширена в несколькими ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Rotifer Culture Infrastructure
100 л Резервуар для культивирования	Aquaneering	Изготовленный на заказ	поликарбонатный сосуд для культивирования, с коническим дном, со сливным клапаном
5 галлонов Набор ведра для культивирования	Тростниковая марикультура	CCS Стартовый комплект	Малый объем для культивирования для небольших объектов
Жесткая прозрачная трубка 1/2" O.D., 36 дюймов	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Жесткая прозрачная трубка для подачи воздуха
Сетчатая трубка	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Сетчатая трубка опора для фильтра для зубной нити
Коловратка	Тростниковая	Коловратка 12" x 42"	Уловитель твердых частиц
Перистальтический дозирующий насос-таймер, 5 GPD	Grainger	38M003	Насос-дозатор с таймером для дозирования подачи корма на коловраток
Перистальтический дозирующий насос с таймером, 1-100 мл/ч (для мелкомасштабной культуры)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Дозирующий насос с таймером для дозирования подачи корма на коловраток
Силиконовые трубки	Cole Parmer		Трубка для подачи водорослей в сосуд для коловратки
Жесткая прозрачная трубка "O.D.,36"	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Жесткая прозрачная трубка для подачи воздуха в пасту из водорослей
Rigid Clear Tubing O.D., 36"	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Жесткая прозрачная трубка для доставки водорослей
Rotifers
Живая коловратка Brachionus plicatilis Type L	Тростниковая марикультура	Тип L 5 миллионов	Порода коловраток для системного запуска
Rotifer Feed
Гидроксиметилсульфонат натрия	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1 фунт	Понизитель аммиака для кормовой смеси для водорослей
Бикарбонат натрия	Fisher Scientific	S25533B	pH-буфер для кормовой смеси для водорослей
Концентрат микроводорослей	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 литровый мешок	Оптимизированный по питательным веществам корм для коловраток
RG Complete	Reed Mariculture	RG Полная бутылка на 6 унций	Все в одном корм на основе микроводорослей для мелкомасштабных культур
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Соль для приготовления питательной воды (ПРИМЕЧАНИЕ: этот пункт является только примером; можно использовать любые составы соли, не содержащей загрязняющих веществ).
Рефрактометр	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	для измерения солености
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 мкм	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Сетчатый экран для сбора коловраток
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Губка для чистки внутри емкостей для культивирования
Щетка для чистки
Ведро	Grainger Supply	43Y530	Ведро градуированное для смешивания культурной воды
Инкубационная банка	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Хранение кормовой смеси для водорослей
Lugol' s Раствор, разбавленный	Fisher Scientific	S99481	Агент, используемый для иммобилизации живых коловраток для подсчета
планктона Седжвик-Стропильный планктонный слайд с сеткой	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Счетные коловратки
Miscelleneous
Кухонное ситечко для чая		971972	Используется для сбора эмбрионов данио-рерио после нереста