Методическая статья

Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы

DOI:

10.3791/61776

⸱

6 мая 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол обнаружения и локализации белка и РНК эмбриона дрозофилы от сбора до предварительного встраивания и встраивания, иммуноокрашивания и гибридизации мРНК in situ .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах. Каждая клеточная активность от пролиферации и апоптоза клеток, развития и старения до нейрональной синаптической пластичности и регенерации была связана с рецепторами рианодина (RyRs). Несмотря на важность передачи сигналов кальция, точный механизм его функции в раннем развитии неясен. Как организм с коротким гестационным периодом, эмбрионы Drosophila melanogaster являются основными объектами исследования для изучения распределения и локализации CICR-ассоциированных белков и их регуляторов в процессе развития. Однако из-за их богатых липидами эмбрионов и богатых хитином хорионов их полезность ограничена сложностью установки эмбрионов на стеклянные поверхности. В этой работе мы представляем практический протокол, который значительно улучшает прикрепление эмбриона дрозофилы к слайдам и детализирует методы для успешной гистохимии, иммуногистохимии и гибридизации in-situ . Метод скользящего покрытия хром-квасцового желатина и метод предварительного встраивания эмбрионов резко увеличивают выход при изучении белка эмбриона дрозофилы и экспрессии РНК. Чтобы продемонстрировать этот подход, мы изучили DmFKBP12/Calstabin, известный регулятор RyR во время раннего эмбрионального развития Drosophila melanogaster. Мы идентифицировали DmFKBP12 еще на стадии синцитиальной бластодермы и сообщили о динамическом паттерне экспрессии DmFKBP12 во время разработки: первоначально как равномерно распределенный белок в синцитиальной бластодерме, затем предварительно локализующийся в цокольном слое коры во время клеточной бластодермы, прежде чем распространяться в примитивной нейрональной архитектуре и архитектуре пищеварения во время фазы трехместного слоя в ранней гаструляции. Это распределение может объяснить решающую роль, которую RyR играет в жизненно важных системах органов, которые происходят из этих слоев: субэзофагеальный и надпищеводный ганглий, вентральная нервная система и опорно-двигательный аппарат.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах, таких как скелетная/гладкая мускулатура и сердечная сосудистая функция, пролиферация и апоптоз клеток, развитие, старение, нейрональная синаптическая пластичность и регенерация1,2,3,4,5,6 . Рянодиновые рецепторы (RyRs) и инозитол-1,4,5-трисфосфатные рецепторы (IP3Rs) являются основными игроками в сигнальном пути кальция, контролируемом их регуляторами протеинкиназы A (PKA), Ca2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CaMKII), FK506 связывающих белков (FKBPs), кальциквестрина (CSQ), триадина и юнктина1,2,3,4,5,6 . Аномальная экспрессия человека и мутации в этих белках могут привести к патологической физиологии, такой как аритмии7 и онкогенная пролиферация8,9.

FKBP регулируют высвобождение кальция из эндоплазматической ретикулярной (ER) RyRs. Этот процесс необходим для механизма сокращения и, таким образом, отвечает за все механические движения, генерируемые сокращением миозина-актина посредством высвобождения кальция, вызванного кальцием, вместе с эмбриональными RyRs1,2. В мышиных моделях недостаток RyR2 и его регулятора FKBP12/Calstabin неизменно смертелен либо во время эмбрионального развития, либо в раннем постнатальном периоде10,11,12. Нокаутирующие мыши FKBP12/Calstabin демонстрируют критические пороки сердца с нерегулярной связью возбуждения-сокращения (EC) и отеком мозга во время эмбрионального развития. Это указывает на то, что FKBP12/Calstabin играет важную роль в регулировании экспрессии каналов RyR2, что важно как для сердечного, так и для мозгового развития10.

Полученные RyR искры кальция были первоначально обнаружены в фазе формирования зиготы оплодотворенных яиц медаки13,14. Тем не менее, было проведено мало исследований функции передачи сигналов кальция в раннем эмбриональном развитии. В Drosophila melanogaster результаты, полученные от мутантов DmFKBP12 S107, предоставляют убедительные доказательства, подтверждающие важность этого гена для развития личинок и здоровой продолжительности жизни, что объясняется его функцией против окислительного стресса15,16. Недавно мы выявили динамическую локализацию белка FKBP12/Calstabin и матричной РНК во время раннего развития Drosophila melanogaster17. Используя подходы, описанные в этой методологии, мы смогли отследить экспрессию FKBP12/Calstabin у D. melanogaster во время синцитиальной бластодермы (0-2 ч), клеточной бластодермы (2-3 ч), ранней гаструлы (3-12 ч) и поздней гаструлы (12-24 ч). В этой статье мы представляем подробные протоколы каждого подхода в предыдущем исследовании, включая встраивание преэмбриона для классического парафинового сечения, предварительную обработку слайдов для эмбриональных срезов, гистохимическое окрашивание и иммуноокрашивание, а также гибридизацию мРНК in-situ для идентификации экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление тарелок с агаром виноградного сока

  1. Добавьте 5 г агара и 5 г сахарозы в 150 мл дистиллированной воды. Кипятите его с помощью микроволновой печи до полного растворения агара и сахарозы. Смешайте 50 мл 100% виноградного сока и раствора вместе.
  2. Добавьте 1 мл 100% пропионовой кислоты, чтобы получить конечную концентрацию до 0,5% пропионовой кислоты. В каждую тарелку налейте по 25 мл приготовленного раствора. После того, как агар затвердеет, храните носитель при температуре 4 °C.

2. Покрытие слайдов

  1. Предварительно обработать горки моющим средством. Промойте горки 3 раза водопроводной водой и один раз дистиллированной водой. Затем высушите горки в духовке при температуре 45 °C в течение 2 ч.
  2. Погружайте слайды примерно в 450 мл раствора серной кислоты дихромата калия (20 г дихромата калия, 40 мл дистиллированной воды и 400 мл концентрированной серной кислоты) в течение 24 часов. Промойте горки 3 раза водопроводной водой и один раз дистиллированной водой.
    1. Высушите горки в духовке с температурой 45 °C в течение двух часов. Погружают в 95% этанол более чем на 2 ч.
  3. Добавьте 0,5 г сульфата калия хрома и 5 г желатина в 1 л дистиллированной воды. Перед использованием растворить на водяной бане при температуре 60 °C. Хромовый желатин квасцов может храниться при 4 °C в течение длительного времени.
  4. Опустите 10 мкл хромового желатина на горку и полностью и равномерно покройте раствором всю поверхность горки. Поместите горку желатиновой стороной вверх в духовку при температуре 42 °C в течение 48 ч. Подготовленные слайды могут храниться при температуре 4 °C для последующего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг. Необходимо полное покрытие. Для плодовой мухи и ее эмбриона этот подход к покрытию слайдов кажется более эффективным, чем полилизиновое покрытие.

3. Встраивание эмбриона дрозофилы

  1. Коллекция эмбрионов дрозофилы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы собирали эмбрионы дрозофилы за четыре периода по 0-2 часа (синцитиальная бластодерма), 2-3 часа (клеточная бластодерма), 3-12 часов (ранняя гаструла) и 12-24 часа (поздняя гаструла)18. Доля основных типов эмбрионов в каждом периоде показана в таблице 1.
    1. Поместите 400-500 мух в пластиковую бутылку для сбора и накройте бутылку тарелкой агара виноградного сока, содержащей дрожжевой экстракт. Эмбрионы дрозофилы укладывают на агар виноградного сока при комнатной температуре.
    2. Соберите четыре периода эмбрионов, осторожно добавляя 2 мл PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCL, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4, рН 7,4) к каждой пластине, чтобы плавать эмбрионы. Перенесите около 200 эмбрионов в центрифужную трубку объемом 50 мл и держите ее на льду в течение 2 минут, чтобы успокоить эмбрионы.
  2. Предварительное встраивание
    1. Перенос 200 эмбрионов дрозофилы в центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите трубку на льду в течение 2 минут, чтобы успокоить эмбрионы, а затем осторожно выбросьте супернатант с пипеткой. Добавьте 1 мл 50% отбеливателя в пробирку и аккуратно встряхните его в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отбеливатель следует готовить свежим, и количество отбеливателя может варьироваться в зависимости от количества собранных эмбрионов.
    2. Аккуратно соберите эмбрионы, вылейте на фильтровальную бумагу и промывайте их 3 раза 1 мл PBS каждый раз.
    3. Перенесите эмбрионы с фильтровальной бумагой примерно в 5 мл н-гептана.
    4. Переложите смесь в свежую центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл метанола и аккуратно встряхните. Собирайте эмбрионы после оседания.
    5. Удалить надосадочный материал и промыть эмбрионы в 1 мл PBS 3-5 раз.
    6. Зафиксируйте эмбрионы 400 мкл раствора Буэна (71% насыщенная пикриновая кислота, 24% формалин, 5% уксусная кислота) в течение 30 мин. Промывайте фиксированные эмбрионы 3 раза в 1 мл PBS в течение 5 мин каждый раз.
    7. Чтобы агрегировать эмбрионы, перенесите образцы в резиновую пробку и удалите PBS.
    8. Готовят 1,2% раствор агарозы-ПБС и держат раствор при 60 °C. Добавьте 200 мкл 1,2% раствора агарозы-PBS на эмбрионы, чтобы зафиксировать их в блоке агара.
    9. Выньте блок из пробки и сохраните блок в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время предварительного внедрения подхода прогревание имеет решающее значение для успеха. Мы настоятельно рекомендуем, чтобы центрифужные трубки и наконечники микропипеток, которые будут использоваться на этом этапе, были полностью предварительно прогреты перед эксплуатацией.
  3. Встраивание парафина
    1. Погрузите предварительно внедренный блок агара в 35% этанол, 50% этанол, 75% этанол и 85% этанол в течение 15 мин каждый. Затем окунуть 2 раза в 95% этанол и 100% этанол.
      ПРИМЕЧАНИЯ: В зависимости от количества эмбрионов в блоке необходимо около 5-10x объема каждого из них с последующим градуированным фиксатором в течение 15-30 минут.
    2. Погружайте блок эмбрионов в 100% раствор этанола и ксилола (соотношение 1:1) в течение 15 мин.
    3. Переведите блок в ксилол на 1 мин, чтобы сделать ткань эмбриона прозрачной.
    4. Погрузите блок в ксилол и парафин (соотношение 1:1) на 30 мин.
    5. Погружайте блок в парафин I, парафин II и парафин III на 2 ч каждый раз.
    6. Заранее заполните коробку для встраивания парафином, а затем аккуратно и горизонтально перенесите блок в нижнюю часть коробки для встраивания. После естественного затвердевания парафина затвердевший парафиновый блок можно хранить при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЯ: Предварительно внедренный образец можно использовать в криосекции, выполнив следующие действия. После того, как эмбрионы предварительно встраиваются с агарозой, как описано выше, образцы просто встраиваются в OCT Compound. После этого криосекция может быть проведена в соответствии с обычным протоколом криосекции. Впоследствии на участках могут использоваться регулярные подходы окрашивания.

4. Окрашивание гематоксилин-эозином

  1. Подготовьте участки эмбриона дрозофилы . Поместите подготовленные срезы в духовку при 60 °C в течение 15 мин, а затем погрузите срезы в ксилол 2 раза по 10 мин каждый. Погружайте секции один раз в 100% этанол и ксилол (соотношение 1:1) на 2 мин.
  2. Гидратировать срезы в 100% этаноле I, 100% этаноле II, 95% этаноле, 85% этаноле, 75% этаноле, 50% этаноле и в дистиллированной воде в течение 3 мин.
  3. Окрашивают срезы раствором гематоксилина в течение 2 мин. Быстро окуните горки в 1% раствор кислотного спирта (1 мл соляной кислоты, 100 мл 70% этанола) и промойте горки в дистиллированной воде.
  4. Опустите слайды в 50% этанол, 75% этанол, 85% этанол и 95% этанол последовательно.
  5. Окрашивают срезы раствором эозина в течение 1 мин.
  6. Обезвоживайте слайды в 95% этаноле I, 95% этаноле II, 95% этаноле III, 100% этаноле I, 100% этаноле II и 100% этаноле III в течение 1 мин каждый раз.
  7. Очищайте слайды 100% ксилолом I, 100% ксилолом II и 100% ксилолом III в течение 5 мин каждый раз.
  8. Монтируйте горки с нейтральным бальзамом в соответствии с инструкциями производителя.

5. Периодическое кислотно-серебряное окрашивание метенамином

  1. Депарафинизируют и гидратируют парафиновые участки эмбриона дрозофилы в дистиллированную воду.
  2. Окисляют срезы в 1% периодической кислоты в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Промойте горки в дистиллированной воде 3 раза по 1 мин каждая.
  4. Инкубируйте слайды примерно в 40 мл свежефильтрованного рабочего раствора метенамина серебра (3% метенамина, 5% нитрата серебра, 5% раствора бората натрия) в течение 1 ч и 20 минут при 60 °C. Затем промойте горки в дистиллированной воде в течение 1 мин.
  5. Тонируйте слайды 0,2% хлоридом золота в течение 2 мин, а затем промойте горки в дистиллированной воде в течение 1 мин.
  6. Поместите горки в 3% тиосульфат натрия в течение 3 мин, а затем промойте горки в дистиллированной воде в течение 1 мин.
  7. Противопоставьте слайды гематоксилину в течение 30 с. Мойте горки в проточной водопроводной воде в течение 3-5 мин.
  8. Обезвоживайте слайды в 70% этаноле, 80% этаноле, 95% этаноле I, 95% этаноле II, 95% этаноле III, 100% этаноле I и 100% этаноле II в течение 5 мин каждый.
  9. Очистите слайды 100% ксилолом I, 100% ксилолом II и 100% ксилолом III в течение 5 мин каждый.
  10. Монтируйте горки в нейтральный бальзам в соответствии с инструкциями производителя.

6. Иммуногистохимия

  1. Депарафинизируйте и регидратируйте парафиновые участки эмбриона дрозофилы в PBS в соответствии со стандартным протоколом19.
  2. Обрабатывайте слайды 0,3% H2O2 в метаноле в течение 10 мин при комнатной температуре и избегайте света.
  3. Предварительно нагрейте соответствующий буфер извлечения антигена примерно до 100 °C в контейнере с горками в овощной пароварке. Контейнер также должен иметь крышку. Поместите слайды в контейнер. Закройте крышку пароварки.
    1. Держите контейнер в пароварке в течение 20 минут с этой точки. Обратите внимание, что крышка контейнера для слайдов не должна быть полностью затянута, чтобы водяной пар мог попасть в процесс пропаривания.
  4. Дайте слайдам вернуться к комнатной температуре, прежде чем осторожно промыть их в PBS-T (PBS с Tween-20, pH 7,2) 3 раза по 5 мин каждый, а затем промойте слайды в PBS 3 раза по 1 мину каждый.
  5. Блокируйте слайды с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS в течение 60 мин при комнатной температуре.
  6. Инкубируют слайды с первичным антителом (анти-FKBP12 при 1:1000) в течение ночи при 4 °C или при комнатной температуре в течение 4 ч.
  7. Мойте слайды в PBS-T 4 раза по 5 мин каждая.
  8. Наносите слайды с меченым HRP полимером, конъюгированным с вторичными антителами (анти-Rabbit, 1:5000) в течение 90 мин при комнатной температуре. Делайте это в темноте, чтобы избежать отбеливания фотографий.
  9. Мойте слайды в PBS-T 3 раза по 5 мин каждая.
  10. Инкубируют слайды с 5% 3,3'-диаминобензидин-тетрагидрохлоридом (DAB) в течение 2-10 мин до тех пор, пока цвет продуктов реакции не будет соответствующим под микроскопом.
  11. Размазывайте горки гематоксилином в течение 30 с и промывайте горки в дистиллированной воде 2 раза по 5 мин каждая.
  12. Обезвоживайте слайды в 50% этаноле, 70% этаноле, 90% этаноле, 95% этаноле и 100% этаноле в течение 1 мин каждый.
  13. Очистите слайды 100% ксилолом I, 100% ксилолом II и 100% ксилолом III в течение 5 мин каждый.
  14. Монтируйте горки в нейтральный бальзам в соответствии с инструкциями производителя.

7. Гибридизация in-situ

ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы эмбриона дрозофилы были приготовлены из 0,01% воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC). Все аксессуары, используемые для гибридизации in situ , заранее применяют ночную обработку DEPC.

  1. Подготовка рибозонда
    1. Линеаризация шаблонной ДНК путем разрезания на участке фермента рестрикции ниже по потоку от клонированной вставки с использованием фермента рестрикции, который создает 5'-ные выступы. После линеаризации очищают шаблонную ДНК с помощью экстракции фенола/хлороформа и последующего осаждения этанола. Используйте стандартные протоколы.
    2. Добавьте 1 мкг очищенной шаблонной ДНК в безрамную центрифужную трубку. Поместите трубку центрифуги на лед. Добавьте достаточное количество очищенной DEPC воды к общему объему 13 мкл.
      1. Затем добавляют следующие реагенты по порядку: 2 мкл 10x NTP маркировочной смеси, 2 мкл 10x транскрипционного буфера, 1 мкл ингибитора протекторной РНКазы, 2 мкл РНК-полимеразы SP6 или РНК-полимеразы T7.
    3. Вскоре перемешайте реакцию путем пипетки и центрифуги. Инкубировать в течение 2 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительные инкубации не увеличивают выход меченой РНК. Короткое вращение (~800 об/мин), приложенное к реакционной трубке, имеет решающее значение, прежде чем перейти к следующему шагу. Этот спин позволит всему содержимому, которое может образоваться в результате инкубации, прийти на дно трубки.
    4. Добавьте 2 мкл РНКазы без ДНКазы I для удаления шаблонной ДНК и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C.
    5. Добавьте 2 мкл 200 мМ ЭДТА (рН 8,0), чтобы остановить реакцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меченые DIG РНК-зонды могут храниться при температуре от -15 до -25 °C в этаноле в течение одного года.
  2. Предварительная гибридизация участка эмбриона дрозофилы
    1. Поместите участки эмбриона дрозофилы в духовку с температурой 42 °C в течение 48 ч.
    2. Депарафинизируйте слайды в 100% ксилоле в течение 10 мин дважды.
    3. Гидратируйте слайды, последовательно погружаясь в 100% этанол, 95% этанол, 90% этанол, 70% этанол и 50% этанол в течение 5 минут.
    4. Инкубируйте слайды в PBS в течение 5 мин 3 раза, чтобы удалить фиксирующий раствор/раствор Буэна из ткани.
    5. Промыть горки раствором глицина/ПБС 100 ммоль/л 2 раза по 5 мин каждый.
    6. Мойте слайды PBS 2 раза по 5 минут каждая.
    7. Инкубируйте слайды с 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин для пронизывания мембран.
    8. Мойте слайды PBS 3 раза по 5 минут каждая.
    9. Инкубировать слайды в 15 мкг/мл протеиназы К без РНКазы в течение 30 минут при 37 °C.
    10. Инкубируйте слайды с 4% параформальдегидом в PBS в течение 3 мин, чтобы остановить пищеварение.
    11. Мойте слайды PBS 2 раза по 5 минут каждая.
    12. Инкубируют слайды в 100 мМ триэтаноламинового буфера (рН 8,0) с 0,25% (v/v) уксусного ангидрида 2 раза по 5 мин каждый.
    13. Добавьте воду DEPC в камеру для увлажнения слайдов. Добавьте на слайды 20 мкл раствора для прегибридизации (содержащего 100 мкг/мл ДНК сперматозоидов лосося). Поместите слайды в камеру влажности слайдов. Инкубируйте горки при 42 °C в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо обеспечить герметичность крышки мокрого ящика и то, чтобы влажный ящик всегда держался в горизонтальном положении, чтобы предотвратить испарение и отклонение от ткани раствора предварительной гибридизации и последующего гибридизационного раствора.
  3. Гибридизация участка эмбриона дрозофилы
    1. Удалить раствор предварительной гибридизации и промыть слайды 0,2x SSC (150 мМ хлорида натрия, 15 мМ цитрата натрия, рН 7,0) 3 раза по 5 мин каждая. Протрите лишний 0,2x SSC вокруг образцов тканей.
    2. Пипеткой применяют 30 мкл зондового гибридизационного раствора (содержащего 2-6 нг меченого дигоксином РНК-зонда путем разбавления в растворе предварительной гибридизации). Инкубируйте горки в камере влажности слайдов при температуре 42 °C в течение приблизительно 20 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в герметичности колпачка в качестве предложения последней ноты. В противном случае высыхание, вызванное утечкой либо до гибридизации, либо до гибридизации, создаст грязный фон, включая псевдоположительный в слайдах.
  4. Гибридизация
    1. Удалите раствор гибридизации и промыть слайды 4x SSC раствором 4 раза в течение 15 мин каждый при 37 °C.
    2. Промыть слайды в 2x растворе SSC с 20 мкг/мл РНКазы А в течение 30 мин при 37 °C.
    3. Промывайте горки в 1x растворе SSC в течение 15 мин при 37 °C.
    4. Промывайте слайды в 0,5x растворе SSC в течение 15 мин при 37 °C.
    5. Промывайте горки в 0,1x растворе SSC в течение 15 мин при 37 °C.
    6. Мойте слайды PBS 3 раза по 5 минут каждая.
    7. Промывайте горки в промывочном буфере (100 мМ малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) в течение 1 мин.
    8. Инкубировать слайды в 100 мл свежеприготовленного блокирующего раствора (2% овечья сыворотка в буфере малеиновой кислоты без Tween 20) в течение 30 минут.
    9. Инкубируют слайды в 20 мл раствора антител в течение 45 минут.
      1. Центрифугируйте антитело в течение 5 мин при 10 000 об/мин в исходном флаконе перед каждым использованием и тщательно пипетируйте необходимое количество с поверхности. Разбавляют анти-дигоксигенин-АП 1:5000 (150 мЕд/мл) в блокирующем растворе.
    10. Промывайте слайды в 100 мл промывочного буфера 2 раза в течение 15 минут каждый, чтобы удалить несвязанные конъюгаты антител.
    11. Уравновешивайте слайды в 20 мл детекторного буфера (100 мМ Tris-HCl, 100 мМ NaCl, рН 9,5) в течение 2-5 мин.
    12. Инкубируйте слайды с 10 мл свежеприготовленного раствора цветной подложки в камере влажности слайдов. Реакция начинается в течение нескольких минут и завершается через 16 ч. Не встряхивайте и не смешивайте во время развития цвета.
    13. Промывайте горки 50 мл дистиллированной воды в течение 5 минут, чтобы остановить реакцию.
    14. Высушите образец ночью в темноте.
    15. Обезвоживать слайды в 70% этаноле, 80% этаноле, 90% этаноле, 95% этаноле, 100% этаноле I и 100% этаноле II в течение 3 мин каждый.
    16. Очистите слайды 100% ксилолом I, 100% ксилолом II и 100% ксилолом III в течение 20 мин каждая.
    17. Смонтируйте горки нейтральным бальзамом.
    18. Документируйте изображения и анализируйте с помощью инвертированной микроскопии и программного обеспечения производителя. Выполняйте анализ распределения с помощью ImageJ по плотности положительного сигнала либо вдоль продольной оси, либо в пределах дифференциальной зоны эмбрионов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации со свежеприготовленным раствором цветной подложки на этапе 7.4.12 цвет реакции можно увидеть даже невооруженным глазом. Это наблюдение о том, как развивается цвет, может быть проверено под стереоскопом. После того, как цвет реакции является разумным и этап 7.4.13 может быть выполнен для остановки реакции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунки описывают протоколы, используемые для преодоления проблемы прикрепления эмбрионов дрозофилы с высоким содержанием липидов и хитинсодержащих хорионов (таблица 1) к поверхности стеклянной горки для исследования и экспериментов. Используя метод покрытия слайдов из хром-квасцового желатина, показанный на рисунке 1, мы улучшили прикрепление эмбрионов дрозофилы к поверхности слайдов, в то время как метод предварительного встраивания эмбриона, показанный н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опосредованная кальциевыми сигналами RyRs и IP3R является фундаментальным путем во многих физиологических и патологических процессах как позвоночных, так и беспозвоночных животных1,2,3,4. У людей точечные мутации, такие как CPVT-ассоциированная мутация R4496C, в гене RyR2 приводят к утечке кальция из саркоплазматического ретикулума кардиомиоцита, что приводит к сердечной дисфункции. Эти мутации...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (#31771377/ 31571273/31371256), Программой иностранных выдающихся ученых от Национального департамента образования (#MS2014SXSF038), Фондом исследований центральных университетов Национального департамента образования (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), а XZ поддерживается Фондом выдающихся докторских диссертаций (#2019TS082 /2019TS079), Ключевой программой Департамента образования провинции Шэньси (#20JS138), Молодежный проект Программы фундаментальных исследований в области естественных наук Департамента науки и техники провинции Шэньси (#2020JQ-885).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
-20° C ХолодильникMeiling Биология и МедицинскийDW-YL270Используется для хранения регент-80
° C Ультранизкотемпературный холодильникThermoForma серии 90Используется для хранения
агараSigma-AldrichWXBB6360VПриготовления виноградного сока Агаровые пластины
Anti-Digoxigenin-AP, Fab фрагментыRoche11093274910Для обнаружения меченого дигоксигенином соединения
Биохимический инкубаторShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Гибридизация
раствор БуинаХимический реагент Sinopharm в Пекине69945460встраивания эмбрионов дрозофилы
Eppendorf540BH07808In-situ
ЦентрифугаDenvilleC-2170Коллекция эмбрионов дрозофилы
Хром квасцыХимический реагент Sinopharm в Beijing10001018Покрытие Слайды
Водяная баня постоянной температурыJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCОкрашивание гематоксилин-эозином, иммуногистохимия, гибридизация in-situ и периодическое кислотно-серебряное окрашивание метенамином
Dako REAL EnVision Система обнаруженияDakoK5007В иммуногистохимической реакции или реакции гибридизации in situ он связывается с первичным антигенным антителом, и мишень помечается путем окрашивания.
DEPCSigma-AldrichD5758Набор для
маркировки РНК DIGRoche11093274910мечение РНК диагоксигенином-UTP путем транскрипции in vitro с помощью SP6 и Т7 РНК-полимеразы
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664Акции Drosophila melanogaster mutant
Электрическая печь для сушки шоковой машинойTianjin Taiste Instruments101-0ABДля нанесения покрытий на предметные стекла и заделки парафина
ЭозинСигма-Олдрич230251Гематоксилин-Эозин Окрашивание
этаноломХимическим реагентом Sinopharm в Пекине100092680Встраивание парафина, Окрашивание гематоксилин-эозином, Иммуногистохимия, Гибридизация in-situ и периодическое кислотно-серебряное окрашивание
метенаминомЖелатинSinopharm Химический реагент в Пекине10010328Покрытие Слайды
Хлорид золотаСигма-Олдрич379948периодическая кислота-серебро Метенамин окрашивание
гематоксилинСигма-ОлдричH3136Окрашивание гематоксилин-эозином
Высокочистое ПЦР-продукт Набор для очистки ПЦР-продуктовRoche11732668001Для очистки ПЦР-продуктов
Интеллектуальный бокс постоянной температуры и влажностиNingbo Jiangnan InstrumentsHWSДля обслуживания мух
LE AgaroseHyAgarose14190108029Предварительное встраивание
метанолаSinopharm Chemical Reagent в Пекине10014108Коллекция эмбрионов дрозофилы Микроскоп
ZEISSObserver.A1Окрашивание гематоксилин-эозином, иммуногистохимия, гибридизация in-situ и периодическое окрашивание кислотно-серебряного метенамина
микроскопом предметные стеклаMeVid Labware ПроизводствоP105-2001Покрытие предметные стекла
нейтральная камедьSinopharm Химический реагент в Пекине10004160окрашивание гематоксилин-эозином
N-гептанSinopharm Химический реактив в Пекине40026768эмбрион дрозофилы Сбор
ПарафинорезХуахайский научный приборHH-2508IIIIn-situ Гибридизация
ПарафинСинофарм Химический реактив в Пекине69019461Парафин Встраивание
рН/мВ метрSartoriusPB-10Для определения значения рН раствора
Нитрат серебраСинофарм Химический реактив в Пекине10018461Периодическое кислотно-серебряное окрашивание
Сверхчистая вода ТермоAFXI-0501-PIn-situ Гибридизация
Химический реагент XyleneSinopharm в Пекине10023418Встраивание парафинов
Центрифуга для для гибридизации in situ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situFKBP12

Похожие статьи