Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

3D анализ Мультиклеточных реакций на Хемоаттрактантные градиенты

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59226

⸱

24 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering and Yale Systems Biology Institute, Yale University, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 3Center for Cell Dynamics and Department of Cell Biology, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод для построения устройств для 3D-культуры и экспериментов с клетками и многоклеточных органоидов. Это устройство позволяет анализировать клеточные реакции на растворимые сигналы в 3D микросредах с определенными хемоаттрактантом градиентами. Органоиды лучше, чем одиночные клетки при обнаружении слабых шумных входов.

Аннотация

Различные ограничения систем 2D клеток культуры вызвали интерес к 3D клеток культуры и анализа платформ, которые лучше имитируют пространственную и химическую сложность живых тканей и имитировать в естественных условиях ткани функций. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали развитию 3D-среды в пробирке, в которой клетки могут быть интегрированы в четко определенную внеклеточной матрице (ЕСМ) и определенный набор растворимых или матричных связанных биомолекул. Однако технологические барьеры ограничивают их широкое применение в исследовательских лабораториях. Здесь мы описываем метод построения простых устройств для 3D-культуры и экспериментирования с клетками и многоклеточных органоидов в 3D микросредах с определенным градиентом хемоаттрактанта. Мы проиллюстрируем использование этой платформы для анализа реакции эпителиальных клеток и органоидов на градиенты факторов роста, таких как фактор эпидермального роста (EGF). Градиенты EGF были стабильными в устройствах в течение нескольких дней, что привело к созданию направленной ветви в органоиды молочной железы. Этот анализ позволил нам заключить, что коллективный градиент зондирования группами ячеек более чувствителен против одиночных ячеек. Мы также описываем метод изготовления, который не требует фотолитографии объектов, ни передовые методы мягкой литографии. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения в контексте анализа развития и патологических состояний, включая рак.

Введение

В физиологических условиях, клетки встроены в внеклеточной матрицы (ЕСГ) и подвергается множество биомолекул. Взаимодействия между клетками и окружающей микросредой регулируют внутриклеточные процессы, контролирующие различные фенотипы, включая миграцию, рост, дифференциацию и выживание1,2. Многое было изучено о клеточных поведениях в обычной культуре 2D клеток. Однако, с появлением внутриклеточной визуализации и экспериментов с клетками, встроенными в 3D-гидрогели, важные различия в поведении клеток были признаны в упрощенном 2D в пробирке культур против 3D-ткани, как сред. В то время как клетки взаимодействуют с ПОМЕХОГЕНЕРАТОРАМИ и чувствуют их механические свойства в 3D матрице, жесткость материала геля не является полностью независимой переменной в системе 2D в пробирке. Размерность изменяет формирование фокусной адгезии, что приводит к разной морфологии клеток и поведению. Кроме того, ячейки на 2D поверхности подвержены меньшему сигналу сигнализации, чем ячейки, открытые для всех направлений в 3D.

Эти ограничения увеличили интересы для 3D-систем, которые представляют пространственную и химическую сложность живых тканей и лучше предсказать в естественных условиях ткани функции. Они были разработаны во многих формах от органоидов как самостоятельной сборки клеточных микроструктур для клеток случайным чередовались в ЕСГ3,4. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали появлению различных типов систем 3D-культуры5,6,7,8,9 для изучения фенотипических изменений и Сотовые ответы на растворимые сигналы; Однако технологические барьеры ограничивают широкое применение в исследовательских лабораториях. Во многих случаях процессы изготовления требуют методов фотолитографии и фоновых знаний для мягкой литографии. Кроме того, необходимо контролировать различные факторы, чтобы успешно построить устройство и достичь оптимальной функции устройства в течение длительного периода времени.

Наш метод описывает, как построить 3D PDF-устройство для включения клеток и многоклеточных органоидов в трехмерную микросреду с определенными градиентами хемоаттрактанта, а затем проанализировать эпителиальные реакции на EGF10. Наши данные свидетельствуют о том, что способность органоидов реагировать на мелкие градиенты EGF обусловлена межклеточной химической связью через узлы разрыва. В нем предлагается потенциал органоидов для более точного выявления слабых и шумных, территориально дифференцированных входов. Процесс изготовления не требует чистых помещений или техники фотолитографии. Тем не менее, 3D PDF устройство включает в себя необходимые факторы 3D-физиологической среды. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения и имеет большой исследовательский потенциал с различными типами клеток, хемоаттрактанты, и ЕСМ комбинаций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные работы были проведены в соответствии с протоколами рассмотрены и утверждены институционального ухода за животными и Комитета по эксплуатации, Университет Джонса Хопкинса, школа медицины.

1. Изготовление мезфлуидических устройств

  1. Дизайн маски прессформы для устройства PDF-файлов с использованием 3D CAD программного обеспечения.
  2. Печать формы с использованием стереолитографии оборудования с термической устойчивостью смолы.
    Примечание: описанные здесь процедуры осуществлялись коммерческой службой 3D-печати.
  3. Тщательно перемешать решение по мономера PDF с лечением агента в соотношении 10:1. для изготовления прибора требовалось 3 мл смеси PDF-файлов. Общий объем зависит от количества изготовленных форм.
  4. Дега смеси, применяя вакуум с использованием в доме лаборатории вакуума или вакуумного насоса в вакуумной сушки в течение 1 часа.
  5. Нанесите поверхность плесени клейкой лентой, чтобы удалить пыль, а затем вылейте смесь PDF-смеси в форму. Если пузырьки вводятся в процесс, повторите дегазации в вакуумной сушки. Пузырьки ловушке между колоннами формы могут быть удалены, тыкать их с острыми иглы.
    Примечание: процесс дегазации при комнатной температуре должен быть сделан в течение 1 часа или меньше.
  6. Вылечить PDF-файлы при нагревании при температуре 80 ° c в течение 2 часов. Дайте плесени остыть при комнатной температуре.
  7. Вырезать границу между плесенью и PDF-файлами с лезвием, а затем снимите PDF-файлы из формы тщательно.
  8. Обрезать часть PDF-файлы, чтобы соответствовать 22 мм х 22 мм комбинезон и пробить отверстие в входе.
    Примечание: протокол может быть приостановлен здесь.
  9. Очистите часть PDF-файлы и 22 мм х 22 мм комбинезон путем очистки поверхностей с низким содержанием волокна тканей и 70% этанола. Затем удалите большие частицы пыли, вытирая клейкой лентой.
  10. Стерилизовать PDF-часть и комбинезон либо аутоклюв (121 ° c в течение 8 минут мокрый, 15 минут сухой) или воздействия УФ-излучения в течение 1 часа.
  11. Лечить нижнюю поверхность части PDF-файлов и крышка скольжения с короной разряда пушки в течение 5 минут в ткани капот культуры, а затем связать их вместе.
    Предосторежение: положите любой non-дирижируя материал как пена полистирола на дне и извлекайте все дирижируя материалы во время этого процесса. Впрыснуть коллаген в прибор немедленно, не познее 5 минут, после обработки для того чтобы увеличить скреплять между гелем коллагена и покрывным стеклом.

2. Приготовление клеток: первичная изолированность молочной оргаоида

Примечание: Подробная информация о изоляции молочной органоида можно найти в предыдущей работе11. Любой вид одиночной клетки или оргаоида можно подготовить согласно их собственному изоляции/протоколам отряда.

  1. Фарш молочной железы ткани мышей с скальпелем, пока ткань расслабляется и поколебать его в течение 30 минут при температуре 37 ° c в 50 мл коллагеназы/трипсина раствор (10 мл на мышь) в DEME/F12 дополнено 0,1 г трипсин, 0,1 г коллагеназы , 5 мл ФПС, 250 мкл 1 мкг/мл инсулина, и 50 мкл 50 мкг/мл гентатамин.
  2. Центрифуга раствор коллагеназы/трипсина на 1 250 x g в течение 10 мин. удалить супернатант по аспирации. Дисперсные ячейки в 10 мл ДМ/F12 и центрифуга на 1 250 x g в течение 10 мин. После удаления ДМЕМ/F12 путем аспирации, повторно приостановить ячейки в 4 мл ДМЕМ/F12 дополнено 40 мкл Дназы (2 единицы/мкл).
  3. Встряхните раствор дндаза вручную за 2-5 мин, а затем центрифугу на 1 250 x g в течение 10 мин.
  4. Отдельные органоиды из одиночных клеток через четыре дифференциальных центрифугирования (пульс 1 250 x g и остановить центрифугу 3-4 s после того, как он достигнет предполагаемой скорости). Между каждым пульсом, Асет супернатант и ресуспензируем гранулы в 10 мл ДМЕ/F12.
  5. Re-приостановить окончательный гранулы в нужное количество роста среды ДМ/F12 с 1% пенициллин/стрептомицин и 1% инсулина-трансферрин-селен-х для выработки коллагена.

3. Подготовка и инъекция коллагена

Примечание: другие типы гелей могут быть подготовлены в соответствии с их собственными протоколами Желирование.

  1. Приготовьте коллаген типа I (3,78 мг/мл), 10x ДМЭМ, 1 N NaOH раствор, нормальный рост среды на льду.
    Примечание: Держите лед до завершения процедуры.
  2. Добавьте 6 мкл 1 N NaOH раствор, 200 мкл роста среды и 50 мкл 10x ДМЭМ в предварительно охлажденной микроцентрифуге трубки и тщательно перемешать раствор.
  3. Добавить 425 мкл коллагена в предварительно смешанном растворе и тщательно перемешать, петтинг.
  4. Центрифуга смесь коллагена кратко (менее 5 секунд), чтобы отделить и удалить пузырьки из смеси.
  5. Держите нейтрализованного раствора коллагена на льду в течение 1 часа, чтобы побудить образование волокна.
  6. Добавить 50 мкл клеточной суспензии в смесь коллагена и тщательно перемешать.
    Примечание: окончательная концентрация коллагена составляет 2 мг/мл.
  7. Впрыснуть раствор с помощью 200 мкл пипетки через входе устройства PDF-файлов до тех пор, пока вся камера заполнена. Если коллагеновая смесь переливается через щели столбов, вырезать избыток коллагена гель с острым хирургическим лезвием после gelation.
  8. Держите устройство в инкубаторе при температуре 37 ° c с 5% CO2 в течение 1 часа, чтобы вызвать gelation.
  9. Заполните резервуары с обеих сторон с ростом среды и держать устройство в инкубаторе при температуре 37 ° c с 5% CO2 до конфокальной визуализации выполняется.

4.3D визуализация и количественная оценка

  1. Установите живую клетку изображения культуры камеры в Конфокальный микроскоп и предварительно установить температуру и CO2 до 37 ° c и 5%, соответственно. Для того чтобы получить влажность вверх, добавьте воду в резервуаре камеры и положите влажные салфетки в камере если необходимо.
  2. Поместите устройство PDF-файлов в камеру и добавьте EGF в один из резервуаров в качестве «источника» EGF в формировании градиента. Другое водохранилище будет служить «раковине», необходимой для развития распределительного распределения по территориально-пространству. 2,5 Нм EGF был добавлен в раковину для изготовления градиента 0,5 Нм/mm в этом исследовании.
  3. Установите диапазон Z-стека, охватывающий объем органоидов, представляющих интерес, и запустите изображение.
    Осторожно: чтобы избежать фототоксичности, попробуйте более низкую лазерную интенсивность в конфокальной визуализации или используйте методы мультифотонных изображений.
  4. Реконструировать 3D-изображение из 2D-изображений, используя коммерческое программное обеспечение или программу, изготовную на заказ. Измерение длины и угла ветвей, простирающихся от органоидов или миграции отдельных клеток. Здесь, выполните квантификации, опираясь от руки контур вокруг органаид тела с помощью Iiiej.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

EGF является важнейшим регулятором ветвления морфогенеза в молочных железах и критическим химиотерагоаттрактантом, направляющим миграцию эпителиальных клеток молочной железы при инвазивной опухоли. Мы использовали месоскопик устройства, описанные выше, для изучения реакции клеток на определенные градиенты EGF (рис. 1A, B)10. Устройство дает площадь культуры 5 мм шириной, 10 мм в длину и 1 мм высотой. Стороны области ку...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изготовление форм PDF-формы было выполнено с использованием коммерческой 3D-печати, но также может быть выполнена на высоком конце 3D принтера в доме. Среди различных 3D методы изготовления, стереолитографии рекомендуется для высокого разрешения поколения плесени. Поскольку лечение ипрс происходит при высокой температуре (80 ° с), материалы должны быть достаточно термически устойчивыми, что должно быть четко указано, если печать осуществляется на внешний подряд. Тепловой пост-лечение можно обсудить с компанией, полиграфи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами АДС (НДП-11-7246, Фонд исследований рака молочной железы (БОФД-17-048) и НИР U54 CA210173) и AL (U54CA209992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
22 мм x 22 ммFisher Scientific12-542-B
Collagen I, RatFisher ScientificCB-40236
CollageneaseSigma-AldrichC5138
COMSOL Multiphysics 4.2COMSOL IncИспользуется для моделирования динамики диффузии
10x DMEMSigma-AldrichD2429
DEME/F12Thermo Fisher11330032
ДНКазаSigma-AldrichD4623
EGF Рекомбинантный мышиный белокThermo FisherPMG8041
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Life technologies16140-071
Fiji-ImageJИспользуется для измерения длины и углов ветвления
GentamicinGIBCO 5750-060
IMARISBitplane
ИнсулинSigma-Aldrich19278
Инсулин-трансферрин-селен-XGIBCO 51500
Салфетка с низким ворсомKimberly-Clark ProfessionalKimtech салфетка
Материал пресс-формыProto labsAccura SL5530 
Оборудование для печати пресс-формProto labsStereolithogrphyМаксимальный размер: 127 мм x 127 мм x 63,5 мм, толщина слоя: 0,0254 мм
Услуга печати пресс-формProto labsCustomhttps://www.protolabs.com/
NaOHSigma-AldrichS2770
Пенициллин/стрептомицинVWR16777-164P
Конфокальный вращающийся диск микроскопSolamere Technology Group
Sylgard 184Электронная микроскопия наук184 SIL ELAST KIT Комплект PDMS
ТрипсинСигма-ОлдричТ9935

Ссылки

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
  3. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  4. Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720(2015).
  5. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
  6. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  7. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
  8. Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
  9. Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
  11. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D анализ Мультиклеточных реакций на Хемоаттрактантные градиенты
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.