Здесь мы описываем протокол обнаружения и локализации белка и РНК эмбриона дрозофилы от сбора до предварительного встраивания и встраивания, иммуноокрашивания и гибридизации мРНК in situ .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах. Каждая клеточная активность от пролиферации и апоптоза клеток, развития и старения до нейрональной синаптической пластичности и регенерации была связана с рецепторами рианодина (RyRs). Несмотря на важность передачи сигналов кальция, точный механизм его функции в раннем развитии неясен. Как организм с коротким гестационным периодом, эмбрионы Drosophila melanogaster являются основными объектами исследования для изучения распределения и локализации CICR-ассоциированных белков и их регуляторов в процессе развития. Однако из-за их богатых липидами эмбрионов и богатых хитином хорионов их полезность ограничена сложностью установки эмбрионов на стеклянные поверхности. В этой работе мы представляем практический протокол, который значительно улучшает прикрепление эмбриона дрозофилы к слайдам и детализирует методы для успешной гистохимии, иммуногистохимии и гибридизации in-situ . Метод скользящего покрытия хром-квасцового желатина и метод предварительного встраивания эмбрионов резко увеличивают выход при изучении белка эмбриона дрозофилы и экспрессии РНК. Чтобы продемонстрировать этот подход, мы изучили DmFKBP12/Calstabin, известный регулятор RyR во время раннего эмбрионального развития Drosophila melanogaster. Мы идентифицировали DmFKBP12 еще на стадии синцитиальной бластодермы и сообщили о динамическом паттерне экспрессии DmFKBP12 во время разработки: первоначально как равномерно распределенный белок в синцитиальной бластодерме, затем предварительно локализующийся в цокольном слое коры во время клеточной бластодермы, прежде чем распространяться в примитивной нейрональной архитектуре и архитектуре пищеварения во время фазы трехместного слоя в ранней гаструляции. Это распределение может объяснить решающую роль, которую RyR играет в жизненно важных системах органов, которые происходят из этих слоев: субэзофагеальный и надпищеводный ганглий, вентральная нервная система и опорно-двигательный аппарат.
Введение
Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах, таких как скелетная/гладкая мускулатура и сердечная сосудистая функция, пролиферация и апоптоз клеток, развитие, старение, нейрональная синаптическая пластичность и регенерация1,2,3,4,5,6 . Рянодиновые рецепторы (RyRs) и инозитол-1,4,5-трисфосфатные рецепторы (IP3Rs) являются основными игроками в сигнальном пути кальция, контролируемом их регулято....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление тарелок с агаром виноградного сока
- Добавьте 5 г агара и 5 г сахарозы в 150 мл дистиллированной воды. Кипятите его с помощью микроволновой печи до полного растворения агара и сахарозы. Смешайте 50 мл 100% виноградного сока и раствора вместе.
- Добавьте 1 мл 100% пропионовой кислоты, чтобы получить конечную концентрацию до 0,5% пропионовой кислоты. В каждую тарелку налейте по 25 мл приготовленного раствора. После того, как агар затвердеет, храните носитель при температуре 4 °C.
2. Покрытие слайдов
- Предварительно обработать горки моющим средством. Промойте гор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунки описывают протоколы, используемые для преодоления проблемы прикрепления эмбрионов дрозофилы с высоким содержанием липидов и хитинсодержащих хорионов (таблица 1) к поверхности стеклянной горки для исследования и экспериментов. Используя метод покрытия слайдов из хром-квасцового желатина, показанный на рисунке 1, мы улучшили прикрепление эмбрионов дрозофилы к поверхности слайдов, в то время как метод предварительного встраивания эмбриона, показанный н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Опосредованная кальциевыми сигналами RyRs и IP3R является фундаментальным путем во многих физиологических и патологических процессах как позвоночных, так и беспозвоночных животных1,2,3,4. У людей точечные мутации, такие как CPVT-ассоциированная мутация R4496C, в гене RyR2 приводят к утечке кальция из саркоплазматического ретикулума кардиомиоцита, что приводит к сердечной дисфункции. Эти мутации.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (#31771377/ 31571273/31371256), Программой иностранных выдающихся ученых от Национального департамента образования (#MS2014SXSF038), Фондом исследований центральных университетов Национального департамента образования (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), а XZ поддерживается Фондом выдающихся докторских диссертаций (#2019TS082 /2019TS079), Ключевой программой Департамента образования провинции Шэньси (#20JS138), Молодежный проект Программы фундаментальных исследований в области естественных наук Департамента науки и техники провинции Шэньси (#2020JQ-885).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| -20° C Холодильник | Meiling Биология и Медицинский | DW-YL270 | Используется для хранения регент-80 |
| ° C Ультранизкотемпературный холодильник | Thermo | Forma серии 90 | Используется для хранения |
| агара | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Приготовления виноградного сока Агаровые пластины |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab фрагменты | Roche | 11093274910 | Для обнаружения меченого дигоксигенином соединения |
| Биохимический инкубатор | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Гибридизация |
| раствор Буина | Химический реагент Sinopharm в Пекине | 69945460 | встраивания эмбрионов дрозофилы |
| Eppendorf | 540BH07808 | In-situ | |
| Центрифуга | Denville | C-2170 | Коллекция эмбрионов дрозофилы |
| Хром квасцы | Химический реагент Sinopharm в Beijing | 10001018 | Покрытие Слайды |
| Водяная баня постоянной температуры | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Окрашивание гематоксилин-эозином, иммуногистохимия, гибридизация in-situ и периодическое кислотно-серебряное окрашивание метенамином |
| Dako REAL EnVision Система обнаружения | Dako | K5007 | В иммуногистохимической реакции или реакции гибридизации in situ он связывается с первичным антигенным антителом, и мишень помечается путем окрашивания. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Набор для |
| маркировки РНК DIG | Roche | 11093274910 | мечение РНК диагоксигенином-UTP путем транскрипции in vitro с помощью SP6 и Т7 РНК-полимеразы |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | Акции Drosophila melanogaster mutant |
| Электрическая печь для сушки шоковой машиной | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | Для нанесения покрытий на предметные стекла и заделки парафина |
| Эозин | Сигма-Олдрич | 230251 | Гематоксилин-Эозин Окрашивание |
| этанолом | Химическим реагентом Sinopharm в Пекине | 100092680 | Встраивание парафина, Окрашивание гематоксилин-эозином, Иммуногистохимия, Гибридизация in-situ и периодическое кислотно-серебряное окрашивание |
| метенаминомЖелатин | Sinopharm Химический реагент в Пекине | 10010328 | Покрытие Слайды |
| Хлорид золота | Сигма-Олдрич | 379948 | периодическая кислота-серебро Метенамин окрашивание |
| гематоксилин | Сигма-Олдрич | H3136 | Окрашивание гематоксилин-эозином |
| Высокочистое ПЦР-продукт Набор для очистки ПЦР-продуктов | Roche | 11732668001 | Для очистки ПЦР-продуктов |
| Интеллектуальный бокс постоянной температуры и влажности | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | Для обслуживания мух |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Предварительное встраивание |
| метанола | Sinopharm Chemical Reagent в Пекине | 10014108 | Коллекция эмбрионов дрозофилы Микроскоп |
| ZEISS | Observer.A1 | Окрашивание гематоксилин-эозином, иммуногистохимия, гибридизация in-situ и периодическое окрашивание кислотно-серебряного метенамина | |
| микроскопом предметные стекла | MeVid Labware Производство | P105-2001 | Покрытие предметные стекла |
| нейтральная камедь | Sinopharm Химический реагент в Пекине | 10004160 | окрашивание гематоксилин-эозином |
| N-гептан | Sinopharm Химический реактив в Пекине | 40026768 | эмбрион дрозофилы Сбор |
| Парафинорез | Хуахайский научный прибор | HH-2508III | In-situ Гибридизация |
| Парафин | Синофарм Химический реактив в Пекине | 69019461 | Парафин Встраивание |
| рН/мВ метр | Sartorius | PB-10 | Для определения значения рН раствора |
| Нитрат серебра | Синофарм Химический реактив в Пекине | 10018461 | Периодическое кислотно-серебряное окрашивание |
| Сверхчистая вода Термо | AFXI-0501-P | In-situ Гибридизация | |
| Химический реагент Xylene | Sinopharm в Пекине | 10023418 | Встраивание парафинов |
Ссылки
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
