Exon Пропуск в непосредственно перепрограммированных Myotubes Полученные из человеческих мочи производные клетки

Краткое содержание

В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечной дистрофии мышц Дюшенна с использованием MYOD1-преобразованныхмочевых клеток для оценки восстановления дистрофин мРНК и уровня белка после пропуска экзона.

Аннотация

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD), прогрессирующее и смертельное заболевание мышц, вызвана мутациями в гене DMD, которые приводят к отсутствию белка дистрофина. На сегодняшний день мы завершили исследование, инициированное исследователем в Национальном центре неврологии и психиатрии, основанное на системной инъекции морфолино олигонуклеотидов, которые склонны к пропуску экзон-53. Для эффективного лечения DMD, в пробирке тестирования с myoblasts, полученных из DMD пациентов для проверки наркотиков и оценки права пациента до проведения клинических испытаний считается необходимым. Совсем недавно мы сообщили о новой MYOD1-преобразованноймочи полученных клеток (UDC) лечение ингибитором гистон метилтрансферазы (3-деазанепланоцин гидрохлорид), как клеточная модель DMD. Новый аутологичный УДК может показать фенокопию специфических фенотипов ДМД, что приводит к применению высокоточной медицины при различных заболеваний, связанных с мышцами. В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечных клеток DMD с использованием MYOD1-преобразованныхUDCs вместе с обратной транскриптазной полимеразной цепной реакцией (RT-PCR), западной блоттингом и иммуноцитохимией для оценки восстановления дистрофина мРНК и уровней белка после пропуска экзона.

Введение

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD), прогрессирующее, смертельное заболевание мышц, вызвано перестановками в гене DMD, которые приводят к отсутствию белка дистрофина¹. Антисмысловая олигонуклеотидная экзонная терапия, как полагают, является многообещающей для DMD. Эта терапия основана на преобразовании более тяжелого фенотипа DMD в более мягкий беккер мышечной дистрофии, как фенотип путем изменения пре-мРНК сращивания для восстановления DMD чтения^{кадра 2}. Недавно мы завершили первое в человеке исследование, основанное на повторном внутривенном введении фосфородиамидат морфолино олигомер (PMO) viltolarsen, который может вызвать экзон 53 пропуск в DMD, и продемонстрировали отличный профиль безопасности, перспективные эффективности,³и приемлемые фармакокинетические параметры (зарегистрирован как UMIN: 000010964 и ClinicalTrials.gov0000.

Однако, чтобы разработать экономически эффективные и эффективные методы лечения болезни, в пробирке тесты с использованием первичных мышечных клеток, полученных от пациентов DMD имеют важное значение для скрининга наркотиков и проверки права пациента до проведения клинических испытаний, а также биомаркеры, которые отражают эффективность экзон пропуска терапии во время испытаний на людях⁴. Совсем недавно мы сообщили о новой технологии для разработки пациентов конкретных MYOD1-преобразованныхмочи полученных клеток (UDCs)^5,6 в качестве основной модели миобласт DMD⁷. Таким образом, для генерации миобластов требуется только сбор мочи у пациентов и не требуется инвазивная процедура. В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышц DMD с использованием MYOD1-преобразованныхУДК, обработанных гидрохлоридом 3-деазанепланоцин а для оценки восстановленного дистрофина мРНК и белка после пропуска экзона.

Протокол

Комитет по этике Национального центра неврологии и психиатрии одобрил это исследование (идентификатор одобрения: A2017-018, A2018-029). Все люди дали информированное согласие, прежде чем предоставить мочу. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями.

1. Изоляция и первичная культура УДК

ПРИМЕЧАНИЕ: UDCs были изолированы в соответствии с ранее опубликованным протоколом^8,9,10 с некоторыми изменениями.

1. Сбор образцов мочи во время спонтанного миктурации в стерилизованных пластиковых бутылках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизация внешнего уретры не требуется. Моча среднего течения желательно снизить риск вирусного заражения. Если запас времени до следующей процедуры составляет 1 ч, образцы мочи должны быть переданы на 4 кВ, чтобы сохранить жизнеспособность клетки. Тем не менее, следует избегать температуры lt;4 c, так как могут появиться нерастворимые осадки.
2. Centrifuge весь образец мочи на 400 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
3. Аспирируй супернатанта, оставляя 1 мл в трубке.
4. Приготовьграйте гранулы индивидуально в оставшиеся 1 мл мочи, а затем соберите их в одной трубке 50 мл.
5. Добавьте 10 мл стирального буфера, состоящего из 99 мл PBS без кальция и магния, 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 0,5 мкг/мл амфотерицина В, и центрифугу образцы при температуре 200 х г на 10 мин при комнатной температуре.
6. Призадыхать супернатант, оставляя 0,2 мл в трубке.
7. Приостановить действие клеточных гранул в 4,5 мл первичной среды, состоящей из смеси 1:1 модификации высокой глюкозы Dulbecco Eagle medium (DMEM) без пирувата натрия и питательной смеси Фарма Фарма, дополненной рекомбинантным человеческим эпидермальным фактором роста (EGF), инсулином, гидрокортизон, эпинефрин, Т3, трансферрин, 10% тетрациклин без сыворотки для крупного рогатого скота (FBS), 1% P/S, и 0,5 мкг/мл амфотерицин B.
8. Семя клеток в трех колодцах желатина покрытием шесть скважин (общий объем каждой скважины, 1,5 мл). Культура увлажняет при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ на 24 ч.
9. Добавить 1,5 мл первичной среды ежедневно в течение следующих 3 дней.
10. На 4-й день замените среду 1,5 мл среды роста, дополненной рекомбинантным ЧЕЛОВЕЧЕСКИм EGF, инсулин, гидрокортизон, эпинефрин, T3, трансферрин, 15% тетрациклин без FBS, 0,5% L-аланин-L-глютамин, 0,5% несущественные аминокислоты, и 2,5 нг/мЛ фибробластный фактор роста-основной (bFGF), рекомбинантный человеческий платок-производный фактор роста (PDGF).
11. Изменение среды роста через день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: колонии UDC появляются в течение недели.
12. Когда культура UDC становится 80-90% слияния, удалить средних и мыть клетки с PBS, разделить все клетки, используя 0,25% трипсин-EDTA и семян на 3000-5000 клеток / см² на новый желатина покрытием 60 мм блюдо (проход 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: UdCs может храниться в жидком азоте. UDCs обычно разделены на 60'70% confluency в тарелке культуры 60 mm в 3 пробки штока.

2. Ретровирная конструкция

1. Усиль область кодирования MYOD1 (NM_002478.4) плазмидса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь для усиления MYOD1 и условия для теплового циклизатора показаны в таблице 1 и таблице 2,соответственно.
2. Обнаружить одну полосу около 1000 bp размер на 0,7% агарозного геля электрофорусс с использованием 1 Зл из усиленного продукта ПЦР, чтобы подтвердить, что myOD1 последовательность усиливается успешно.
3. Очистите продукт ПЦР с помощью комплекта очистки и определите его концентрацию с помощью спектрофотометра.
4. Инкубировать смесь, как показано в таблице 3 на 37 градусов по Цельсию на ночь переварить ретровирусный вектор с тет-на системы и пуромицин устойчивый ген при ограничении ферментцелевых регионов в множественном месте клонирования.
5. Обнаружить одну полосу на 0,7% агарозного геля электрофоресиса с использованием 1 Зл переваренный продукт, чтобы подтвердить, что ретровирусный вектор был успешно переварен.
6. Очистите переваренный продукт с помощью комплекта очистки и определите его концентрацию с помощью спектрофотометра.
7. Для клонирования усиленного фрагмента MYOD1 (произведенного шагами 2.1-2.3) в переваренный ретровирусный вектор (произведенный шагами 2,4–2,6) выполняется реакция клонирования синтеза. Настройте реакцию, как показано в таблице 4,инкубировать реакцию в течение 15 минут при 50 градусах Цельсия, а затем поместите на лед.
8. Выполните трансформацию с использованием компетентных ячеек E. coli в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
9. Выберите преобразованные компетентные клетки, культивируя на пластине культуры LB, состоящей из 10 г/л бактеритто триптона, 5 г/л экстракта дрожжей bacto, 5 г/l NaCl, 15 г/l бакто агара и 50 мг/l ампициллин.
10. Возьмите выбранную колонию и культуру в среде культуры LB без бакто агара при 200 об/мин при 37 градусах Цельсия на ночь.
11. Очистите MYOD1-вставленныеретровирусные векторы с помощью плазмидного комплекта очистки(Таблица материалов)и количественно с помощью спектрофотометра.
12. Подтвердите, что MYOD1 правильно вставляется в ретровирусный вектор путем прямого секвенирования продукта ПЦР, усиленного вперед и обратными грунтовками, ориентированными соответственно с обеих сторон по вставленной последовательности MYOD1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность MYOD1 может быть обнаружена зажатой между ретровирусными векторными последовательностями, когда клонирование в синтезе успешно.
13. Для ретровирусного производства, семена упаковочных клеток на 50000 клеток / см² на 10 см коллагена покрытием пластин и культуры в DMEM с 10% FBS увлажнена при 37 КС и 5% CO₂ на 24 ч.
14. Когда упаковочные клетки размножаются до 80% сплава, смешайте 30 мкг ретровирусных векторов MYOD1,30 мкг упаковочных векторов и трансфекционный реагент, содержащий клеточный пептид(Таблица материалов) путем вихря, и инкубировать их в течение 10 мин.
15. Добавьте инкубированную смесь к среде упаковочных клеток и культуры увлажненных при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеновое покрытие необходимо. Трансфекция может быть лучше на 24 ч или более после посева, потому что упаковочные клетки легко отделиться от культуры пластины.
16. После 4 ч или на ночь, изменить среднюю на свежую среду роста.
17. Соберите вирусный супернатант и заменить свежей среде на 24 и 48 ч после котрансфекции и объединить супернатант.
18. Чтобы сконцентрировать вирусный супернатант, смешайте его с реагентом концентратора и инкубируйте при 37 градусах Цельсия на ночь, затем центрифуге при 1500 х г в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия.
19. Фильтр ретровирус супернатант через фильтр PVDF с 0,45 мкм поры.
20. Проверьте титр ретровирусного вектора с помощью количественного комплекта ПЦР и системы теплового цикла в соответствии с инструкциями производителя.
21. Разделите вирусный супернатант на мелкие аликуты и запасите их при -80 градусах Цельсия.

3. Инфекция MYOD1-ретровирусным вектором в УДК

1. Семя UDCs на 3000-5000 клеток / см² на желатине покрытием 60 мм блюдо.
2. После 24 ч посева, заразить размороженный ретровирус (шаг 2.21) на множественность инфекции 200, добавив гексадиметрин бромид в концентрации 8 мкг/мл.
3. После 24 ч инкубации увлажненный при 37 КС и 5% CO₂, заменить среду культуры со свежим ирост среды, содержащей 1 мкг/мл пуромицин, чтобы выбрать MYOD1-трансумированных клеток. MYOD1 Изменение среды через день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе для MYOD1-положительныхклеток, 1 мкг/мл пуромицин обычно используется для выбора. Соответствующая доза должна быть определена. Используйте тарелку, содержащую нетрансинфицированные клетки, и выберите дозу, которая убивает все клетки в течение 3-5 дней. MYOD1-положительныеклетки должны быть выбраны в течение 7-10 дней после добавления пуромицицина. MYOD1-трансумированные УДК могут храниться в жидком азоте. MYOD1

4. Миогенная дифференциация МИОД1-трансумированныхУДК, обработанных гидрохлоридом 3-деазанепланоцина А (ДЗНеп)

ПРИМЕЧАНИЕ: В последнее время было сообщено, что Дзнеп, ингибитор гистон метилтрансферазы, может значительно способствовать выражению MYOGENIN, один из поздних факторов регулирования мышц, а также привести к дифференциации миотубетуса⁷.

1. Плита MYOD1-трансумированные УДК в колонадистых колодцах при плотности 3,5 х 10⁴ клетки/см². Культура увлажнена при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂.
2. После 24 ч, изменить среду роста к дифференциации среды, состоящей из высокой глюкозы DMEM с L-аланин-L-глютамин, 5% лошади сыворотки, ITS дополнения, 1 мкг /мл доксициклин, и 5 ММ ДЗНеп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 10 мМ Дзнеп может храниться при -80 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев. Используйте морозильник для размораживания и избегайте повторных циклов замораживания-оттепели. Оба MYOD1 активированы доксициклина и Дзнеп подавляют пролиферацию и способствуют миогенной дифференциации УДК. Поэтому рекомендуется добавлять доксициклин и Дзнеп после индукции миогенной дифференциации. ДЗНеп способствует миогенной дифференциации MYOD1-UDCsв зависимости от дозы образом. С другой стороны, он показывает цитотоксичность при высокой концентрации. Таким образом, определить соответствующую концентрацию ДЗНеп, начиная от 1'10 мкм в зависимости от его воздействия на миогенной дифференциации и клеточной биодоступности.
3. Через 3 дня измените среднюю дифференциацию на свежую среду дифференциации без ДЗНеп. Затем, изменить среду каждые 3 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: UDCs предприимчивы друг к другу и образуют миотубевы в течение 1-2 недель после дифференциации.

5. Exon пропуск в MYOD1-преобразованных UDCs

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описаны три протокола для оценки пропуска экзона в клетках, полученных из числа пациентов: 1) обратная транскриптаза полимеразной цепной реакции (РТ-ПЦР) дистрофина мРНК; 2) полуколичественное восстановление восстановленного сигнала белка дистрофина западным пятном; и 3) полуколичественное образование восстановленного сигнала флуоресценции дистрофина с помощью иммуноцитохимии. Все методы могут обнаружить экзон пропуск в дозе-зависимым образом.

1. Оценка эффективности пропуска экзона ПО RT-PCR
   1. Для трансфекта антисмыслового олигонуклеотида (ASO) в MYOD1-преобразованныеUDCs, полученные от пациентов DMD на 7 день после дифференциации, смешайте ASO, трансфекционный реагент(Таблица материалов),и дифференциация средняя до конечной концентрации от 1'10 qM. Культура увлажненной при 37 C и 5% CO₂.
   2. После 72 ч инкубации с ASO, изменить среднюю на свежую среду дифференциации без ASO.
   3. От 3 до 7 дней после трансфекции ASO, удалить дифференциации среды и мыть 1x с PBS. Добавьте буфер лиза клетки, лисите UDCs и собирайте полную РНК с помощью комплекта экстракции РНК.
   4. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
   5. Объедините необходимые реагенты для одноступенчатой реакции РТ-ПЦР в пЦР-трубках в соответствии со таблицей 5.
   6. Поместите пЦР трубки со смесью в термоциклер. Выполнить термоцикл, в соответствии с таблицей 6.
   7. Выполните микрочип электрофорекс и рассчитать экзон пропуская эффективность с помощью молярной концентрации, как ниже.
      Exon пропуская эффективность (%) - пропущенная полоса / (пропущенная полоса , непропущенная полоса) x 100
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните продукт ПЦР в холодильнике при 4 градусах По кв/ для кратковременного хранения или -20 градусов для длительного хранения.
2. Обнаружение дистрофина после пропуска экзона западным блоттингом
   1. Трансфект ASO и культура MYOD1-UDCs в соответствии со шагами 5.1.1 и 5.1.2.
   2. Изменение среды каждые 3 дня.
   3. После 2 недель дифференциации, извлечь общий белок из культивированных клеток с помощью радиоиммунопреционных анализ (RIPA) буфер, содержащий ингибиторы протеазы.
   4. Сножате лисаты на льду и центрифуге при 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
   5. Соберите супернатант и определить концентрации белка с помощью комплекта анализ овак протеина BCA.
   6. Добавьте 15 мкг общего белка в трубку 0,5 мл и разбавьте, добавив буфер RIPA, содержащий ингибиторы протеазы, в общий объем 10 л. Выполнить 15 мкг общего белка на полосу.
   7. Добавьте образец буфера, уменьшая агент, и деионизированной воды, как показано в таблице 7. Денатурная клетка лисатируетпри при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
   8. Подготовьте трехацетатный бегущий буфер, содержащий 8,95 г/л трицина, 6,06 г/л трис базы, 1,0 г/л натрия додецил сульфат (SDS).
   9. Загрузите образец (20 л) на трис-ацетат 3-8% геля и выполните электрофорус при 150 В в течение 75 мин.
   10. Приготовьте буфер для промотирования без метанола.
   11. Замочите мембрану PVDF на 20 с метанола, а затем в буфере для промокать до использования (не менее 10 мин). Вырежьте мембрану PVDF размером 6 х 8 см с помощью мини-гелей и 8 х 12 см с помощью миди гелей.
   12. Вырезать промокать бумаги до того же размера, что и мембраны PVDF и впитать те, в буфере blotting до использования.
   13. После электрофореза разрежьте гель до того же размера, что и мембраны PVDF, и замочите гель в дистиллированной воде.
   14. Поместите блохитые бумаги, мембрану PVDF и гель на полусухом переносном аппарате(рисунок 1). Передача на 4 мА/см² за 30 мин.
   15. Промыть мембрану 2x дистиллированной водой.
   16. Приготовьте антидистрофин (1:500) и анти-тубулин (1:1,200) в качестве основных антител.
   17. Подготовка HRP-конъюгированных анти-мышь антитела (1:100) в качестве вторичного антитела.
   18. Инкубировать мембраны с первичными антителами, мыть с буфером мытья, затем инкубировать с вторичными антителами с помощью автоматизированного устройства западной обработки(Таблица материалов) при комнатной температуре.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-я-тубулин антитела, как правило, используется в качестве контроля нагрузки. Смешанные первичные антитела, в том числе 1:500 антидистрофина и 1:1,200 анти-тубулин антитела хорошо работают, когда реакция антител выполняется одновременно.
   19. Промыть мембрану в дистиллированной воде.
   20. Обнаружить белки с помощью химикуминенового обнаружения реагента и заряда-связанных устройств (CCD) камеры на основе изображения.
   21. Анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения.
3. Обнаружение дистрофина после пропуска экзона иммуноцитохимией
   1. Непосредственно перепрограммировать UDCs в миотубебы в коллагена покрытием 96 хорошо пластины в соответствии с шагами 4.1'4.3.
   2. ТрансфектИровать ASO и культуры MYOD1-UDCs в соответствии с шагами 5.1.2 и 5.1.3.
   3. После 2 недель дифференциации, мыть клетки с PBS и исправить их в 4% параформальдегида в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
   4. Permeabilize MYOD1-UDCs в 0,1% неионического моющего средства в течение 10 мин при комнатной температуре и блокировать тех, с 10% козьей сыворотки в течение 15 мин при температуре 37 градусов по Цельсию.
   5. Инкубировать клетки с первичным антителом на ночь при 4 градусах Цельсия.
   6. Вымойте клетки с PBS и инкубировать те, со вторичным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мышь анти-дистрофина (1:30) используется в качестве основного антитела, анти-мышь IgG используется в качестве вторичного антитела, и Hoechst (1:10000) используется для окрашивания ядер.
   7. Изображение пластин с помощью флуоресцентного микроскопа и использовать анализатор для полуколичественной флуоресценции сигнала автоматически в каждом колодце при том же состоянии.

Результаты

Мы могли бы собирать UDCs легко и неинвазивно. UDCs сформировали колонии в течение недели после начала первичной культуры клеток мы наблюдали заметной пролиферативной способности. Культура UdCs была проста, и бактериальное или грибковое загрязнение было редким, когда процедура была выполнена правильно.

На рисунке 2 показаны репрезентативные фазово-контрастные изображения колонии УДК через неделю после первичной культуры(рисунок 2А)и MYOD1-UDCs через неделю после дифференциации(рисунок 2B). На рисунке 3 показано успешное обнаружение экзона пропуска в UDCs, полученных от пациентов DMD RT-PCR. Рисунок 3показывает RT-PCR анализ дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида лечения в ДЗНеп-обработанных MYOD1-UDCs,полученных от 6-летнего мужчины с экзоном 45-54 удаление в гене DMD. Открытая рамка чтения была восстановлена пропуском exon 44. На 14 день после дифференциации, мы подтвердили индукции экзона пропуска в дозе зависимым образом(Рисунок 3B). Верхние полосы обозначают родные продукты, а нижние полосы обозначают экзон 44-пропущенные продукты, которые восстановили открытую рамку чтения.

Рисунок 4 показывает успешное обнаружение дистрофина после пропуска экзона в UdCs, полученных от пациентов DMD западным изависимым от дозы образом. Мы также обнаружили восстановленное экспрессию дистрофина с помощью иммуноцитохимии(рисунок 5). Мы измерили интенсивность дистрофина флуоресцентным микроскопом через неделю после переклификации антисмыслового олигонуклеотида (ASO) на 96 хорошо пластины(рисунок 5А). Заметно более высокие флуоресцентные сигналы наблюдались в MYOD1-UDCs, обработанных ASO, чем в MYOD1-UDCs, обработанных с контролем ASO(рисунок 5B).

Эти результаты показывают, что наш новый анализ может оценить экзон пропуска эффективно в MYOD1-UDCs,полученных от пациентов DMD на уровне мРНК и белка.

Рисунок 1: Схематическое представление стека передачи для полусухого западного поместья. Две бумаги, пропитанные буфером сближания, были заложены на отрицательном терминале, и две бумаги, пропитанные буфером, были уложены поверх этого. Гель, который был пропитан в буфере, был аккуратно заложен над мембраной PVDF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения УДК. (A)Фазово-контрастное изображение УДК через неделю после первичной культуры. Шкала бар 200 мкм. Всет: увеличенное изображение области в белом прямоугольнике. (B) Фазовое контрастное изображение MYOD1-UDCs через неделю после дифференциации. Шкала бар 50 мкм. Эта цифра была изменена с Takizawa и др.⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Успешная оценка пропуска экзона в клетках, полученных от мочи (UDCs), полученных от пациентов DMD RT-PCR. ()RT-PCR анализ дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида лечения в 3-деазанепланоцин гидрохлорид (ДЗНеп) лечение MYOD1-UDCs,полученных от мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) пациента с экзон45-54 удаления. Дзнеп-обработанный MYOD1-UDCsтакже были обработаны с антисмыслом управления на 1-10 мкм концентрации в качестве контроля. Верхние полосы были непропущенными продуктами (Удаление Ex 45-54), которые остались вне рамки для чтения. Нижние полосы были экзон 44-пропущенных продуктов (Ex 44-54 удаления и Ex 44 пропустил), которые восстановили открытый кадр чтения. (B) Пропуск эффективность была рассчитана как (экзон 44-пропущенный протокол моляритство)/(родной й экзон 44-пропущенный протокол моляристость »отмечена стрелками) х 100% с помощью системы электрофорасиса микрочипа. Для сравнения эффективности пропускающих (n- 3 для каждой группы) использовался односторонний ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Bonferroni(n) no 3 для каждой группы, «P »lt; 0.0001). Данные выражаются в виде среднего значения SEM. Эта цифра была изменена с Takizawa и др.⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Успешная оценка экзона пропуска в мочеклеток (UDCs) от пациентов DMD западной подьеносец. (A) Представитель Западной пятно для дистрофина в ДЗНеп лечение MYOD1-UDCsот пациента DMD с экзон45-54 удаления после экзона 44 пропуска. Для обнаружения дистрофина использовался антидистрофин (против C-терминала). (B) Относительная интенсивность полос нормализованы до экспрессии з-тубулин были сравнены в пациента полученных клеток с и без антисмыслового олигонуклеотида лечения, выполняя одностороннее ANOVA следуют Bonferroni после hoc тест (n No 3 для каждой группы, "P lt; 0,01, Эта цифра была изменена с Takizawa и др.⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Тепловые карты иммуноцитохимии для дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида в ЛЕЧЕНИи ДЗНеп MYOD1-UDCs, полученные от пациента DMD с удалением экзона 45-54. (A) Удаление экзона 45-54 восстановил открытый кадр чтения на основе экзона пропуска экзона 44. (B) Интенсивность сигнала была количественно с помощью флуоресцентного микроскопа после 1 недели антисмыслового олигонуклеотида трансфекции на 96 хорошо пластины. Для сравнения использовался односторонний ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Bonferroni (n No 3-4 для каждой группы, qs p slt; 0.0001). Эта цифра была изменена с Takizawa и др.⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Реагента	Объем	Окончательная концентрация
2x пЦР-премикс	12,5 л	1x
Передняя грунтовка	5 рмоль	0,2 мкм
Обратная грунтовка	5 рмоль	0,2 мкм
Шаблон	80 нг
Стерилизована дистиллированная вода	до 25 л л
Общий объем на одну реакцию	25 зл.

Таблица 1: Смесь для усиления MYOD1 по РТ-ПЦР.

98 кв. c	10 с
55 кк с	10 с	35 циклов
72 кк с	10 с

Таблица 2: Условия для теплового цикла для усиления MYOD1.

Реагента	Объем
10x K буфер	2 л
Ретровирусный вектор (500 нг/л)	2 л
Фермент ограничения 1 (2–15 U)	1 зл
Фермент ограничения 2 (2–15 U)	1 зл
Стерилизована дистиллированная вода	14 зл.
Общий объем	20 зл

Таблица 3: Смесь для трубки для переваривания ретровирусного вектора.

Реагента	Объем
Очищенный фрагмент MYOD1	100 нг
Усваиваемый ретровирусный вектор	100 нг
5x Фермент ный премикс	4 л
Стерилизована дистиллированная вода	до 20 л
Общий объем	20 зл

Таблица 4: Смесь для реакции клонирования синтеза.

Решение	Объем/реакция (КЛ)	Окончательная концентрация
Безrза	Переменной	-
Одноступенчатый буфер РТ-ПЦР	4	1x
смесь dNTP (содержащая 10 мМ каждого dNTP)	0.8	400 мМ каждого dNTP
Передняя грунтовка (10 мМ)	1.2	0,6 мМ
Обратная грунтовка (10 мМ)	1.2	0,6 мМ
Одноступенчатая ферментная смесь RT-PCR	0.8	-
Ингибитор RNase (по желанию)	Переменной	5–10 единиц/реакция
Шаблон РНК	50-400 нг
Общий объем	20

Таблица 5: Необходимые соединения для одной реакции одноступенчатой РТ-ПЦР.

1 цикл	Обратная транскрипция	30 мин.	50 кв. c
1 цикл	Первоначальный шаг активации ПЦР	15 мин.	95 кв. c
1 цикл	Денатурация	1 мин.	94 кК
	Отжига	1 мин.	60 кк
	Расширение	1 мин.	72 кк с
1 цикл	Окончательное расширение	7 мин.	72 кк с
Держать		∞	4 кк с

Таблица 6: Тепловое состояние циклизатора для одноступенчатой РТ-ПЦР.

Реагента	Объем
Белок (15 мкг)	10 зл
Образец буфера (4x)	5 зл
Уменьшающий агент (10x)	2 л
Деионизированная вода	3 зл
Общий объем	20 зл

Таблица 7: Приготовление образцов для натрия додецил сульфат полиакриламида гель электрофорес (SDS-PAGE).

Обсуждение

Здесь мы описываем подробный протокол пропуска экзона в MYOD1-преобразованныхUDCs, полученных от пациентов DMD. Используя систему ассс, мы эффективно проверяли оптимальные антисмысловые последовательности. Мы предполагаем, что MYOD1-преобразованныеУДК могут быть полезны для исследования патофизиологии заболевания.

Оценка пропуска экзона с использованием клеток, полученных из числа пациентов на уровне мРНК, необходима для скрининга новых препаратов и оценки права пациента до проведения клинических испытаний. Расчет эффективности пропуска экзона может быть оценен только на уровне мРНК.

Оценка экзона пропуска на уровне белка также важно, потому что восстановление дистрофина имеет важное значение в качестве суррогатного биомаркера, чтобы предсказать преимущества экзона пропуска. На сегодняшний день скрининг антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей часто выполняется с использованием первичных линий мышечных клеток или увековечил линии клеток миобласта, включая клетки рабдомиосаркомы человека (РД), но мы не можем измерить восстановление уровня дистрофина с помощью линий мышечных клеток или RD-клеточных линий, потому что они выражают этот белок негодуродно. Мы можем четко обнаружить восстановление дистрофина в DMD пациента производных MYOD1-UDCsв дозе зависимым образом. В нашем новом анализе мы считаем, что оценка восстановленного белка западным испугом превосходит по количественной оценке. С другой стороны, оценка иммуноцитохимии с использованием 96 скважин ных пластин идеально подходит для скрининга многих соединений кандидата одновременно.

В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышц ЫМД с использованием MYOD1-преобразованныхUDCs вместе с RT-PCR, Западным блоттингом и иммуноцитохимией для оценки восстановленного дистрофина на мРНК и уровня белка после пропуска экзона. UDCs могут быть собраны неинвазивно и легко. Таким образом, мы предполагаем, что совершенно новый анализ in vitro может быть применен к широкому спектру основных и трансляционных исследований независимо от типа мышечных расстройств.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1% P/S раствор стабилизированный	Thermo Fisher	15070-063	Клеточная культура
Амфотерицин B	Sigma Aldrich	A2942
Антидистрофин	Abcam	ab15277	Вестерн-блот (WB)
Антидистрофин	Leica	NCL-DYS1	Иммуноцитохимия (ICC)
Антимышиный IgG, Dylight 488	Vector Laboratories	DK-2488	ICC
Anti-α-тубулин	Sigma	T6199	Western bot и ICC
BZ-X800	KEYENCE	BZ-800	Флуоресцентный микроскоп
CELLBANKER	ZENOAQ	CB011	Клеточный материал в жидком азоте
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad	170-8280J1	WB
CloneAmp HiFi PCR premix	Clontech	639298	Ретровирусное производство
cOmplete Ингибитор протеазы коктейль	Roche	4693116001	Экстракция белка для WB
E.coli DH5 α Компетентные клетки	TAKARA	9057
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE healthcare	RPN2232	WB
EGF	Peprotech	AF-100-15	Клеточная культура
Endo-Porter	GeneTools	2922498000	ASO трансфекция
Extra Thick Blot Фильтровальная бумага	Bio-Rad	1703965	WB
EzFastBlot HMW	Atto	AE-1460	WB
фактор роста фибробластов-основной	Sigma-Aldrich	F0291	Клеточная культура
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Клеточная культура
GP2-293 Упаковка клеток	Clontech	631458	Производство ретровирусов
Смесь питательных веществ Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	11765-054	Клеточная культура
Высокий уровень глюкозы DMEM с GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	10569-010	Клеточная культура
с высоким содержанием глюкозы DMEM без пирувата натрия	GE Healthcare	SH30022.01	Набор для очистки плазмид в клетках
HiSpeed	QIAGEN	12643	Ретровирусное производство
Histofine Simple Stain MAX PO	NICHIREI BIOSCIENCE INC.	424151	WB
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	ICC
Human PDGF-AB	Peprotech	100-00AB-10UG	Клеточная культура
iBind Flex Solution	Thermo Fisher Scientific	SLF2020	WB
iBind Flex Western Device	Thermo Fisher Scientific	SLF2000	WB (Автоматизированное устройство для обработки корма)
Передаточная мембрана Immobilon-P (PVDF)	MERCK	IPVH304F0	WB
In-Fusion HD Набор для клонирования	Clontech	639648	Ретровирусное производство
ITS Добавка жидких сред	Sigma-Aldrich	I3146	Клеточная культура
MILTEX HV 0,45 μ m фильтр	MERCK	SLHV033RS	Ретровирусное производство
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Микрочип электрофорез
MYOD1 (GFP-tagged)	ORIGENE	RG209108	Ретровирусное производство
NanoDrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Спектрофотометр
Заменимые аминокислоты	Thermo Fisher	11140-050	Клеточная культура
Набор для очистки геля и ПЦР NucleoSpin	Clontech	740986.20	Очистка ПЦР
NuPAGE 3-8% Трис-ацетатные протеиновые гели	Invitrogen	EA03785BOX	WB
NuPAGE Антиоксидант	Invitrogen	NP0005	WB
NuPAGE LDS Буфер для образцов	Invitrogen	NP0007	WB
NuPAGE Восстановитель проб	Invitrogen	NP0009	WB
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Invitrogen	LA0041	WB
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit	TAKARA	RR066A	Титровая проверка ретровирусного вектора
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-250	Клеточная культура
Pierce BCA Protein Anasay Kit	Thermo Scientific	23227	WB
Полибреновая инфекция / трансфекция Реагент	Sigma-Aldrich	TR-1003	Ретровирусная инфекция
pRetroX-TetOne-Puro Vector	Clontech	634307	Ретровирусный векор
Puromycin	Clontech	631305	Клеточная культура
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit	Qiagen	210212	REGM
Bullet Kit	Lonza	CC-3190	Материал для питательной среды УДК
REGM SingleQuots	Lonza	CC-4127	Материал для первичной среды УДК
Набор титровирусов	TAKARA	6166	Проверка титра ретровирусного вектора
Retro-X Concentrator	Clontech	631455	Ретровирусное производство
RIPA буфер	Thermo Fisher Scientific	89901	WB
RNeasy kit	Qiagen	74104	Экстракция РНК для ПЦР
Безтетрациклиновая фетальная бычья сыворотка	Clontech	631106	Клеточная культура
Triton-X	MP Biomedicals	9002-93-1	ICC
Трипсин-ЭДТА (0.05%)	Gibco	25300054	Клеточная культура
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001	WB
Xfect реактив для трансфекции	Clontech	631317	Трансфекция плазмид в упаковочные клетки