Методическая статья

Нормотермическая перфузионная система с открытым исходным кодом, разработанная для ученых-исследователей

DOI:

10.3791/68722

⸱

18 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Radiology and Imaging Sciences, Department of Interventional Radiology, National Institutes of Health, 4Histopathology and Autopsy Pathology, Laboratory of Pathology, National Institutes of Health, 5Division of Cancer Treatment and Diagnosis, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 6Department of Perioperative Medicine, National Institutes of Health, 7Blood Services Section, Department of Transfusion Medicine, National Institutes of Health, 8Translational Hepatology Section, Liver Disease Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 9Center for Immuno-Oncology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем протокол для модифицируемой нормотермической перфузионной системы ex vivo с открытым исходным кодом, предназначенной для преодоления высокой стоимости и ограниченной гибкости существующих платформ, обеспечивая более доступное, экономичное и итеративное использование в доклинических биомедицинских исследованиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интеграция перфузионных аппаратов ex vivo для обработки органов человека до трансплантации улучшила результаты для реципиентов и повысила доступность органов, а также открыла новые направления исследований для трансляционной медицины. Тем не менее, эти машины имеют ограниченную доступность для экспериментальных модификаций, представляя собой значительные первоначальные затраты и непомерно высокие затраты на использование для ученого-исследователя. Кроме того, существует значительная потребность в улучшенных доклинических моделях в биомедицинских исследованиях, которые позволяют достоверно исследовать клеточные процессы в условиях многоклеточных органов.

Чтобы обеспечить доступ к аналогичной технологии для более широкого исследовательского сообщества, мы построили экономически эффективную модульную нормотермическую перфузионную машину, полностью состоящую из готовых деталей, работающих с изменяемым пользователем кодом Python. Поскольку система лишена специализированного оборудования, исследователи могут создавать и дополнять систему по мере необходимости для индивидуальных исследовательских приложений.

В этой статье мы подробно описываем настройку машины и процесс перфузии, делимся нашим опытом работы со свиными и человеческими органами, а также предоставляем первые экспериментальные результаты. Эти исследования демонстрируют потенциал для изучения патофизиологии и сложных клеточных процессов с использованием неповрежденных тканей человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что до трансплантации для почек и печени ранее применялась кратковременная (<12 ч) нормотермная перфузия с помощью аппарата Liver4Life 6. Цель этой технологии была направлена на расширение жизнеспособных донорских органов, но возможные трансляционные приложения были легко очевидны для исследовательского сообщества 7,8,9,10,11,12. Для лабораторных ученых и обычных исследовательских лабораторий эти клинические инструменты почти наверняка недоступны из-за значительных первоначальных и периодических затрат12,13. Клинические нормотермические перфузионные аппараты стоят более 250 000 долларов США, а одноразовые одноразовые — от 9 500 до 60 000 долларов США за прогон 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Кроме того, права собственности и невозможность адаптировать существующую технологию затрудняют применение научных технологий.

Выдающаяся потребность в улучшенных доклинических моделях 24,25,26 в биомедицинских исследованиях в сочетании с вышеупомянутыми ограничениями вдохновила на создание модифицированной перфузионной системы с открытым исходным кодом (рис. 1). При проектировании и разработке схем мы руководствовались принципами рационального использования затрат, требований к лабораторному пространству и мобильности для трансляционных приложений. Система может быть построена за 48 000-66 000 долларов США, а стоимость каждой перфузии колеблется от 1 000 до 2 300 долларов США, что было достигнуто за счет интеграции готовых к использованию отдельных компонентов, работающих с помощью свободно загружаемого кода. Система была оптимизирована с помощью итерационного процесса с использованием донорской крови свиньи и просроченной человеческой крови, печени свиньи и частичных сегментов печени человека из операционной (Дополнительная таблица 1, Дополнительная таблица 2 и Дополнительная таблица 3). Органы размещаются в закрытом бассейне, который оптимально располагает образец для минимизации некроза давления, обеспечения идеальной траектории канюляции, дренажа стока и обеспечения нормотермии. Резервуар вмещает примерно 2-3 л перфузата перед тем, как он будет направлен на приточные контуры. Гемодиализ, который имеет решающее значение для гомеостаза электролитов и гемоконцентрации при перфузиях печени 6,27,28,29, был интегрирован через боковую цепь с независимым роликовым насосом. Фармакологические инфузии поддерживают физиологические функции (например, общее парентеральное питание (ППН), желчные соли и т.д.30), усиливают сосудистый тонус (эпопростенол, фенилэфрин), предотвращают свертывание крови (эноксапарин) и инфекции (пиперациллин-тазобактам, амфотерицин). Физиологические параметры перфузии обеспечиваются с помощью встроенных датчиков в режиме реального времени для получения значений газов крови, давления и расхода. Система обеспечивает максимальную адаптивность пользователя, так что интеграция аппаратных компонентов может происходить в любой точке цепи. Кроме того, каждый из отдельных компонентов схемы может быть заменен или модифицирован для адаптации к конкретным исследовательским вопросам и экспериментальным потребностям. Например, контур с двойным притоком может быть изменен для перфузии органов с одним притоком (т.е. почек или поджелудочной железы) путем простого удаления Y-образного разъема перед головками насоса, а клавы для инфузии/отбора проб могут быть установлены в любой точке контура. Кроме того, система работает с кодом Python, который позволяет выполнять полуавтоматическую перфузию на основе заданного набора параметров перфузии, продиктованных конечным пользователем (дополнительный рисунок 1). Например, датчики непрерывно регистрируют показания газов артериальной крови (ГГК), давления и расхода, которые выступают в качестве входных данных для реализации выходных команд для автоматической регулировки расхода газа оксигенатора, скорости насоса и т. д. Графический пользовательский интерфейс (GUI) позволяет при необходимости вручную переопределить эту автоматизацию. Его отличительной чертой является настраиваемость схемы, которая расширяет общую применимость этой системы для широкого спектра экспериментальных исследований.

Доступ к системе в полном объеме находится в свободном доступе (https://github.com/CCR-SOP/OpenSourcePerfusionSystem.git) для поощрения сотрудничества и инноваций в стремлении открыть новые глубины знаний в различных областях трансляционной науки.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Перфузионная система с открытым исходным кодом. (A) Схема перфузионной системы с открытым исходным кодом для установки двойного притока для перфузии печени. (B) Трехмерная (3D) визуализация системы во время перфузии органов с интеграцией программного обеспечения, как показано на экранах. (C) Фотография перфузионного аппарата во время эксперимента по перфузии свиней. Представленная конфигурация на рисунке предназначена только для демонстрационных целей. Во время перфузии стерильная согревающая простыня накрывает орган для поддержания стерильной оболочки. Датчик P/F: датчики давления и расхода. ХА: Печеночная артерия. ПВ: Воротная вена. HV: Печеночная вена. БД: Желчный проток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был проведен в соответствии с этическими стандартами Комитета по этике исследований человека нашего учреждения и соответствует всем применимым рекомендациям и правилам для исследований с участием людей и тканей.

1. Настройка машины

  1. Подготовка стола
    1. Настольную и мобильную тележку простерилизовать 70% спиртовым спреем и тщательно протереть. Поставьте мобильную тележку перпендикулярно левой стороне стола. Перед подключением всех трубок и оборудования по всему протоколу распылите 70% спирт или автоклав, если применимо, для стерилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед любым обращением с органами или вмешательством используйте стерильные перчатки и спиртовой спрей для обеспечения стерильности до и во время перфузии.
    2. Накройте рабочее место стерильными синими простынями, а затем впитывающими пеленками.
    3. Прикрепите держатель резервуара к ближайшей к скамейке ножке тележки так, чтобы кольцо выступало наружу, примерно на 12 дюймов ниже нижней части верхней части рабочей станции.
    4. Расположите воронку барабана с правой стороны рабочего места так, чтобы носик нависал над передним краем стола. Вырежьте круглую пену с эффектом памяти, чтобы заполнить основание барабана, оставив зазор 4 дюйма для оттока рядом с носиком. Поместите диафрагму под пенопласт, соединенный с респиратором.
    5. Возьмите 2 одеяла для нагрева воды и положите их поверх поролоновой вставки с соединительной трубкой, ориентированной в верхнюю левую часть одеяла. Отрежьте белые зажимы от трубки и вставьте в каждую трубку заусеницу Луэра с наружной резьбой 3/16 дюйма. Закрепите 1 входящий и 1 отводящий трубопровод от трубопроводов водяного нагревательного бака Y'ed к каждому одеялу.
    6. Приобретите стерильную теплую простыню и определите центральный синий квадрат. Сложите пополам вдвое и отрежьте 2 мм от угла сгиба, чтобы получилось отверстие для оттока. Поместите стерильную простыню поверх барабана так, чтобы вырезанное отверстие находилось на одной линии с выпускным носиком.
    7. Приобретите напечатанный на 3D-принтере выходной разъем и поместите магнит в паз. Поместите под простыню через выпускной носик и совместите вырезанное отверстие с отверстием в соединителе и магните. Поместите второй магнит на одном уровне с выходом, чтобы зафиксировать драпировку.
    8. Поднимите лишнюю драпировку, чтобы покрыть всю воронку барабана, и закрепите резинкой/эластичными стяжками. Сложите лишнюю простыню сверху, чтобы создать стерильный барьер. Замените вторую водяную рубашку поверх сложенной драпировки.
    9. Отрежьте кусок трубки диаметром ~30 дюймов 1/4 дюйма и прикрепите проксимальную сторону к выпускному элементу от нижней части носика воронки барабана, а дистальную сторону - к заусенцу притока резервуара.
  2. Подготовка насоса и оксигенатора
    1. Поместите насосы на мобильную тележку ближе всего к краю рабочей станции с подставкой и двумя зажимами сразу за насосами так, чтобы зажимы находились на 6 дюймов выше насосов.
    2. Приобретите 2 головки насоса и закрепите их.
    3. Приобретите 2 оксигенатора и поместите внутрь зажимы, прикрепленные к подставкам в горизонтальной конфигурации. Ориентируйте оксигенаторы так, чтобы заусеница была обращена наружу, а боковая заусеница — вправо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оксигенаторы с разъемами Люэра требуют альтернативной конфигурации, при которой этикетка обращена наружу, а внутренние штыри - вверх.
  3. Подготовка газосмесителя
    1. Отрежьте два (2) куска трубки диаметром 1/8 дюйма по 4 фута и вставьте наружную трубку 1/8 дюйма в концы каждой трубки. Подсоедините по одной трубке к каждому артериальному и венозному притоку газа.
    2. Отрежьте два (2) куска трубки диаметром 1/4 дюйма по 2 дюйма и прикрепите к одному концу луэр с внутренней резьбой 1/4 дюйма. Установите каждую из этих трубок на верхние правые заусеницы каждого оксигенатора.
    3. Подсоедините артериальную и венозную трубку притока газа 1/8 дюйма к верхнему правому разъему Люэра соответствующих оксигенаторов.
  4. Подготовка контура гемодиализа
    1. Извлеките все трубки из набора для гемодиализа, кроме той, которая ведет непосредственно в фильтр (синяя, красная, зеленая и желтая линии). Закрепите фильтр на монтажной панели в задней части рабочей станции, на расстоянии ~12 дюймов справа от насосов или на одной линии с резервуаром.
    2. Поместите 1 большой роликовый насос непосредственно справа от фильтра для притока крови. Поместите 2 перистальтических насоса меньшего размера справа от роликового насоса для крови.
      1. Возьмите две (2) 1/8-ю перистальтические трубки и поместите их внутрь белого хомута насоса. Прикрепите две (2) заусеницыЛюэра с внутренней резьбой 1/8 на каждом конце каждой трубки.
    3. Повесьте 5-литровый мешок с диализатом на правую боковую сторону рабочего места.
      1. Подсоедините диализатный мешок к входу фильтра гемодиализа, присоединивтрубку 1/8 к разъему Люэра мешка. Прикрепите наружную 1/8-ю люэра к концу этой трубки и прикрепите ее к трубке входящего перистальтического насоса.
    4. Приток/отток диализата: Получите 3 1/8-ю трубку, каждый конец которой оснащен 1/8-й внутренней трубкой Люэра.
      1. Приток: Подсоедините проксимальный конец к дистальной части трубки насоса и дистальный конец к желтой входной трубке (с 1/8 внутренней люэры) к фильтру для гемодиализа.
      2. Отток: Подсоедините проксимальный конец к зеленой трубке оттока (с 1/8-й внутренней люэровой) и дистальный конец к перистальтической трубке насоса для оттока. Подсоедините трубку 1/8 к дистальной части перистальтического насоса и слейте ее в мешок для мусора с помощью соединителей Люэра.
  5. Создание проксимальных контуров
    1. Поместите резервуар в держатель резервуара с внешними номерами и желтым колпачком разъема, направленным наружу.
    2. Отрежьте ~36 дюймов трубки 5/16 дюйма и подсоедините проксимальный конец к выпускному штакетнику на дне резервуара. Подсоедините Y-образный соединитель 5/16 дюйма к дистальному концу этой трубки.
    3. Отрежьте две (2) длины трубки 4 дюйма 5/16 дюйма и подсоедините их к концу Y-образного соединителя. Прикрепите каждый из концов этих 4-дюймовых трубок к горизонтальному штырю каждой из головок насоса.
    4. Отрежьте две (2) трубки длиной 4 дюйма 1/4 дюйма и подсоедините по 1 к каждой из вертикальных заусениц головок насоса. Соедините дистальный аспект с левым нижним штырем каждого оксигенатора.
    5. Отрежьте две (2) трубки длиной 2 дюйма 1/4 дюйма и подсоедините внутренний луэр к одному концу. Добавьте мужской колпачок Люэра и прикрепите его к правому нижнему зубцу каждого оксигенатора.
  6. Создание венозных контуров
    1. Отрежьте одну (1) трубку длиной 30 дюймов 5/16 дюйма и прикрепите проксимальный конец к выходной (правой) бородке венозного оксигенатора. Разрежьте пополам и поместите Y-образный соединитель 5/16 дюйма на дистальный конец разреза. Снова присоедините другую половину к верхнему заусенцу Y-образного соединителя.
    2. Боковой контур отбора проб: Отрежьте один (1) кусок трубки диаметром 1/4 дюйма размером 2 дюйма и растяните проксимальный конец с помощью игольчатого привода. Подсоедините его к другой заусенице Y-образного разъема 5/16 дюйма.
      1. Приобретите кюветный датчик. Подсоедините зазубренную сторону к трубке 2 дюйма, подключенной к Y-образному соединителю. Отрежьте 1-2 дюйма дистальной кюветной трубки и соедините с наружной 1/4 дюйма Люэра. Присоедините его к проксимальному концу шунтирующего датчика после калибровки, а на дистальной стороне подсоедините наружную резьбу 1/8 дюйма Люэра к трубке 1/8 дюйма.
      2. Подсоедините горизонтальную сторону Т-образного соединителя с трубкой 1/8 дюйма и наружной резьбой Luer. К перпендикулярной направленности подключите клаву для отбора проб. Подсоедините штекер Luer 1/8 дюйма к оставшейся горизонтальной части Т-образного разъема.
      3. Отрежьте 12 дюймов трубки 1/8 дюйма, прикрепите проксимальный конец к клаве для отбора проб и прикрепите 1/8 дюйма Луэра с наружной резьбой к дистальному концу. Подключите его к другому гнездовому Т-образному разъему. С одной стороны Т-образного соединителя с внутренней резьбой прикрепите наружную вилку Luer 1/4 дюйма и подключите к впускному каналу с помощью трубки 2 дюйма или 1/4 дюйма.
    3. Вернитесь к дистальному концу трубки 5/16 дюйма и присоедините еще один Y-образный соединитель 5/16 дюйма. Возьмите ~55 дюймов трубки 1/4 дюйма и прикрепите к верхнему концу Y-образного разъема 5/16 дюйма.
    4. Создание контура крови для гемодиализа: Прикрепите 1/4-дюймовую папку Люэра к дистальному концу трубки 1/4-дюймовой. Проведите трубку через большой роликовый насос. Подключитесь к притоку крови в верхней части фильтра для гемодиализа (трубки с синей линией).
      1. Отрежьте один (1) кусок трубки 1/4 дюйма 24 дюйма и подсоедините наружную трубку 1/4 дюйма Люэра к проксимальному краю. Подсоедините эту трубку к фильтру для гемодиализа для оттока крови (трубка с красной линией). Соедините дистальную сторону с заусенцем притока резервуара.
    5. Вернитесь назад, чтобы завершить контур венозного притока, ведущий к образцу. Отрежьте один (1) кусок трубки 1/4 дюйма 36 дюймов и растяните его по размеру заусенца Y-образного соединителя 5/16 дюйма.
    6. Место инфузии препарата: Приобретите 3 четырехходовых запорных крана и соедините их линейно. Подсоедините эту деталь к перпендикулярному рычагу Т-образного разъема с внутренней резьбой. К рядным кронштейнам гнездового Т-образного разъема прикрепите два наружных люэра 1/4 дюйма. Вставьте кусок на расстоянии 12 дюймов от левой стороны трубки.
    7. Прикрепите внешние датчики расхода к трубке диаметром 1/4 дюйма после места инфузии препарата. Приобретите крепление 1 9 дюймов и закрепите на уровне воронки барабана. Сделайте надрез на 2 дюйма дистальнее конца датчиков расхода и вставьте датчики давления с заусеницами в трубку 1/4 дюйма. Поместите дистальную часть трубки в центр воронки барабана. Зарезервируйте одного (1) 1/4-дюймового самца Люэра для канюляции вен в образец.
  7. Создание артериального контура
    1. Отрежьте еще ~30-дюймовый кусок трубки 5/16 дюйма и прикрепите проксимальный конец правого оттока артериального оксигенатора. Разрежьте эту трубку примерно посередине и прикрепите один Y-образный соединитель 1 5/16 дюйма.
    2. Схема боковой выборки: Создайте дубликат схемы боковой выборки, как описано в шаге 1.6.2, и прикрепите ее к нижней части Y-образного разъема, опустив кювету. Когда закончите, подсоедините выходной 1/8" Люэра к Т-образному разъему.
    3. Отрежьте один (1) кусок трубки 1/4 дюйма 36 дюймов и установите его на заусеницу Y-образного соединителя 5/16 дюйма.
    4. Повторите шаг 1.6.7. Зарезервируйте одного (1) 1/4-дюймового самца Луэра для канюляции артерии в образец.
  8. Создание венозного оттока
    1. Отрежьте ~30 дюймов трубки 1/4 дюйма и прикрепите 1 наружную 1/4 дюйма Люэра к проксимальному концу, чтобы прикрепить к выходу образца из нижней полой вены (IVC). Приложите дистальный конец к одному из приточных заусенцев резервуара.
    2. Отрежьте эту трубку ~ 6 дюймов от резервуара и прикрепите 2 1/4 дюйма наружных люэров к каждому концу. Вставьте внутреннюю Т-образную пластину с клавой, прикрепленной к перпендикулярной проекции, для отбора проб.
  9. Введите перфузат в контур, как описано в шаге 4. Разогрейте и подсоедините образец, как описано в шаге 6.1.4. или шаг 6.2.4. и начать перфузию.

2. Калибровка датчика CDI

  1. Убедитесь, что газовые баллоны калибратора заполнены и установлены в соответствии с руководством пользователя по эксплуатации, а монитор установлен в режим калибровки. Выполните калибровку в соответствии с инструкциями производителя.
  2. После завершения калибровки отсоедините устройство «датчик-кабель-головка» от монитора и немедленно интегрируйте его в соответствующие венозные и артериальные боковые контуры. Соединения Luer создаются на шагах 1.6.2 и 1.7.2.

3. Инициация кода

  1. Скачайте, установите и откройте код Python, найденный в репозитории GitHub. Убедитесь в правильной установке программного обеспечения Python и PyCharm.
  2. Создайте уникальную ветвь для каждого прогона перфузии для точной записи данных. После запуска графический интерфейс пользователя будет отображаться с двумя окнами. Ориентация одного окна на дисплей для удобного управления оборудованием и отображения параметров перфузии.
  3. Настройте параметры перфузии вручную или автоматизируйте перфузию с помощью соответствующих кнопок, отображаемых в графическом интерфейсе пользователя (дополнительный рисунок 1).

4. Создание перфузата и грунтовка системы

  1. Запустите контур примерно за 2 часа до перфузии органов, чтобы обеспечить коррекцию метаболических/электролитных нарушений, согревание до нормотермии, а также введение антикоагулянтов, антибиотиков и других фармацевтических препаратов.
  2. Свиной перфузат
    1. Возьмите 2 л цельной свиной крови типа OO и введите ее в резервуар, скачав через открытый шприц объемом 50-100 мл. Возьмите примерно 1 мл цельной крови и измерьте исходный уровень pH, электролитов и гематокрита на аппарате в месте оказания медицинской помощи.
    2. Вводите аликвоты 8,4% бикарбоната натрия по мере необходимости для противодействия кислотности из-за холодных консервантов крови. Начните гемодиализ для нормализации гиперкалиемии и лактатацидемии по мере необходимости и титруйте до желаемой концентрации гематокрита. Отрегулируйте поток газа для титрования в соответствии с физиологическими уровнями pO2 и pCO2.
    3. Применяйте фармацевтические препараты в соответствии с приведенным ниже описанием (раздел 5).
    4. Сохраняйте 1-2 л цельной крови типа OO для прерывистых болюсов по мере необходимости для поддержания гематокрита на уровне ~30-40% на протяжении всего эксперимента по перфузии.
  3. Перфузат человека
    1. Получите продукты крови с соответствующим типом крови из банка крови (с истекшим сроком годности или пожертвованными для исследовательских целей).
      Примечание: Для каждого эксперимента по перфузии требуется примерно по 4 единицы упакованных эритроцитов (эритроцитов) и плазмы.
    2. Промойте pRBC для удаления консервантов и нормализации нарушений электролита в гранулах эритроцитов перед грунтовкой. Промойте эритроциты дважды.
      1. Промывка эритроцитов: поместите pRBC и 0,9% NaCl в соотношении 1:1 в центрифужную пробирку. Центрифугировать при 1300 × г в течение 15 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно введите свежий 0,9% NaCl в соотношении 1:1 к грануле эритроцитов. Снова центрифугируете, как указано выше, и удалите 2-ю надосадочную жидкость для окончательной промывки гранул эритроцитов.
    3. Введите промытые гранулы эритроцитов в резервуар с помощью открытого шприца объемом 50-100 мл. Поместите 4 единицы плазмы в резервуар и начните циркуляцию.
    4. Начните диализ, согревание одеял и приток газа после циркуляции перфузата.
    5. Возьмите образец перфузата и при необходимости применяйте фармакологические вмешательства, чтобы обеспечить максимально возможный уровень, близкий к физиологическому, до перфузии органа.
    6. Промойте и введите дополнительно промытые гранулы pRBC и титруйте объемный статус с помощью гемодиализа по мере необходимости для поддержания уровня гематокрита на уровне 30-40%.

5. Фармакологическое вмешательство и инфузионный препарат

  1. Прием антибиотиков и противогрибковых препаратов
    1. Смешайте два флакона по 2,5 г пиперациллина/тазобактама в стерильном стаканчике для образцов с 40 мл стерильного физиологического раствора. Добавьте 10 мл в резервуар в качестве «основного антибиотика».
      1. Разведите оставшуюся смесь с 60 мл стерильного физиологического раствора и разделите между двумя шприцами по 50 мл. Подсоедините один шприц к шприцевому насосу и запрограммируйте непрерывную подачу 41 мкл/мин к месту инфузии препарата в воротную вену (шаг 1.6.6).
      2. Оставшийся антибиотик хранить в холодильнике при температуре 4 °C.
    2. Восстановите один флакон амфотерицина по 50 мг с 10 мл стерильной воды.
      1. Наберите 1 мл концентрированного амфотерицина и соедините его с 9 мл стерильного физиологического раствора. Введите смесь объемом 10 мл в резервуар в качестве «противогрибкового средства» в начале перфузии.
      2. Вводите 1 мл концентрированного амфотерицина каждые 12 ч в резервуар.
  2. Антикоагулянтная терапия
    1. Смешайте 1 мл (100 мг) эноксапарина с 49 мл стерильного физиологического раствора. Вводите смесь из расчета 5 мл на литр перфузата в начале перфузии для получения антикоагулянтного прайма.
      1. Оставшийся раствор эноксапарина хранить в холодильнике при температуре 4 °C.
      2. Вводите раствор эноксапарина (5 мл/1 л перфузата) каждые 12 ч в резервуар.
  3. Стероиды
    1. Восстановите 1 г метилпреднизолона с 20 мл стерильной воды.
    2. Подготовьте систему в соответствии со спецификациями дозирования перед началом перфузии: свиная печень получает 10 мл (500 мг) метилпреднизолона. Частичная печень человека получает 2 мл (100 мг) солумедрола.
    3. Разведите оставшуюся смесь с 40 мл физиологического раствора в шприце объемом 50 мл и поместите его в шприцевую помпу для непрерывной подачи 33 мкл/мин к месту инфузии препарата в воротную вену (шаг 1.6.6).
  4. Парентеральное питание и желчные соли
    1. Восстановите 1,7 г таурохолевой кислоты с 50 мл 10% аминокислоты + электролит концентрированного компонента парентерального питания TPN (не смешанного с декстрозой) в стерильном стаканчике для образцов. Наберите в шприц объемом 50 мл и поместите его в шприцевой насос, чтобы непрерывно подавать 83 мкл/мин к месту инфузии препарата в воротную вену (шаг 1.6.6).
  5. Контроль тонуса сосудов
    1. Вазодилатация: Восстановите 0,5 мг эпопростенола с 50 мл стерильного физиологического раствора в стерильной чашке и поместите в шприц объемом 50 мл. Поместите его в шприцевой насос и подсоедините к клаве, расположенной проксимальнее датчика потока печеночной артерии.
      1. Болюсное или непрерывное введение (10 мкл/мин) по мере необходимости для достижения желаемого среднего артериального давления и/или противодействия вазоспазму.
    2. Сужение сосудов: Разведите 5 мл (50 мг) фенилэфрина с 45 мл стерильного физиологического раствора в стерильной чашке и поместите в шприц объемом 50 мл. Хранить смесь в холодильнике при температуре 4 °C и болюсно по мере необходимости для поддержания желаемого среднего артериального давления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это требуется редко, и восстановление может быть опущено и реализовано только по мере необходимости.
  6. Калибровка датчиков давления и расхода
    1. Калибровка давления: калибровка датчиков давления без протекания перфузата. Повторное обнуление датчиков, если показания ненулевого давления отображаются в соответствии с инструкциями производителя, когда конец трубки открыт для воздуха при давлении 0 мм рт.ст. Обеспечьте правильное измерение давления, аккуратно препятствуя как проксимальному, так и дистальному концам трубки для создания повышенного давления.
    2. Калибровка потока: Выполните калибровку после того, как в контуре будет циркулировать перфузат перед перфузией органа, чтобы обеспечить точное измерение. Зажимите трубки дистальнее датчиков расхода, чтобы перекрыть поток. Повторное обнуление датчиков расхода, если ненулевой расход отображается в соответствии с инструкциями производителя. Разжальте трубки для точного измерения расхода.

6. Закупка печени

  1. Заготовка свинины
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свиная печень закупается в местной мясной лавке в соответствии с протоколами Министерства сельского хозяйства США по гуманному обращению с домашним скотом. Диссекция под руководством исследовательской группы включает инфра- и надпеченочную полую вену и желчные протоки.
    1. Стерилизуйте печень разведенным йодом в стерильном физрастворе и поместите в стерильный таз на льду. Определите воротную вену, печеночную артерию, верхнюю полую вену и общий желчный проток, канюлируйте и закрепите шелковыми завязками 4-0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желчный проток часто канюлируют с помощью фенестрированного ангиокатетера из-за его небольшого диаметра и для предотвращения обструкции желчевыводящих путей различных систем свиной желчи.
    2. Промойте канюлированную воротную вену и печеночную артерию 3 л холодного стерильного физиологического раствора (2 л PV:1 л HA) с последующим вводом 1 л раствора для консервации органов холода (750 мл PV:250 мл HA). Погрузите печень в холодный раствор для консервации органов со льдом для транспортировки.
    3. Запустите систему, как описано выше (шаг 4.1), до тех пор, пока не будут достигнуты физиологические параметры.
    4. Погрузите канюлированную печень в подогретый стерильный физиологический раствор для быстрого согревания и удаления любых воздушных эмболов. Подсоедините соответствующую входную трубку к канюлям воротной вены и печеночной артерии. Титруйте скорость насоса в соответствии с физиологическими значениями расхода и давления.
    5. Подсоедините канюлю для полой вены к выпускной трубке, чтобы облегчить отток в резервуар для завершения контура.
    6. Слейте из желчного пузыря остаточную желчь перед подключением трубки шприца к канюле желчного протока и коническому флакону для сбора.
  2. Человеческие закупки
    1. Подготовьте систему, как описано выше (шаг 4.1).
    2. Получение образцов у человека после назначенных стандартных онкологических резекций. Измерение скорости потока in vivo с помощью интраоперационного ультразвука для калибровки на системе ex vivo . Определите сегментарную воротную вену, печеночную артерию и желчный проток во время хирургической диссекции. Пересеките триаду в соответствии со стандартной хирургической техникой и передайте образец операционного поля на стерильный задний стол.
    3. Определите и канюлируйте сегментарную воротную вену, печеночную артерию, печеночную вену и желчный проток, закрепите шелковыми завязками 4-0 или проленовым швом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не проводите канюляцию оттока, если сегмент не имеет доминирующей вены оттока, чтобы избежать застойной гепатопатии. Отток из бассейна в этом случае функционирует как трубка для выхода печеночных вен/НПВ.
    4. Вернитесь в лабораторию ex vivo и взвесьте образец. Погрузите образец в подогретый стерильный физиологический раствор и подсоедините соответствующие входящие/выходящие трубки. Подсоедините канюлю желчного протока к шприцу, трубку для дренажа — к коническому флакону.
    5. Начало перфузии и титрование потока насоса для достижения желаемых параметров расхода и перфузии под давлением.

7. Титрование параметров перфузии

  1. Отбор проб перфузата из препеченочных (HA и PV боковые контуры) и постпеченочных (IVC или отток из бассейна) клавов в различных временных точках для титрования параметров перфузии на основе газов крови, электролитов, а также значений гематокрита и гемоглобина.
  2. Калибровка датчиков CDI на протяжении всей перфузии с помощью ручного анализа образцов.
  3. Отрегулируйте приток и отток гемодиализа соответственно, чтобы поддерживать объемный статус и концентрацию гематокрита на уровне 30-40% и корректировать любые метаболические и электролитные нарушения.
  4. Вручную дозируйте аликвоты 5% декстрозы, свободной воды, 8,4% бикарбоната натрия и 0,9% NaCl по мере необходимости для коррекции электролитных нарушений.

8. Варианты перфузионных контуров

  1. Адаптация к транспортировке
    1. Подключите насосы к мобильному источнику питания на время работы, чтобы обеспечить непрерывную перфузию на пути к аппарату визуализации. Подключите мобильный источник питания к розетке переменного тока для зарядки внешнего аккумулятора во время перфузии.
    2. Отключите мобильный источник питания от настенной розетки переменного тока после завершения эксперимента по перфузии.
    3. Отключите подачу газа к оксигенаторам. Зажмите боковой контур гемодиализа и отключите приток крови к фильтру. Остановите диализные насосы.
    4. Снимите датчики расхода с впускной трубки. Отключите лекарственные настои и выключите запорные краны. Отсоедините датчики давления от входной/выходной вилки.
    5. Осторожно переместите барабанную воронку и трубку к передвижной тележке, которая теперь является самостоятельным узлом и может быть транспортирована в комплект визуализации.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичные свиные трассы
Цельная свиная печень была получена от местного мясника для обеспечения экономической эффективности и использована для различных этапов оптимизации и тестирования разработки машины (дополнительная таблица 1). Здесь оцениваются первые 24 ч из трех репрезентативных прогонов печени (рис. 2). Среднее артериальное давление в печени составляло 80 мм рт.ст. ± 11 мм рт.ст., а среднее давление в портальных венах – 7,1 мм рт.ст. ± 3,3 мм рт.ст. с потоками 107 мл/мин ± 102 мл/мин и 501 мл/мин ± 329 мл/мин соответственно. Большие стандартные отклонения для давления и потока коррелируют с большой разницей в размере печени, при этом вес свиней колеблется от 50 до 350 фунтов. Контуры двойного притока позволяют осуществлять физиологические дифференциалы кислорода со средним артериальным насыщением (SO2) 95 ± 7,4% по сравнению со средним значением SO2 портальной вены 85 ± 13% (p < 0,001). Отток SO2 из печеночных вен составил 74 ± 18%, что свидетельствует о потреблении кислорода (p < 0,01), а измерения периферического pH находились в физиологическом диапазоне 7,2 ± 0,09. Дополнительные физиологические параметры, такие как общий гемоглобин (9 ± 2,5 г/дл), уровень гематокрита (28,3 ± 6,4%), уровень глюкозы (477 ± 15 мг/дл), а также изменения лактата (3,0 ± 2,5 ммоль) и калия (-0,77 ± 2,3 ммоль), контролировались на протяжении всей перфузии путем отбора проб через равные промежутки времени. При перфузии у свиней выработка желчи свидетельствовала о жизнеспособности органов. Желчный пузырь дренировали вручную, как только орган становился нормотермическим, а общий желчный проток прикрепляли к небольшой трубке для сбора. Общая продукция желчи во время перфузии составила 41 ± 6,9 мл с нормой 6,9 ± 4,0 мл/ч.

figure-results-1
Рисунок 2: Показатели перфузата во время перфузии печени свиньи (n = 3). (А) Средняя скорость притока крови (мл/мин) печеночной артерии и воротной вены с течением времени. (B) Среднее давление притока крови (мм рт.ст.) печеночной артерии и воротной вены с течением времени. (C) Сравнение процентной насыщенности эритроцитов O2 между печеночной артерией, воротной веной и нижней полой веной, демонстрирующее разницу кислорода между двойным притоком и потреблением кислорода на выходе. Были определены статистически значимые различия между сатурациями воротной вены и артериальной (p < 0,0001), сатурацией воротной вены и НПВ (p < 0,01) и артериальной сатурацией и сатурацией НПВ (p < 0,0001). (D) Оценка рН крови между печеночной артерией, воротной веной и нижней полой веной. (E) Уровни гематокрита (%) и гемоглобина (г/дл) (вверху) на протяжении всей перфузии, в дополнение к изменению PV калия (ммоль) (внизу) как маркера гемолиза. (F) Уровни глюкозы в резервуарах, отражающие средний уровень глюкозы в контуре (мг/дл) на протяжении всей перфузии. (G) Изменение уровня лактата (мг/дл) на протяжении перфузии по сравнению со значениями 0 в притоке печеночной артерии, оттоке НПВ и системном перфузате. (H) Выработка желчи (мл) с течением времени на протяжении всей перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Репрезентативные забеги человека
Перфузию проводили по трем опухолевым сегментам печени человека, продолжительность перфузии которых варьировала от 48 до 72 ч, в зависимости от требований эксперимента (рис. 3). Чтобы сравнить данные между репрезентативными запусками приложений, мы оценили первые 48 часов биохимических показателей. Перфузия аппроксимирована параметрами in vivo с непрерывным низким давлением, высоким объемным портальным венозным притоком и пульсирующим высоким давлением, низким артериальным притоком, которые отображаются в режиме реального времени для облегчения титрования. Если печень не достигала физиологических биохимических значений в течение двух часов после перфузии, эксперимент прекращали. При успешной перфузии печени среднее артериальное давление в печени составляло 84 мм рт. ст. ± 11 мм рт. ст., а среднее давление в портальных венах — 9 мм рт. ст. ± 4 мм рт. ст. с потоками 113 мл/мин ± 66 мл/мин и 317 мл/мин ± 302 мл/мин соответственно. Контуры двойного притока позволяют осуществлять физиологические дифференциалы кислорода со средним артериальным насыщением (SO2) 98% ± 3% по сравнению со средним значениемSO2 портальной вены 92% ± 7% (p < 0,0001). СО2 оттока из печеночных вен составил 86% ± 9%, что свидетельствует о потреблении кислорода (p < 0,0001), а измерения рН по всей системе находились в физиологических диапазонах от 7,3 ± 0,09. Дополнительные физиологические параметры, такие как общий гемоглобин (10,2 г/дл ± 1,6 г/дл), уровень гематокрита (30,2% ± 5,5%), уровень глюкозы (170 мг/дл ± 68 мг/дл) и изменения лактата (3,6 ммоль/л ± 2,2 ммоль/л), контролировались на протяжении всей перфузии путем взятия проб через равные промежутки времени. В репрезентативном прогоне вырабатывалось в среднем 1,4 мл/ч желчи. До и по окончании экспериментов по перфузии были получены биопсии для анализа тканей. Репрезентативные срезы тканей демонстрируют паренхиму печени, метастатическую нейроэндокринную опухоль и метастатическую колоректальную аденокарциному после перфузии.

figure-results-2
Рисунок 3: Показатели перфузата и тканей во время перфузии сегмента (сегментов) печени человека (n = 3). (A) Средняя скорость притока перфузата (мл/мин) для печеночной артерии и воротной вены. (B) Среднее давление притока перфузата (мм рт.ст.) для печеночной артерии и воротной вены с течением времени. (C) Насыщение эритроцитов кислородом (%) для входящей печеночной артерии, входящей воротной вены и оттока печеночной вены. Были определены статистически значимые различия между сатурациями воротной вены и артериальной (p < 0,0001), сатурацией воротной вены и НПВ (p < 0,0001) и артериальной сатурацией и сатурацией НПВ (p < 0,0001). (D) Перфузатный pH для входящей печеночной артерии, входящей воротной вены и оттока печеночной вены. (E) Показатели эритроцитов на протяжении всей перфузии, включая средний уровень гематокрита (%) и гемоглобина (г/дл) перфузата (вверху) с изменением перфузата калия (ммоль) от исходного уровня с течением времени (внизу). (F) Средняя концентрация глюкозы (мг/дл) для входящей печеночной артерии, входящей воротной вены и оттока печеночной вены с течением времени. (G) Изменение концентрации лактата перфузата (мг/дл) от исходного уровня с течением времени для входящей печеночной артерии, оттока печеночной вены и системного перфузата. (H) Выработка желчи (мл) с течением времени. (I) Сегменты печени человека (Куино II-IV) во время (слева) и после перфузии (справа) демонстрируют отсутствие некроза давления после оптимизации системы. Поверхностная область прижигания присутствует в верхней части левого изображения из-за интраоперационного гемостаза. (J) Постперфузионный срез ткани, демонстрирующий печеночную паренхиму (окрашивание гематоксилином и эозином, 10x, врезка 40x; масштабная линейка 50 μM). (K) Постперфузионный срез ткани, демонстрирующий метастатическую нейроэндокринную опухоль (окрашивание гематоксилином и эозином, 10x, врезка 40x; масштабная линейка 250 μM). (L) Постперфузионный срез ткани, демонстрирующий метастатическую колоректальную аденокарциному (окрашивание гематоксилином и эозином, 10x, вставка 40x; масштабная линейка 50 мкМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Репрезентативное применение: компьютерная томография перфузионного образца
Возможность интеграции источников клинических данных, таких как компьютерная томография (КТ) или магнитно-резонансная томография (МРТ), с патологией способствует развитию персонализированной диагностики и медицины. Тем не менее, патологоанатомические отчеты представляют собой краткие результаты, а гетерогенность, присущая солидным опухолям, намного превосходит человеческие возможности по разграничению. Потенциальным решением является выполнение визуализации ex vivo с последующей немедленной подготовкой макромасштабных срезов ткани для обеспечения радиомической интеграции пространственно сохраняющих клеточных данных (например, пространственная транскриптомика, высокомультиплексная иммунофлуоресценция). Для обеспечения традиционной визуализации в системе была сконструирована мобильная установка, включающая в себя переход насосов к внешнему источнику аккумуляторной батареи для обеспечения бесперебойного питания во время транспортировки и визуализации (рис. 4A). Когда печень находилась на компьютерной томографии, вводили йодсодержащее контрастное вещество и получали изображения, которые демонстрируют рентгенологические признаки, схожие с признаками, полученными in vivo (рис. 4B).

Типичное применение: Перфузия почек и поджелудочной железы
Благодаря своей конструкции система может быть адаптирована к перфузии дополнительных органов (рис. 4C-F), что устраняет необходимость в двойном притоке и тем самым снижает затраты на использование. Чтобы продемонстрировать это, мы удалили воротной венозный контур для одного артериального притока (дополнительный рисунок 2) и перфузировали почку человека (рисунок 4C) и частичную поджелудочную железу человека (рисунок 4E). Репрезентативные срезы тканей после перфузии демонстрируют клубочки (Рисунок 4D) и островки Лангерганса (Рисунок 4F).

figure-results-3
Рисунок 4: Типичное применение перфузионных аппаратов: компьютерная томография и модульность органов. (A) Мобильная адаптация системы к транспортировке. (B) Репрезентативные КТ-изображения печени с опухолью после введения йодсодержащего контрастного вещества in vivo (вверху) и ex vivo после перфузии (внизу). (C) Перфузия почки человека на перенастроенном аппарате для однократного притока. (D) На срезе ткани после перфузии видны почечные клубочки и собирательные протоки (окрашивание гематоксилином и эозином, 8x; масштабная линейка 250 мкм). (E) Перфузия дистального отдела поджелудочной железы человека на реконфигурированном аппарате для однократного притока. (F) На срезе ткани после перфузии видны островки поджелудочной железы (окрашивание гематоксилином и эозином в 8 раз; масштабная линейка 250 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Настройки кода Python для облегчения полуавтоматической перфузии. Схема, изображающая входные и выходные параметры, используемые кодом, обеспечивает полуавтоматизацию с добавлением часто используемых ручных корректировок (Таблица). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Схема с одним притоком, используемая для перфузии почек и поджелудочной железы. Датчик P/F: датчики давления и расхода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Оптимизация эритроцитов. (A) Эксперимент по перфузии только с кровью показал значительно меньший гемолиз в условиях низких оборотов по сравнению с условиями с высокими оборотами (p < 0,01) с использованием гемоглобина без плазмы в качестве суррогата для лизиса клеток. (B) Качественное сравнение плазменного гемолиза с течением времени визуально демонстрирует меньший гемолиз в состояниях с низкими оборотами по сравнению с состояниями с высокими оборотами. (К-Ж) Оценка гемолиза в системах с различными уровнями резистентности и бассейновой интеграции с плазменными суррогатами: (C) Определена значительная разница в уровнях лактата между параллельным контуром и закрытым контуром и бассейном (p < 0,0001 и p < 0,0001 соответственно). (D) Была определена значительная разница в уровнях калия между параллельной схемой и серией замкнутой и серией с бассейновой схемой (p < 0,0001 и p < 0,0001, соответственно). (E) Определена значительная разница в уровнях гематокрита между параллельной схемой и как последовательной замкнутой, так и последовательной схемой с бассейновой установкой (p < 0,0001 и p < 0,0001, соответственно). (F) Определена достоверная разница в уровнях гемоглобина между параллельной схемой и серией замкнутой и серией с бассейновой установкой (p < 0,0001 и p < 0,0001, соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Перфузии для оптимизации органов свиньи. Тридцать пять экспериментов по перфузии свиней, выполненных на этапах оптимизации, включая 25 частичных печени, 2 почек и 8 целых печени. В нее входят продолжительность перфузии и причина ее прекращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Валидация печени человека и аппликационные перфузии. Четырнадцать частичных перфузией печени человека, включая формальную левую и правую гепатэктомию, охватывающую эксперименты по односегментной перфузии. Включены патология, экспериментальная цель, продолжительность перфузии и обоснование прерывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Оптимизация только перфузата. Двадцать два прогона оптимизации только с использованием перфузатов, включая тип вида, цель эксперимента, продолжительность эксперимента и причину прекращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нормотермические перфузионные аппараты, обычно используемые перед трансплантацией солидных органов, позволили добиться значительных успехов в перфузии ex vivo. В то время как их использование с частичными органами технически осуществимо в некоторых случаях 7,8,9, они остаются недоступными для ученого-исследователя из-за высокой стоимости и ограниченной доступности. В этой работе мы стремились предоставить сопоставимую альтернативу с открытым исходным кодом для более широкого исследовательского сообщества за счет использования готовых компонентов и свободно доступного кода для запуска системы для широкого спектра исследовательских конечных точек.

Несколько этапов в рамках протокола необходимы для достижения стабильной перфузии органов. Одним из наиболее важных этапов является эффективная разгрузка давления для предотвращения коллапса паренхимы и синусоидального расширения. Это было достигнуто за счет применения пены с эффектом памяти, поддерживаемой колеблющейся диафрагмой, для равномерного распределения массы органа и поддержания околоатмосферного портального давления для адекватного дренажа. Первоначальное использование металлической решетки для поддержки печени приводило к коллапсу паренхимы и синусоидальному застою, что наблюдалось при гистологическом анализе и ультразвуковой визуализации во время перфузии. Эта проблема была частично решена путем перехода на гамак из перфорированного силикона. Несмотря на то, что некроз грубого давления был устранен, все еще сохранялись заметные признаки коллапса паренхимы, о чем свидетельствовало высокое давление в воротной вене и значительная переполненность образцов после 48 ч перфузии. Также была предпринята попытка погружения печени в физиологический раствор или кровь, и она была успешной в облегчении застойных явлений и портальной гипертензии; Однако это было невозможно из-за большого количества необходимого перфузата, трудностей в поддержании стерильности и отсутствия эффективного слива в резервуар. По сравнению с плавающим методом, мы наблюдали такое же околоатмосферное портальное давление, когда печень помещалась на подушку из пены с эффектом памяти с колеблющейся диафрагмой для более равномерного распределения веса (рис. 1B и рис. 3I). Такая конструкция позволяет получить более мягкие, лучше перфузированные сегменты, обеспечивая при этом легкий и эффективный отток крови из образца.

Вторым важным шагом является минимизация сопротивления цепи, которое придает эритроцитам напряжение сдвига для предотвращения гемолиза. Это было достигнуто за счет введения боковых контуров с ограничительными компонентами для облегчения физиологического потока, не подвергая перфузат ненужному давлению. Гемолиз является неизбежным и непрерывным процессом при машинной перфузии. На ранних итерациях системы обширный гемолиз был значительным фактором раннего прерывания. Напряжение сдвига, которое система передает эритроцитам, в основном связано с насосами из-за застоя перфузата и рециркуляции, а также из-за узкого диаметра трубок и мембран. Используемые в настоящее время насосы вызывают некоторую степень гемолиза, который со временем увеличивается. Эффективность насоса является важным фактором при гемолизе, так как более высокие потоки могут быть полезны из-за более низких скоростей рециркуляции крови и вторичного потока, смягченных большим объемом перфузата и/или более низкими скоростями насоса. Поскольку часто бывает трудно получить большие объемы pRBC, мы сосредоточили усилия на перепроектировании системы, чтобы обеспечить физиологические скорости потока при более низких скоростях насоса, обеспечивая более низкое сопротивление в контуре в целом31. Чтобы еще больше уменьшить собственное сопротивление цепи, мы параллельно интегрировали боковые цепи, что привело к снижению уровня лактата и калия и повышению уровня гематокрита и гемоглобина с течением времени (дополнительный рисунок 3). Наконец, гемофильтр тока интегрирован в боковой контур воротной вены, а кровь приводится в движение перистальтическим насосом, который обеспечивает значительное количество гемолиза из-за заметного сопротивления и напряжения сдвига, передаваемого как фильтром, так и его насосом. Одна из наших текущих усилий по оптимизации направлена на устранение этого бокового контура путем изучения возможности внедрения трубок гемодиализа в пласт. Удаление гемофильтров клинического класса позволит впоследствии удалить перистальтический насос, еще больше свести к минимуму гемолиз и снизить общую стоимость системы.

Несмотря на полезность и адаптивность описанной здесь системы, следует признать ограничения. Примечательно, что продолжительность жизнеспособной перфузии воспроизводима 3-4 дня. Гемолиз остается центральным фактором, ограничивающим продолжительность перфузии, о чем говорилось выше. Тем не менее, мы обнаружили, что значительное увеличение общего объема перфузии может существенно увеличить продолжительность перфузии, если требуется более длительное время перфузии, но это увеличивает использование ресурсов сверх того, что мы описываем здесь. Оптимальная продолжительность перфузии в конечном итоге будет зависеть от конкретного экспериментального вопроса, задаваемого системе. Например, исследования, изучающие кинетику доставки лекарств или ингибирование пути, могут быть эффективно проведены в течение 2-12 часов, в то время как вопросы, связанные с вовлечением клеток в микроокружение опухоли, могут потребовать 48 часов32 часа. Продление жизнеспособности за пределы текущего окна может быть важным для таких применений, как ремоделирование внеклеточного матрикса (т.е. фиброз), но мы считаем, что большинство приложений, связанных с раком, не потребуют дополнительных затрат ресурсов. Основное внимание уделялось трансляционным приложениям, ориентированным на онкологию, направленным на поддержание опухолей человека в контролируемой среде ex vivo, в которой терапия может осуществляться через интактную паренхиму и опухолевую сосудистую сеть, условия, которые более точно повторяют сложность сценариев in vivo25. В этом сценарии система решает давние проблемы в современных моделях доклинической онкологии, связанные с доставкой лекарств, гетерогенностью опухоли и метаболизмом лекарств, что может объяснить частые неудачи в переводе доклинического успеха в клиническую эффективность.

По сравнению с существующими коммерческими машинами система предлагает значительные преимущества в стоимости, модульную масштабируемость и гибкость экспериментов. Коммерческие устройства часто являются проприетарными, дорогостоящими и оптимизированными для полной перфузии органов в условиях трансплантации. Система масштабируема таким образом, как коммерческие машины недоступны, так что мы можем представить себе ее широкое применение. Представленная здесь система является не конечным продуктом, а скорее чертежом, который может быть изменен, адаптирован и перепрофилирован в соответствии с широким спектром исследовательских интересов и экспериментальных вопросов, заполняя пустоту для ученых во многих дисциплинах.

Будущие направления развития этой платформы включают в себя масштабирование до субсегментарных сегментов печени и объема перфузата, чтобы обеспечить использование аутологичных продуктов крови для поддержки иммуноонкологических приложений. Мы также работаем над интеграцией мультиомических платформ и визуализации в режиме реального времени, чтобы обеспечить динамический мониторинг реакции на лечение, прокладывая путь к подробным фармакологическим исследованиям. Мы надеемся, что система будет способствовать сотрудничеству и инновациям в попытке открыть новые глубины знаний в различных областях трансляционной науки.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этом исследовании и его результатах. Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано программой внутренних исследований Национальных институтов здравоохранения. Источник финансирования для визуализации образцов и предварительной радиомики поддержан премией за исследования для штатных клиницистов Предложение ID 231145 Эллиоту Леви.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность и благодарность в поддержку этого проекта следующим группам: Отделение трансфузионной медицины NIH, Отделение периоперационной медицины NIH, Отделение патологии NIH, Wagner's Meats.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1/4" внутренний диаметр x 3/8" наружный диаметр x 1/16" стена Versilon  C-219-A Гибкие трубки из ПВХКорпорация США по производству пластика57682
Шприцы 10 мл с наконечником BD Luer-LockБД302995
Шприцы 1cc с наконечником BD Luer-LockБД309628
25 Fr Portal КанюляXVIVO11.01.520
Напечатанный на 3D-принтере держатель датчика расходан/дн/дSDL-файлы см. на GitHub
Напечатанный на 3D-принтере держатель магнитан/дн/дSDL-файлы см. на GitHub
48 дюйм. В x 24 дюйма W Белый ПегбордХоум Депо109099
4-ходовой запорный кран, желтый, 2 замка Луэра с внутренней резьбой, наружный Люэр с блокировкой вращенияМировые прецизионные приборы14057-10
Шприцы 50 мл с наконечником BD Luer-LockБД309653
ACF00023 Tygon S3  автор Saint Gobain | Внутренний диаметр 5/16 дюйма x внешний диаметр 1/2 дюйма x стена 3/32 дюйма | E-3603 Без DEHP | Лабораторные трубки без фталатов | 50' Длина упаковкиСклад шланговACF00023
АмфотерицинВетеринарная аптекан/дhttps://mms.mckesson.com/product/505635/Xgen-Pharmaceuticals-39822105505
Фитинг с заусеницами, Y-образный соединитель, внутренний диаметр трубки 3/8", PP, 5/PKВВРMFLX06368-24Тип материала не критичен
Калибратор CDI 540Терумо540КЛ
Кронштейн головки кабеля CDIТерумоCDI519CL
Монитор CDIТерумо500АВХКТКЛ
Зажим для столба CDIТерумоCDI517CL
Соединитель трубки для внутривенных вентилей Clave безыгольный 100/CaГенри Шайн Дентал1097422
Clinimix с электролитамиБакстер2В7721Используйте только аминокислотную сторону, не смешивайте со стороной декстрозы
CO2 USP Grade 50 LBКислород РобертаР25
Компьютерные мониторы для графического интерфейса н/дн/длюбой тип экрана для просмотра графического интерфейса
Устройство сбора данныхИзмерительные вычисленияУСВ-202Их нужно 2 или 3, в зависимости от способа подключения оборудования
Настольный блок питания для насосаЛевитроникс100-40015нужно 2, один для HA, один для PV
Eagle 1662 Барабанная воронка с латунным экраном, диаметр 18 дюймов x высота 7 дюймов, желтыйГлобальный промышленныйWB440139
ЭпопростенолВетеринарная аптекан/дhttps://mms.mckesson.com/product/1239813/Sun-Pharmaceuticals-62756005940
Сука Luer ¼ "Колючка из натурального нейлона чистое помещение изготовлена; Упаковка 10 шт.ВВРMFLX40314-26Тип материала не критичен
Фитинг, полипропиленовый, прямой, переходники Luer с внутренней резьбой на шланг, внутренний диаметр 1/8 дюйма; 25/ПКВВРMFLX30800-08Тип материала не критичен
Фитинг, полипропилен, прямой, с наружной резьбой Luer Lock на адаптер для шланга, внутренний диаметр 1/8 дюйма; 25/ПКВВРMFLX30800-18Тип материала не критичен
Фитинг, ПВДФ, прямой, переходник с заусенцами для шланга, 5/16" ID x ¼ «Удостоверение личности; 10/ПКВВРMFLX40614-62Тип материала не критичен
Проточные крепления н/дн/дSDL-файлы см. на GitHub
Зажим датчика расходаКейенсФД-ХК20Р1
Контроллер датчика расходаКейенсФД-ХА1
Головка датчика расходаКейенсФД-ХС20
Блок питания датчика расходаКейенсМС2-Н50
Газовый блендер MCQГБ100+2нужно 2, один для HA, один для PV
Газовый баллон A, CDI 500ТерумоКДИ506
Газовый баллон B, CDI 500ТерумоКДИ507
Glucagon Kit, Глюкагон 1 мг, стерильная вода 1 мл, флаконФрезениус0593-03
В/С КЮВЕТА 1/4x1/4 Ш/6" EXT 1CA=10EA 70-2006-4298-4Терумо6934
Резервуар с жесткой оболочкой на 150 & микро; М фильтрКорпорация Haemonetics00205-00
Тепловая холодная прокладка, Mul-T-Pad, TP12E Размер прокладки 13 x 18 дюймов для насоса Gaymar TP700Муль-Т-Пад8002-062-012https://www.amazon.com/Heat-Cold-Mul-T-Pad-Gaymar-TP700/dp/B00HFF7876. Оф  обратите внимание, что Stryker также предлагает водяные рубашки с подогревом, аналогичные "Mul-T-Pad C2Dx 8002-062-012"
ИнсулинВетеринарная аптекаhttps://mms.mckesson.com/product/294668/Novo-Nordisk-Pharmaceutical-00169183311
Насос Ismatec модели Ecoline VC-280 IIИсматекISM1078B-115
LTV 1200 Педиатрический аппарат искусственной вентиляции легкихCarefusionhttps://coastbiomed.com/product/carefusion-ltv-1200-ventilator/?srsltid=AfmBOopSCKwTLmKhZXcI<чел/> CgGQHfiKwj__78jNWxVaznJCS
aq3RjXw2E-H.
Эта модель педиатрического аппарата ИВЛ была перепрофилирована из больничных излишков и не была куплена. Любой коммерческий насос периодического действия или аэрационная машина является подходящей заменой.
Основной кабель насосаЛевитроникс190-10331нужно 2, один для HA, один для PV
MaPerSol Раствор для сохранения органов, мешок 1 лРешения по сохранениюПС005
Мастерфлекс  Адаптерные фитинги, Люэр - Луэр, тройник, Avantor ВВРMFLX45508-56Тип материала не критичен
Мастерфлекс  Внутренняя заусеница Luer 3/16" ID Barb из натурального ПВДФ ПроизводствоВВРMFLX40314-22Тип материала не критичен
Masterflex Ismatec Reglo Цифровой насос с MasterflexLive, 4-канальный, 8-роликовый; 115/230 В переменного токаМастерфлексMFLX78018-22https://www.avantorsciences.com/us/en/product/NA5139147/masterflex-ismatec-reglo-digital-multichannel-pumps-avantor
Masterflex Male Luer 1/4" ID Barb из натурального ПВДФ Чистое помещение производства, 10/PKВВРMFLX40318-27Тип материала не критичен
Masterflex Male Luer 3/16" ID Barb из натурального ПВДФ Производство чистых помещенийВВРMFLX40318-22Тип материала не критичен
Стандартные лотки для бассейна плаценты MedlineМедЛайнDYNJSPLACENTA
MEDTRONIC DLP 2" СОСУД КОЛЬЦЕВОЙ, 3 ММ СКОШЕННЫЙ НАКОНЕЧНИКЕсутуресMDT30007
Пена с эффектом памяти Лучшая цена матрасаhttps://www.amazon.com/Best-Price-Mattress-Twin-Topper/dp/B07999TQWB/ref=sr_1_2_sspa?crid=17LQXX80WX5FK&dib=eyJ2Ijo<чел/> iMSJ9.oRyEE5KwmKy1pb-VvY9MOJg
_MF3wr0PmXqKcOrSEbeJWS2X
5BkFs_WSfuE1OU8GS0u_T1qM
IJbsoy3omRv1wfBCy2sw2fOUIX
JMqAO6BSb7t_D3j745MoXjedLbo
BYypyi6_Qgoc32N8bpVcmoT_k9b
LECWdi_KpEmxQx2PEok1fjlK3ywO
yBXwqPnXefMt5JeW5H1R7RO3fD
g4tidmRoEJ-YxfU3d_iprpFpm7A3zi
7CG_BMUAaGpBcRitwqb9Q4TB5bM
1i-GcMhSFKbzaGNd76CoVVVkZRjib
c9Ix-CvY.t7xCkzB81vNhO9gYLxoNen
WHEwC6JJpw9T4G6iIa5N4& dib_tag
=se& ключевые слова=память%2Bfoam& qid
=1748632609& sprefix=memory%2Bfoam
%2Caps%2C133& sr=8-2-spons& sp_csd
=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& th=1
Неодимовый магнит с прямым отверстием без резьбыМакмастер Карр336К834
Азот, 125 CU FTGrade 4.5 высокой чистотыКислород РобертаР32
Кислород, 255 куб. Г. Рад 4,5 высокой чистотыКислород РобертаР5
PDMSXA-2500: PermSelect  Мембранный модуль площадью 2500 сантиметров кв. - колючий фитинг без MCCПермселектПДМСХА-2500может получить люэр или колючую подгонку, но подключение изменится
Фенилэфрин гидрохлорид для инъекций, флакон USP 10 мг/мл 1 млЗдоровье прежде всего1000520
Полиуретановая нагревательная простыня для систем подогрева жидкостей ORS, стерильная, 44" x 66"МедЛайнОРС-300Н
Свиная кровь свиньиЛампайр7204911
Монитор датчика давленияПендТЕХPMAT2HR
НАБОР PRISMAFLEX M60Корпорация «Бакстер Хелскесс»106696
PrismaSol BGK0/2.5 Заместительный раствор для непрерывной заместительной почечной терапии, НОН ПВХБакстер110240С
Опорная плита крепления насосаЛевитроникс190-10313нужно 2, один для HA, один для PV
USB-адаптер насосаЛевитроникс100-30391нужно 2, один для HA, один для PV
Система драйвера PuraLevЛевитроникс100-91025нужно 2, один для HA, один для PV
Кабель-адаптер PuraLev IP Левитроникс190-10475нужно 2, один для HA, один для PV
ШУНТИРУЮЩИЙ ДАТЧИК SYS500 - CA = 20EA 98-0702-1541-7ТерумоCDI510HМожно купить просроченные из есутур - работают так же, иногда имеют небольшой дрейф pH
Одноразовый датчик давления, нестерильный, полисульфоновый штуцер для шланга 1/4 дюймаПендТЕХПРЕПС-Н-025
Одноразовые датчики давленияПендТЕХПРЕПС-Н-025Можно повторно использовать со стерилизацией, но проверяйте датчик перед каждым использованием
Бикарбонат натрия 8,4% раствор лабораторного классаЛабораторная аллея144-55-8
Таурохолата натрия гидратМиллипора Сигма86339-25Г
СолумедролВетеринарная аптекан/дhttps://mms.mckesson.com/product/1212228/Dr-Reddys-Laboratories-43598013074
Грелка Stryker АмазонкаB01M74Y8DI
SU Pumphead, PP, Barb 3/8", Gamma >25kGy, DCP-30.2-G25, PuraLev Левитроникс100-91071можно повторно использовать после стерилизации 
Шприцевой насос (Pump 11 Elite)Гарвардский аппарат70-4504Нужно по одному на каждый вводимый препарат
Трубка для шприцаГССМЭ2020
Водонагреватель и циркуляционный насосГрант НаучныйТК120
ЗосинВетеринарная аптекан/дhttps://mms.mckesson.com/product/1009456/Auromedics-Pharmaceuticals-55150011930

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. J Clin Transl Hepatol. 6 (3), 276-282 (2018).
  2. Eymard, C., Markmann, J. Normothermic ex vivo liver perfusion: Platform for liver graft assessment and therapeutic modification. Organogenesis. 14 (4), 169-171 (2018).
  3. Weissenbacher, A., Vrakas, G., Nasralla, D., Ceresa, C. D. L. The future of organ perfusion and re-conditioning. Transpl Int. 32 (6), 586-597 (2019).
  4. Rijkse, E., Jn, I. J., Minnee, R. C. Machine perfusion in abdominal organ transplantation: Current use in the netherlands. World J Transplant. 10 (1), 15-28 (2020).
  5. Hameed, A. M., Pleass, H. C., Wong, G., Hawthorne, W. J. Maximizing kidneys for transplantation using machine perfusion: From the past to the future: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 95 (40), e5083(2016).
  6. Eshmuminov, D., et al. An integrated perfusion machine preserves injured human livers for 1 week. Nat Biotechnol. 38 (2), 189-198 (2020).
  7. Mueller, M., et al. Long-term normothermic machine preservation of partial livers: First experience with 21 human hemi-livers. Ann Surg. 274 (5), 836-842 (2021).
  8. Lau, N. S., et al. Prolonged ex vivo normothermic perfusion of a split liver: An innovative approach to increase the number of available grafts. Transplant Direct. 7 (10), e763(2021).
  9. Hoffman, J., et al. innovative models to study ischemia/reperfusion-related redox damage in organ transplantation. Antioxidants. 12 (1), 31(2023).
  10. Kanani, T., et al. Development of a novel ex vivo porcine hepatic segmental perfusion proof-of-concept model towards more ethical translational research. Cureus. 15 (2), e35143(2023).
  11. Kanani, T., et al. A narrative review of the applications of ex-vivo human liver perfusion. Cureus. 15 (2), e34804(2023).
  12. Magbagbeola, M., et al. An adaptable research platform for ex vivo normothermic machine perfusion of the liver. Int J Comput Assist Radiol Surg. 18, 1101-1108 (2023).
  13. Riveros, S., et al. Implementation and design of customized ex vivo machine perfusion. Analysis of its first results. Artif Organs. 46 (2), 210-218 (2021).
  14. Raigani, S., et al. Viability testing of discarded livers with normothermic machine perfusion: Alleviating the organ shortage outweighs the cost. Clin Transplant. 34 (11), e1469(2020).
  15. Martins, P. N., et al. analysis, and pitfalls of clinical trials using ex situ liver machine perfusion: The international liver transplantation society consensus guidelines. Transplantation. 105 (4), 796-815 (2021).
  16. Yeh, H., Uygun, K. Increasing donor liver utilization through machine perfusion. Hepatology. 70 (1), 431-433 (2019).
  17. Wehrle, C., et al. Impact of back-to-base normothermic machine perfusion on complications and costs: A multi-center, real-world risk-matched analysis. Ann Surg. 280 (2), 300-310 (2024).
  18. Handley, T. J., Arnow, K. D., Melcher, M. L. Despite increasing costs, perfusion machines expand the donor pool of livers and could save lives. J Surg Res. 283, 42-51 (2023).
  19. Pettit, S. J., Petrie, M. C. Transplantation of hearts donated after circulatory-determined death a song of fire and ice. Circ Heart Fail. 12 (4), e005991(2019).
  20. Zimmerman, J., Carter, A. W. Cost-utility analysis of normothermic and hypothermic ex-situ machine perfusion in liver transplantation. Br J Surg. 109, e31-e32 (2022).
  21. Javanbakht, M., Mashayekhi, A., Trevor, M., Branagan-Harris, M., Atkinson, J. Cost-utility analysis of normothermic liver perfusion with the organox metra compared to static cold storage in the United Kingdom. J Med Econ. 23 (11), 1284-1292 (2020).
  22. Webb, A. N., Izquierdo, D. L., Eurich, D. T., Shapiro, A. M. J., Bigam, D. L. The actual operative costs of liver transplantation and normothermic machine perfusion in a Canadian setting. Pharmacoecon Open. 5, 311-318 (2021).
  23. Webb, A. N., Lester, E. L. W., Shapiro, A. M. J., Eurich, D. T., Bigam, D. L. Cost-utility analysis of normothermic machine perfusion compared to static cold storage in liver transplantation in the canadian setting. Am J Transplant. 22 (2), 541-551 (2022).
  24. Marshall, L. J., Bailey, J., Cassotta, M., Herrmann, K., Pistollato, F. Poor translatability of biomedical research using animals - a narrative review. Altern Lab Anim. 51 (2), 102-135 (2023).
  25. Loewa, A., Feng, J. J., Hedtrich, S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. , (2023).
  26. S.5002 - FDA Modernization Act 2.0. , Food and Drug Administration. At https://www.congress.gov/bill/117th-congress/senate-bill/5002 (2022).
  27. Eshmuminov, D., Clavien, P. A. Long-term dynamic ex vivo organ preservation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 267-268 (2023).
  28. Lascaris, B., Hoffmann, R. F., Nijsten, M. W. N., Porte, R. J., De Meijer, V. E. Continuous renal replacement therapy during long-term normothermic machine perfusion of human donor livers for up to 7 D. Transplant Direct. 10 (2), e1568(2024).
  29. Huang, J., et al. Incorporating a hemodialysis filter into a commercial normothermic perfusion system to facilitate long-term preservation of human split-livers. Artif Organs. 48 (9), 1008-1017 (2024).
  30. Clarke, G., et al. A reproducible extended ex-vivo normothermic machine liver perfusion protocol utilising improved nutrition and targeted vascular flows. Commun Med (Lond). 4 (1), 214(2024).
  31. Gross-Hardt, S., et al. Low-flow assessment of current ECMO/ECCO2R rotary blood pumps and the potential effect on hemocompatibility. Crit Care. 23 (1), 348(2019).
  32. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088(2013).
  33. Gutmann, D. H., et al. Precision pre-clinical modeling to advance cancer treatment. J Natl Cancer Inst. 117 (4), 586-594 (2025).
  34. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ex vivo

Похожие статьи