Методическая статья

Картирование дисфункциональных белок-белковых взаимодействий при заболевании

DOI:

10.3791/69197

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemical Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Neuroscience and Physiology, NYU Grossman School of Medicine, 3Proteomics Core, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4NYU Neuroscience Institute, NYU Grossman School of Medicine, 5Department of Medicine, Division of Solid Tumors, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем протокол, позволяющий захватывать и идентифицировать специфические для заболевания белок-белковые взаимодействия из нативных клеток и тканей с помощью химических зондов и масс-спектрометрии. Полученные наборы данных о взаимодействии анализируются с помощью специальной веб-платформы для выявления динамических сетевых дисфункций и изменений путей, связанных с заболеванием.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сети белок-белковых взаимодействий (ИПП) динамически ремоделируются при заболевании, однако большинство подходов системной биологии сосредоточены на изменениях в обилии белка, упуская из виду критическую дисфункцию на уровне взаимодействия. Здесь мы представляем надежный хемопротеомический метод — дисфункциональный интерактом белок-белок (dfPPI), который обеспечивает высокопроизводительное, систематическое, контекстуальное картирование дисфункций сети PPI в клетках и первичных тканях человека. Этот метод объединяет зонды химической биологии, которые селективно захватывают интерактомные сборки на основе эпихаперома, с безметочной жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) и сетевым вычислительным анализом, чтобы выявить перестройку белковых сетей, незаметную только из транскриптомных или протеомных данных. Платформа dfPPI может быть применена к заболеваниям, видам и тканям для выявления действенных узлов дисфункции и обеспечения глубокого понимания прогрессирования заболевания на системном уровне с высоким разрешением. В этом протоколе мы демонстрируем пошаговые процедуры подготовки образцов, обработки химическими зондами, обогащения аффинностью, анализа ЖХ-МС/МС без меток, а также рабочие процессы биоинформатики, используемые для создания и интерпретации наборов данных dfPPI. Данная статья направлена на содействие воспроизводимости и доступности этого подхода, а также на поддержку его принятия более широкими сообществами системной биологии и трансляционных исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функция клеток и, соответственно, организмов зависит от точной координации сетей белок-белковых взаимодействий (ИПП) 1,2. Эти сети отвечают за организацию и выполнение почти всех биологических процессов. В то время как сети ИПП по своей природе динамичны и реагируют на стресс, при заболеваниях они могут аномально перестраиваться, что приводит к нарушению адаптивных функций. Важно отметить, что эта перестройка не обязательно включает в себя изменения в экспрессии генов или белков; скорее, он возникает в результате измененных физических взаимодействий между белками, которые в противном случае нормально экспрессируются 3,4,5. Традиционные подходы в системной биологии, такие как транскриптомика или протеомика, не в состоянии охватить эти критические изменения на уровне взаимодействия.

Технологии картографирования ИПП значительно продвинулись вперед, что позволяет получить представление об организации и регулировании сотовых сетей 6,7,8,9,10,11. Обычно используемые подходы, включая масс-спектрометрию аффинной очистки (AP-MS), сшивание (XL)-MS, бесконтактное мечение и кофракционирование, имеют определенные преимущества, такие как высокая специфичность, пространственное разрешение или способность обнаруживать переходные комплексы 6,8,9,10,11 . Тем не менее, эти методы часто требуют белков-приманок, генетических манипуляций или сложной биоинформатики, и могут не совпадать с охватом крупномасштабной, вызванной болезнями перестройки белковых сетей в нативных биологических системах 6,7,8,9,10,11 . Большинству из них также не хватает масштабируемости, что делает их непрактичными для анализа больших выборочных когорт или систематического картирования изменений интерактома в зависимости от условий, типов клеток или временных точек 6,7,8,9,10,11 (Таблица 1).

Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали дисфункциональную платформу Protein-Protein Interactome (dfPPI) — химиопротеомный метод, который напрямую идентифицирует дисфункции сети PPI, ответственные за фенотипы заболевания12. В нем используется ключевой биологический вывод: при заболеваниях подмножество молекулярных шаперонов образует супрамолекулярные каркасы, называемые эпихаперомами 13,14,15. Эти структуры не участвуют в сворачивании белка, а вместо этого функционируют как узлы взаимодействия, которые реорганизуют белковую связь3. Важно отметить, что белки, изолированные в эпихаперомах, не являются случайными; Это те, кто активно участвует в поддержании фенотипа заболевания 16,17,18,19,20. Захватывая эти эпихапером-связанные белки и их интеракторы, dfPPI идентифицирует точные изменения сети, вызывающие конкретные болезненные состояния. Перепрограммирование сети, управляемое эпихапером, распространено при всех заболеваниях — большинство в когортах с болезнью Альцгеймера и ~70% в образцах рака16,20 — что подтверждает применимость dfPPI к крупным, ориентированным на болезнь исследованиям.

Платформа dfPPI охватывает весь рабочий процесс от пробоподготовки, захвата аффинности эпихаперома и интерактомной идентификации с помощью РС до последующих биоинформационных анализов, таких как обогащение путей и моделирование функциональных белковых сетей (рис. 1). Метод использует эпихапером-специфичные химические зонды, иммобилизованные на аффинных матрицах (PU-гранулы или другие зонды)13,16,17 для выделения функционального интерактома из клеток или тканей. Эти зонды уже были тщательно проверены в многочисленных публикациях на специфичность к эпихаперомам и пригодность для dfPPI 16,17,18,20,21,22. Захваченные комплексы подвергают МС с использованием процессов разложения как на гранулах, так и в геле, с последующим получением ЖХ-МС/МС БЕЗ МЕТОК. Полученные данные затем могут быть проанализированы с помощью специального биоинформатического конвейера, который определяет дисфункцию на уровне взаимодействия и связывает ее с биологическими процессами и фенотипами. Поскольку эпихаперомы скаффолдируют контекстно-зависимые взаимодействия 17,18,20, dfPPI показывает, как белковые сети ремоделируются при конкретном заболевании, типе клеток или стадии, что делает его мощным инструментом системной биологии для точного фенотипирования.

Метод обладает широкими возможностями масштабирования и был применен к сотням клинических и экспериментальных образцов, включая посмертные ткани человека и культивируемые клетки, при различных заболеваниях, таких как рак и нейродегенерация 16,17,18,19,20,22,23 . Выявляя изменения ИПП, которые определяют патологическое состояние, dfPPI позволяет как получить механистическое понимание, так и обнаружить действенные терапевтические мишени 16,17,18,19,20,22,23.

В этом протоколе мы подробно описываем экспериментальные компоненты платформы dfPPI, от аффинного захвата связанных с эпихаперомом интерактомов до подготовки образцов для ЖХ-МС/МС и идентификации интерактома с помощью МС. Конвейер вычислительного анализа, то есть то, что делается со списком белков, идентифицированных с помощью MS, для определения дифференциальных взаимодействий и функциональных последствий, здесь не рассматривается из-за ограничений по объему. Тем не менее, он находится в свободном доступе и подробно документирован через приложение dfPPI Shiny по адресу https://epichaperomics.mskcc.org (обновлено до https://dfppi.mskcc.org) и через веб-сайт Chiosis Lab по адресу https://www.chiosislab.com/resources. В дополнение к этим порталам, полный биоинформатический конвейер и сопутствующие скрипты включены в несколько публикаций, применяющих dfPPI к раку 16,17,19 и болезни Альцгеймера 18,20.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований на людях и комитета по уходу за животными и их использованию. Оборудование и реактивы, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка образцов для аффинити-захвата

  1. Извлечение белка из ткани
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован для посмертных образцов тканей мозга.
    1. Приготовьте буфер для экстракции белка, содержащий 20 мМ Трис (pH 7,5), 20 мМ KCl, 5 мМ MgCl2 и 0,01% NP-40 (нативный буфер для лизиса). Добавляйте ингибиторы протеазы и фосфатазы непосредственно перед применением. Держите буфер на льду.
    2. Поместите замороженную ткань (целевой объем около 50 мм³) в микропробирку для гомогенизатора, которая состоит из специализированной микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл с пестиком. Добавьте 500-700 мкл нативного буфера для лизиса, регулируя объем в зависимости от плотности ткани и простоты гомогенизации. Гомогенизируйте образец на льду, осторожно перемещая пестик вверх и вниз и прижимаясь к абразивным стенкам трубки гомогенизатора до образования однородной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги на льду, чтобы сохранить белковые сборки в их естественной конфигурации и избежать деградации белка.
    3. Инкубируйте лизаты при 4 °C в течение 30 минут, поместив флакон на вращающийся блок. Аккуратно перемешивайте образцы во время инкубации с помощью вращения.
    4. Центрифугируйте образцы при давлении 13 000 × г в течение 10 минут при 4 °C с помощью настольной центрифуги для удаления мусора.
    5. Соберите надосадочную жидкость и переложите их в прозрачные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Не тревожьте гранулы во время перемещения.
    6. Определите концентрацию общего белка в надосадочной жидкости с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (ВСА) в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лизаты белка могут храниться при температуре -80 °C до использования. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания. В предыдущей публикации24 рассматривается влияние повторяющихся циклов замораживания-оттаивания и температуры хранения на целостность белковых сборок.
  2. Нормализация выборки
    HSP90α и HSP90β являются основными компонентами эпихаперома и являются прямыми партнерами по связыванию химического зонда, используемого для интерактомного захвата 13,21,23. Нормализация образцов на основе HSP90α (или HSP90β) гарантирует, что количество эпихаперома, нацеленного на зонд, согласовано между образцами, что имеет важное значение для точного сравнения захваченных интерактомов. Образцы могут быть нормализованы на основе уровней HSP90, определенных с помощью вестерн-блоттинга, но могут быть использованы и другие методы. Если уровни HSP90 сопоставимы между образцами, пропустите этот раздел и перейдите к шагу 1.3. Использование блоттинга HSP90α/β здесь предназначено только для нормализации входных данных и не должно интерпретироваться как мера распространенности эпихаперома.
    1. Приготовьте 2× Lammli пробный буфер, состоящий из 4% додецилсульфата натрия (SDS), 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола, 0,02% бромофенола синего и 0,125 М Tris-HCl, pH ~6,8.
      ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол токсичен и летуч и его следует обрабатывать в вытяжном шкафу.
    2. Смешайте 5 г общего экстракта белка мозга (начиная с шага 1.1) в соотношении 1:1 (v/v) с 2× буфером для образцов Laemmli в прозрачной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
    3. Нагрейте образцы при 95 °C в течение 3-5 минут в нагревательном блоке для денатурации белков перед загрузкой на электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).
    4. Загрузите образцы в сборные гели с 8% протеином трис-глицина. В качестве альтернативы используйте ручные гели.
    5. Загрузите 5 мкл предварительно окрашенного стандарта белка на каждый гель, например, в первую лунку, чтобы определить молекулярную массу белка.
    6. Запустите гели в 1× TGS (Tris-Glycine-SDS) в режиме RT. Обычное время работы составляет 1,5-2 часа при 100 В.
    7. Приготовьте буфер для переноса, содержащий 25 мМ Трис, 192 мМ глицина и 20% метанола.
      ВНИМАНИЕ: Метанол легко воспламеняется и с ним следует обращаться в соответствии с правилами безопасности.
    8. Перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану в буфере при температуре 4 °C в течение 60 мин при постоянном напряжении (100 В).
    9. Приготовьте раствор для промывки мембраны (1× ТБС-0,1% Твин-20) и блокирующий раствор (5% молока в 1× ТБС-0,1% Твин-20). В этом протоколе используется сухое обезжиренное сухое молоко из коммерческого источника.
    10. Поместите мембрану в блокирующий раствор на 1 час при комнатной температуре (RT) с легким перемешиванием на платформе-качалке. Используйте 10 мл блокирующего раствора на один мини-гель.
    11. Удалите блокирующий раствор и инкубируйте мембрану с антителом против HSP90α (разведение 1:6000 в 10 мл блокирующего раствора) в течение ночи при 4 °C на платформе-качалке.
    12. Удалите раствор антитела и промойте мембрану три раза в течение 5 минут каждый с 10 мл моющего раствора.
    13. Добавьте HRP-конъюгированное козье вторичное антитело против кролика (разведение 1:5000 в 10 мл 1× TBS-0,1% Tween-20) и инкубируйте в течение 1 ч в RT на платформе-качалке.
    14. Удалите вторичное антитело и четыре раза промойте мембрану промывочным раствором (в том же объеме и по времени, что и выше).
    15. Обнаружение хемилюминесцентного сигнала, специфичного для HSP90α, с помощью набора с усиленной хемилюминесценцией (ECL) в соответствии с инструкциями производителя. Используйте систему хемилюминесцентной визуализации или авторентгенографическую пленку.
    16. Количественное определение уровней HSP90α в образцах на основе интенсивности сигнала и расчет коэффициента нормализации для нисходящего потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность сигнала HSP90 отражает количество эпихаперома, на который можно нацелиться на зонд, в каждом образце. Сравнивая интенсивность сигнала между образцами и нормализовав его в соответствии с эталонным образцом, прогоненным для каждого геля, можно соответствующим образом отрегулировать входные объемы для интерактомного захвата. Количественная оценка может быть выполнена с помощью программного обеспечения для денситометрии. Всегда добавляйте аликвоту эталонного образца на каждый гель, чтобы обеспечить нормализацию блотов.
  3. Подготовка полиуретановых швов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полиуретановые шарики и контрольные шарики могут быть синтезированы на месте, как сообщалось ранее21,25, или запрошены в лаборатории Chiosis после заключения соглашения о передаче материала (MTA). Их следует хранить при температуре -20 °C в изопропаноле.
    1. Возьмите аликвоту полиуретановых (ПУ)-шариков или контрольных шариков непосредственно из изопропанолового запаса. Включите примерно 30% излишек, чтобы учесть потерю валиков во время стирки и обработки.
    2. Удалите накопительный растворитель: дайте шарикам осесть, затем аспирируйте изопропанол. Добавьте нативный буфер для лизиса (1 мл для пробирки объемом 1,5 мл; 5 мл для конической пробирки объемом 15 мл) и полностью ресуспендируйте путем аккуратного пипетирования или инверсии.
    3. Промойте и уравновесьте три раза: для каждого промывки необходимо повторно запустить вихрь, центрифугу (пробирка объемом 1,5 мл: 10 000 × г, 1 мин; коническая пробирка 15 мл: 3 000 × г, 5 мин), затем отасадить надосадочную жидкость с помощью вакуумной линии, оснащенной наконечником для дозатора, стараясь не повредить гранулу.
    4. Добавьте нативный буфер для лизиса в промытые гранулы в соотношении объема 1:1 (гранулы:буфер) для получения однородной рабочей суспензии для гранул.
    5. Введите 40 μл суспензии из полиуретановых шариков (или контрольных шариков) (например, 1:1 об/в гранулы:буфер) на образец в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Используйте наконечник для пипетки с отрезанным концом, чтобы обеспечить легкое дозирование шариков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полиуретановые шарики чувствительны к свету. Используйте темные или завернутые в фольгу пробирки объемом 1,5 мл во время подъемных ступеней. Благодаря гидрофобному покрытию поверхности низкомолекулярным связующим эпихапером, полиуретановые шарики имеют тенденцию слипаться и прилипать к пластиковым поверхностям. Аккуратно пипетка и тщательно перемешайте, чтобы обеспечить равномерную ресуспендию. Крайне важно дозировать равные объемы суспензии гранул в каждый образец, чтобы избежать вариабельности захвата белка, которая может привести к непоследовательным или невоспроизводимым результатам.
    6. Промойте шарики три раза нативным буфером для лизиса, добавив 1 мл буфера в каждую пробирку, вортексированием, центрифугированием при 10 000 × г в течение 1 минуты и выбросом надосадочной жидкости путем аспирации. Убедитесь, что борта полностью подвешены между каждой стиркой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации избегайте прикосновения к бусинам. Осторожно прижмите наконечник пипетки к стенке трубки, удаляя жидкость.
    7. После окончательной промывки удалите большую часть жидкости из трубок, стараясь не потревожить гранулу шарика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вымытые бусины можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких дней. Как правило, бусины используются в течение 1-2 дней после приготовления.
  4. Интерактомная вытяжка
    Примечание: Первым этапом вытяжки является этап предварительного очищения с использованием контрольных шариков, которые конъюгированы с инертной малой молекулой, не связывающей эпихаперомы16. На этом этапе из лизата удаляются неспецифически взаимодействующие белки, агрегаты и нерастворимые остатки, тем самым улучшая специфичность последующего вытягивания полиуретановых шариков. Предварительное очищение снижает фоновое связывание и улучшает обнаружение специфических белков, ассоциированных с эпихаперомом.
    Интерактом, восстановленный по этому протоколу, анализируется методом MS, который обладает высокой чувствительностью к экспериментальным загрязнителям. Чтобы обеспечить точную идентификацию белка и сохранить качество данных, всегда используйте свежеприготовленные буферы и реагенты, минимизируйте воздействие пыли и кератина и носите чистые перчатки без пудры при работе с образцами, расходными материалами или оборудованием. Используйте специальную стеклянную посуду/расходные материалы MS для всех этапов вытягивания и внутригелевых разложений, а любые предметы, используемые для вестерн-блоттинга, храните физически отдельно. При повторном использовании стеклянной посуды обеззаритите ее путем последовательного ополаскивания 100% метанолом, сверхчистой водой, 80% уксусной кислотой, сверхчистой водой, затем высушите на воздухе. Не используйте моющие средства; Даже следовые остатки могут засорять колонки ЖХ и источники ионов.
    1. Добавьте нормализованные белковые экстракты (в соответствии с шагом 1.2, рассчитанным на основе интенсивности блоттинга HSP90) в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 40 мкл суспензии контрольных гранул (т.е. 20 мкл гранул + 20 мкл буфера), и отрегулируйте конечный объем до 250 мкл, добавив соответствующий объем нативного буфера для лизиса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения входных объемов для конкретного образца используйте формулу A1 = (60 / C1) × X1, где A1 — объем нормализованного общего белка для добавления (μL), C1 — измеренная концентрация белка (μg/μL), а X1 — коэффициент нормализации, полученный в результате блоттинга HSP90 (как описано в шаге 1.2). Объем добавляемого дополнительного буфера рассчитывается как 250 мкл минус A1. Если нормализация не требуется, используйте 250 г общего белка в 250 μл.
    2. Инкубируйте образцы при температуре 4 °C в течение 30 минут с вращением на вращателе «конец над концом» (10-15 об/мин).
    3. Центрифугируйте пробирки при 10 000 × г в течение 1 минуты при 4 °C для гранулирования контрольных шариков вместе с агрегированным или нерастворимым белком.
    4. Осторожно соберите надосадочную жидкость из контрольных шариков с помощью пипетки объемом 1 мл и переложите ее в пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 40 мкл промытой суспензии из полиуретановых шариков.
    5. Инкубируйте образцы при 4 °C в течение 3 ч с вращением на торцевом ротаторе (10-15 об/мин).
    6. Центрифугируйте каждую пробирку при 10 000 × г в течение 1 минуты, аспирируйте надосадочную жидкость и четыре раза промойте шарики 1 мл нативного буфера для лизиса. Для каждой промывки: вортекс, центрифуга и аспират, используя параметры, описанные в пункте 1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут быть обработаны для ЖХ-МС/МС с использованием одного из двух рабочих процессов: (1) SDS-PAGE с последующим расщеплением в геле или (2) расщеплением захваченных белков на гранулах.
      Для процесса разложения в геле продолжайте следовать протоколу, как написано. Для усвоения бусин промыть бусины еще два раза холодной PBS и сразу же перейти к разделу 3. Не замораживайте шарики, если приступаете к разложению на бусинах; Образцы должны быть обработаны свежими в тот же день. Замораживание белковых комплексов, связанных с гранулами, может ухудшить эффективность пищеварения, способствуя агрегации или потере растворимости белка, что приводит к снижению восстановления пептидов и повышению вариабельности. Основываясь на основных рекомендациях MS, образцы должны быть обработаны свежими в тот же день, чтобы обеспечить стабильное переваривание на гранулах.
  5. Подготовка образцов для разложения в желе
    1. Добавьте 25 мкл 2× буфера для образцов Laemmli в образцы гранул, приготовленные на этапе 1.4.6, которые содержатся в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы на этом этапе могут храниться при температуре -80 °C до 24 часов. Всегда загружайте весь объем образца в гель SDS-PAGE для разложения в геле, чтобы максимизировать покрытие протеома и обеспечить полное представление интерактома. Частичная загрузка не рекомендуется. Если объем образца ограничен и частичная загрузка неизбежна, оставшийся материал следует хранить в аликвотах, чтобы свести к минимуму циклы замораживания-размораживания и сохранить целостность интерактома.
    2. Нагрейте каждый образец при температуре 95 °C в течение 3 минут (с добавлением буфера для образца 2× Laemmli, как указано выше), чтобы денатурировать белковые комплексы и вымыть их из гранул перед загрузкой в SDS-PAGE. SDS и восстановители в буфере разрушают ИПП и высвобождают белки из матрицы.
    3. Центрифугируйте каждую пробирку при давлении 10 000 × г в течение 1 минуты при RT.
    4. Загрузите каждую надосадочную жидкость на 4-20% сборные градиентные гели SDS-PAGE.
    5. Запустите гели в рабочем буфере 1× TGS при RT и остановите прогон на полпути (~3,5-4 см в гель при 100 В, обычно 30-60 минут).
    6. Снимите гель с блока электрофореза и приступайте к окрашиванию Coomassie brilliant blue в соответствии с инструкцией производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенный гель, погруженный в 5-7 мл сверхчистой воды в пластиковом контейнере, может быть транспортирован в учреждение MS для идентификации белка. Если обработка не была произведена немедленно, хранить при температуре 4 °C в ультрачистой воде до 1-2 недель. В зависимости от основного объекта, выполнявшего работу, и экспериментальных целей были использованы два альтернативных протеомных процесса: в разделе 2 описывается разложение в геле с последующим анализом независимого от данных сбора данных (DIA)-MS с использованием масс-спектрометра квадрупольной орбиты; В разделе 3 подробно описан протокол расщепления гранул, оптимизированный для спектрометрии подвижности захваченных ионов с параллельной последовательной фрагментацией накопления (diaPASEF)26. Шаги могут быть снабжены перекрестными ссылками, где это уместно.

2. Идентификация белка с помощью ЖХ-МС/МС с расщеплением белка в геле

  1. Внутригеленевое восстановление и алкилирование цистеинилированных белков
    1. Вырежьте окрашенный участок каждой окрашенной гелевой дорожки и разрежьте ее примерно на пять одинаковых по размеру ломтиков геля. Удалите пятна с каждого ломтика, трижды инкубируя его в 500 мкл 50% (v/v) метанола в течение 1 минуты при 37 °C с перемешиванием при 700 об/мин в вибростенде с регулируемой температурой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый срез геля должен быть не больше ~1 см × 0,5 см × 1 см для обеспечения эффективной диффузии реагентов на последующих этапах, а также эффективного расщепления трипсина в геле в течение ночи. Отделите область геля, соответствующую сильно окрашенным белкам, таким как HSP90 и HSC70, которые представляют собой прямые связывающие вещества химического зонда и основные компоненты эпихаперома 15,16,23, отдельно от остальной части геля. В противном случае их высокая концентрация может препятствовать обнаружению и количественной оценке интеракторов с более низкой численностью во время анализа ЖХ-МС/МС.
    2. Каждый срез геля инкубировать в 500 мкл 5 мМ бикарбоната аммония (ABC), приготовленного в 30% ацетонитриле (ACN) при 37 °C, с встряхиванием при 700 об/мин в вибростенде с регулируемой температурой в течение 15 мин для удаления остаточного пятна. Повторяйте инкубацию до тех пор, пока гелевый срез не будет полностью очищен от пятен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое оставшееся видимое белковое пятно может препятствовать связыванию пептида с матрицей C18 на этапе очистки пептида, снижая восстановление и чувствительность к рассеянному склерозу на последующих этапах.
    3. Удалите и выбросьте раствор ABC/ACN с помощью пипетки с тонким наконечником, стараясь не потерять кусочки геля (т. е. не отсасывайте кусочки геля вместе с жидкостью). Затем добавьте 500 μL 100% ACN в каждую пробирку, убедившись, что кусочки геля полностью погружены. Инкубируйте в RT на орбитальном вибростенде при 700 об/мин в течение 10 минут или до тех пор, пока кусочки геля не станут полупрозрачными, не уменьшатся в размерах и не приобретут вид белой бумаги.
      ВНИМАНИЕ: ПКС легко воспламеняется и с ним следует обращаться в вытяжном шкафу.
    4. Удалите и выбросьте АКН из каждой пробирки с помощью пипетки с тонким наконечником, стараясь не отсасывать кусочки геля. Кратковременно центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 с, чтобы собрать остаточную жидкость, и осторожно отсасывайте оставшиеся капли с помощью пипетки с тонким наконечником. Поместите открытые пробирки в вакуумную центрифугу при температуре RT на 10-15 минут или до тех пор, пока гелевые срезы не станут сухими и жесткими.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушите. Периодически проверяйте, чтобы избежать растрескивания или чрезмерной усадки кусочков геля. После высыхания храните кусочки геля при температуре 4 °C в герметичной пробирке с низким уровнем связывания или микроцентрифужной пробирке до разложения; Гелеобразные и очищенные белки стабильны до нескольких дней при хранении при температуре 4 °C.
    5. Восстановление: Добавьте ~100 мкл 10 мМ дитиотреитола (DTT) (приготовленного из свежего 500 мМ бикарбоната аммония) в каждую пробирку с образцом, обеспечивая полное погружение кусочков геля. Инкубировать при температуре 56 °C в течение 45 мин с перемешиванием при 700 об/мин в встряхивателе с микротрубками с регулируемой температурой.
      ВНИМАНИЕ: ДТТ является раздражителем кожи и дыхательных путей. Держите в руках вытяжной шкаф для химических веществ и надевайте перчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пробирки плотно закрыты во время инкубации, чтобы избежать испарения и поддерживать концентрацию DTT.
    6. Алкилирование: Удалите раствор DTT из каждой пробирки с помощью пипетки с тонким наконечником, стараясь не повредить кусочки геля. Немедленно добавьте ~100 мкл 55 мМ йодоацетамида (IAA) в 50 мМ ABC, чтобы полностью покрыть срезы геля. Инкубировать при RT с перемешиванием при 700 об/мин в течение 30 мин в темноте.
      ВНИМАНИЕ: ИУК токсичен и чувствителен к свету. Выполняйте все манипуляции в вытяжном шкафу в перчатках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте полное удаление DTT перед добавлением IAA, чтобы избежать гашения реакции алкилирования. Оберните пробирки алюминиевой фольгой или используйте контейнеры, блокирующие свет, во время инкубации, чтобы свести к минимуму деградацию IAA.
    7. Кратковременно центрифугируйте пробирки при 1000 × g в течение 5 с при RT, чтобы собрать остаточную жидкость на дне. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью наконечника для пипетки с тонким отверстием (например, наконечника P10), чтобы не повредить кусочки геля. Слегка наклоните трубку и отсасывайте от края, чтобы свести к минимуму риск отсасывания фрагментов геля.
    8. Уравновешивание: Нанесите на кусочки геля 500 мкл 50 мМ ABC в 30% ACN. Инкубировать при RT в течение 10 мин, перемешивая при 700 об/мин на орбитальном шейкере. Этот этап помогает удалить избыток алкилирующего реагента и уравновесить гель перед обезвоживанием.
    9. Удалите раствор: Кратковременно отжимайте при 1 000 × г в течение 5 с и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки с тонким наконечником, как описано выше.
    10. Снова обезвожьте: Повторите шаги 2.1.3 и 2.1.4 для повторного обезвоживания кусочков геля с использованием 100% ACN с последующим вакуумным центрифугированием до полного высыхания. Этот этап обеспечивает оптимальное восстановление пептидов во время ферментативного сбраживания.
  2. Протеолиз в геле и очистка пептидов
    1. Переварите высушенные образцы геля, добавив трипсин MS-класса в конечной концентрации 5 нг/мкл в 50 мМ ABC для полной регидратации кусочков геля (обычно 50-100 мкл общего объема или достаточно для покрытия ломтиков геля). Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл, обеспечивая плотную герметизацию пробирок для предотвращения испарения. По возможности осторожно помешивайте (например, 300 об/мин на вибростенде с регулируемой температурой).
    2. Подкислите образец после ночного разложения, добавив 10% муравьиной кислоты (ЖК) по каплям до достижения конечной концентрации 1% (v/v) (например, добавьте 1 мкл 10% ЖК на 100 мкл дигеста). Осторожно перемешайте, затем обрабатывайте пробирки ультразвуком в течение 10 минут в ультразвуковом аппарате на водяной бане RT для усиления экстракции пептидов.
    3. Осторожно удалите пептидсодержащую надосадочную жидкость с помощью пипетки с тонким наконечником (например, узкокалиберного наконечника P10), стараясь не повредить гелевую матрицу и не отсадить фрагменты геля. Переложите собранную надосадочную жидкость в пробирку объемом 500 мкл с низким уровнем связывания и положите ее на лед.
    4. Добавьте 5% FA/50% раствор ACN (v/v) в каждую пробирку (обычно ~50-100 μл, или достаточно, чтобы полностью покрыть кусочки геля) и осторожно перемешивайте в режиме RT (например, на шейкере при 70 об/мин в течение 10-15 минут) для извлечения остаточных пептидов. Аккуратно соберите надосадочную жидкость и соедините ее с исходным пептидным раствором из пункта 2.2.3.
    5. Концентрируйте комбинированный пептидный экстракт с помощью вакуумного центрифугирования при RT (например, 1 000 × г в течение ~30 минут) до тех пор, пока не останется только небольшая капля. Не допускайте полного высыхания образца, так как это может привести к потере пептидов из-за прилипания к стенкам трубки. Используйте частично высушенный экстракт либо сразу для обессоливания , либо храните при температуре -20 °C в герметичной пробирке с низким уровнем связывания.
    6. Обессолить пептиды с помощью упакованных вручную небольших наконечников для пипеток C18 (т.е. наконечников StageTips), приготовленных с помощью двух уложенных друг на друга экстракционных дисков C18, вставленных в наконечник для пипетки объемом 200 мкл, как описано ранее27, со следующими модификациями:
    7. Активируйте диски C18, добавив 40 мкл метанола. Центрифугируйте наконечник для дозатора, содержащий диски (вставленный в пустой наконечник для пипетки объемом 200 мкл и помещенный внутрь пробирки объемом 500 мкл) с помощью настольной центрифуги при давлении 1 500 × г в течение 3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах не допускайте высыхания дисков C18. Высыхание будет мешать связыванию пептидов и элюированию. Внешний наконечник (рукав) объемом 200 μл, на котором находится упакованный вручную небольшой наконечник для пипетки C18, может потребоваться укоротить, разрезав ~ 1 см от конца, чтобы обеспечить правильное прилегание узла «два наконечника в пробирке» в центрифуге.
    8. Уравновесьте диски, добавив 0,1% FA и центрифугирование, как указано выше.
    9. Нанесите раствор пептида, восстановленный в 20 мкл 0,1% FA, непосредственно на верхнюю часть уложенных дисков.
    10. Центрифугируйте при давлении 1 500 × г в течение 5 минут, чтобы облегчить связывание пептида с дисками C18.
    11. Связанные пептиды промыть, пропустив через колонку 40 мкл 0,1% ЖК.
    12. Элюированные пептиды с 40 мкл 70% ACN, содержащими 0,1% FA. Элюированные пептиды хранят в пробирках с низким связыванием при -80 °C до анализа LC-MS/MS. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.
  3. Анализ нано-LC в сочетании с МС с использованием DIA
    1. Концентрируйте обессоленный элюат пептида с помощью вакуумного центрифугирования (например, 20-30 мин при RT, 1000 × г), оставляя небольшую каплю. Восстановите пептиды в 10 мкл 0,1% FA в воде класса LC-MS путем осторожного пипетирования вверх и вниз и кратковременного вортекса. Перед тем, как продолжить, кратковременно поверните вниз, чтобы собрать жидкость на дне пробирки.
    2. Анализируйте аликвоты 4 мкл восстановленного образца пептида с помощью нано-ЖХ-МС/МС. Разделяйте пептиды на самоупаковывающейся колонке обратной фазы (внутренний диаметр 75 мкм × 2 см, смола C18, размер частиц 3 мкм) при температуре 50 °C. Подготавливают колонну с помощью бомбы28 под давлением путем упаковки суспензии смолы С18 (в метаноле, 1:3 об/об.) в капилляр из плавленого кремнезема со встроенным распылительным наконечником длиной 10 мкм (наружный диаметр 360 мкм × внутренним диаметром 75 мкм × наконечником 10 мкм). Сопряжение колонки с помощью ионизации нанораспылением с гибридным масс-спектрометром высокого разрешения (типа квадруполь-Orbitrap), поддерживающим рабочие процессы DIA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать колонку длиной 20 см, так как она обеспечивает оптимальное разделение пептидных смесей, полученных из ломтиков геля SDS-PAGE.
    3. Поддерживайте температуру в аналитической колонке при температуре 50 °C с помощью колонной печи или нагревательного блока, чтобы обеспечить стабильное удержание и разделение пептидов. Обеспечьте стабильный контроль температуры на протяжении всего цикла, так как колебания могут повлиять на воспроизводимость.
    4. Элюируйте пептиды с использованием линейного градиента 3-40% ACN в 0,1% FA в течение 110 мин со скоростью потока 250 нл/мин. Этот градиент обеспечивает эффективное разделение пептидов до обнаружения МС. Общее время анализа, включая уравновешивание колонны, составляет 120 мин.
    5. Получение данных в режиме DIA с использованием MS с высоким разрешением, как описано ранее29.
      1. Установите полные сканирования MS1 для получения в режиме профиля с разрешением 120 000 (при м/з 200) в диапазоне сканирования 300–1650 м/з. После каждого сканирования MS1 следует фрагментация MS2 из 30 последовательных окон-предшественников (364-1370 Th) с использованием схемы скользящих изолирующих окон.
      2. Выполнение фрагментации с использованием ступенчатых нормализованных энергий столкновений 25,5, 27,0 и 30,0. По умолчанию максимальное состояние заряда прекурсора равно 4. Установите фиксированную первую массу при сканировании MS/MS равной 200 Да и получите спектры MS2 с разрешением 30 000.
      3. Используйте автоматическую настройку времени впрыска для MS2 и максимальное время впрыска 60 мс для MS1. Для сканирования MS1 и MS2 установите ионную мишень (AGC) на 3e6.
  4. Относительная количественная оценка аффинно-захваченных интерактом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения белков, идентифицированных в анализе DIA-MS аффинно-захваченных эпихаперомных интерактом, используйте программную платформу, которая поддерживает рабочие процессы DIA и обеспечивает надежное количественное определение на основе интенсивности пептидов или спектрального количества. В этом протоколе использовался MaxQuant (например, версия 2.5.1.0) и его рабочий процесс MaxDIA20,29 для идентификации пептидов/белков и количественного определения интенсивности без меток. В поисках использовалась стратегия приманки с обратной последовательностью с 1% FDR на уровнях PSM/пептидов и белков; Записи «Обратный» и «Потенциальный загрязнитель» были отфильтрованы до начала биоинформатики. Шипы не использовались; Готовность прибора была проверена с помощью 250 нг расщепления HeLa (и прерывистой 10 фмоль 6-белковой смеси), отвечающей критериям внутренней идентификации и стабильности RT.
    1. Анализируйте необработанные данные DIA-MS с согласованными параметрами по всем образцам. Включают до двух пропущенных спайности и устанавливают следующие модификации: фиксированное, карбамидометилирование цистеина; вариабельность, окисление метионина и ацетилирование белка N-конца.
    2. Используйте спектральную библиотеку in silico, основанную на базе данных белков человека UniProt (например, ~20 000 записей), гарантируя, что последовательности приманок и загрязняющих веществ включены для точной оценки коэффициента ложных открытий (FDR). Укажите триптическое пищеварение, если не использовался альтернативный фермент. Проверенная спектральная библиотека человека (основанная на выпуске UniProt от 18.06.2020, 20 956 записей) доступна в репозитории Института биохимии Макса Планка30.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы этому рабочему процессу с прогнозируемыми библиотеками, шаг 3.4 иллюстрирует обработку без библиотек, которая позволила получить сопоставимую идентификацию и количественную оценку этих наборов данных.
    3. Количественно оценивайте распространенность белка с помощью значений интенсивности (а не интенсивностей количественного определения без меток [LFQ]), поскольку они больше подходят для анализа нисходящей сети PPI. Убедитесь, что выбор параметра LFQ отменен, чтобы избежать артефактов нормализации, которые могут исказить данные аффинити-обогащения. Вместо этого используйте исходные значения интенсивности, полученные из спектральных совпадений пептидов, которые отражают силу взаимодействия, а не глобальную экспрессию белка. Применяйте соответствующие критерии фильтрации (например, минимум один уникальный пептид на группу белков) для повышения надежности идентификации и количественного определения белков. Экспортируйте полученную таблицу интенсивности белка для последующего статистического и сетевого анализа.
      Примечание: В отличие от стандартных протеомных рабочих процессов, где значения LFQ помогают нормализовать белковую нагрузку в цельных лизатах, здесь белки обогащаются за счет аффинного захвата эпихапером. Этот этап обогащения вносит биологическую дисперсию, которую нормализация LFQ может скрывать. Таким образом, предпочтение отдается исходным значениям интенсивности, так как они лучше отражают дифференциальные белок-эпихаперомные взаимодействия в разных условиях и сохраняют сигнал, необходимый для анализа на уровне нисходящей сети (например, dfPPI). В предыдущих исследованиях с использованием поиска на основе талисманов16,18 вместо интенсивностей также использовались значения спектрального подсчета MS/MS. В таких рабочих процессах аффинного захвата, как этот, спектральный подсчет отражает частоту взаимодействия и хорошо подходит для идентификации дифференциально взаимодействующих белков в разных условиях. В отличие от значений LFQ, подсчет MS/MS не предполагает глобальной нормализации по всему протеому, сохраняя биологически значимую дисперсию от этапа обогащения эпихаперомом.

3. Идентификация белка с помощью ЖХ-МС/МС с расщеплением белка на грануле

  1. Разложение на гранулах
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить оптимальное извлечение белка и свести к минимуму потери образца во время расщепления белка на гранулах для анализа РС, важно использовать микроцентрифужные пробирки с низким содержанием белка. Эти пробирки сконструированы таким образом, чтобы уменьшить абсорбцию белка к стенкам пробирки, тем самым улучшая извлечение пробы. Все реагенты, используемые в этом разделе, должны быть свежеприготовленными с использованием воды и химикатов класса LC-MS. При отправке образцов в протеомный керн ознакомьтесь с местными политиками, так как некоторые учреждения могут требовать, чтобы все буферы были стерилизованы фильтром перед использованием.
    1. Удалите все остатки PBS, которые могут остаться в пробирке, начиная с шага 1.4.6. Суспендируйте гранулы в 80 мкл 2 М мочевины, свежеприготовленной в 50 мМ ABC, pH 8,5. Обеспечьте полное перемешивание с помощью пипетирования или кратковременного вортексинга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем пропорционально в зависимости от количества и типа валика. Этот протокол оптимизирован для 40 мкл суспензии из полиуретановых гранул.
    2. Добавьте DTT для достижения конечной концентрации 1 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий 10 мМ раствор DTT из стокового раствора 1 М DTT в воде класса LC-MS непосредственно перед использованием, так как DTT склонен к окислению в растворе. Добавьте необходимый объем непосредственно в образец и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.
    3. Закройте пробирку крышкой и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут с встряхиванием при 1 100 об/мин на орбитальном шейкере с подогревом. Плотно закройте крышки, чтобы свести к минимуму испарение.
    4. Добавьте IAA, чтобы получить конечную концентрацию 3,67 мМ. Инкубировать в темноте при RT в течение 45 минут с встряхиванием при 1 100 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий запас 10 мМ IAA в воде класса LC-MS непосредственно перед использованием. Добавьте к образцу необходимый объем и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.
    5. Добавьте дополнительное DTT для гашения непрореагировавшей IAA, достигнув конечной концентрации 3,67 мМ. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гашение непрореагировавших IAA предотвращает чрезмерное алкилирование, которое может поставить под угрозу активность протеазы и эффективность пищеварения. Приготовьте DTT fresh и рассчитайте объем на основе текущего объема образца для достижения целевой концентрации.
    6. Добавьте в образец 750 нг 0,5 мг/мл протеазы Lys-C MS-класса. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч с встряхиванием при 1 150 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте Lys-C, растворив в воде класса LC-MS. Храните аликвоты ферментов при температуре -80 °C и избегайте многократных замораживаний-оттаиваний.
    7. Добавьте 750 нг 0,5 мг/мл свежеприготовленного трипсина секвенирующего качества. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C с встряхиванием при 1 150 об/мин. Инкубировать не дольше 16-18 ч для предотвращения переваривания и деградации пептидов.
    8. На следующий день центрифугируйте образец при концентрации 1000-5000 × г в течение 1-5 мин в режиме РТ и перенесите надосадочную жидкость путем пипетирования в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Выбросьте бусины.
    9. Отрегулируйте pH дигеста до уровня ниже 3, добавив по каплям 50% трифторуксусной кислоты (ТЖК). Проверьте pH с помощью индикаторных полосок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный диапазон pH должен составлять ~2,5-3,0, а образцы должны быть подкислены перед обессоливанием.
      ВНИМАНИЕ: ТФК является коррозионным и летучим веществом. Добавьте вытяжной шкаф и наденьте надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
  2. Пептидное обессоливание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обессоливания пептидов и очистки используйте небольшие наконечники для пипеток в упаковке C18 (т.е. StageTips)31. Приготовьте наконечники C18 StageTips, упаковав три слоя материала C18 (например, твердофазные экстракционные диски C18) в наконечник для дозатора объемом 200 мкл. Также можно использовать предварительно изготовленные, имеющиеся в продаже спиновые колонны C18. Следуйте протоколу производителя по кондиционированию, загрузке образцов и элюированию пептидов. Производительность (например, эффективность удержания, выход на восстановление) может варьироваться между домашними и коммерческими устройствами. Наконечники для пипеток небольшого размера в упаковке C18 должны быть плотно упакованы, чтобы избежать байпасного потока.
    1. Последовательно обеспечьте температуру наконечников для пипеток в небольших упаковках C18: (1) 100 μл метанола. Центрифугируйте при 400 × г и выбросьте проточные; (2) 100 мкл 70% ACN/0,1% TFA. Центрифугируйте при 400 × г и выбросьте проточный; (3) 100 мкл 0,1% ТФК. Центрифугируйте при 400 × г и выбросьте проточный. Повторите этот шаг дважды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кондиционирование обеспечивает полное смачивание гидрофобной смолы C18. Для предварительно изготовленных, имеющихся в продаже спиновых колонн C18 также можно использовать вакуумные коллекторы. Пользователям следует обратиться к инструкциям производителя для получения конкретных рекомендаций по обращению.
    2. Загрузите расплод подкисленного пептида на кондиционированные наконечники для пипеток небольшого размера, упакованные в C18, медленно пипетируя образец непосредственно в наконечник. Центрифугируйте при давлении 300 × г , чтобы дигездей прошел через смолу, и отбросьте проточный. Если объем образца превышает емкость, загрузите его в несколько раундов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пипеткой наносите дигест непосредственно на набивную смоляную подложку, избегая попадания пузырьков воздуха. Если вы используете наконечники с низким удержанием, коснитесь внутренней стенки небольших наконечников для пипеток в упаковке C18, чтобы жидкость медленно и равномерно высвобождалась.
    3. Пипетка 100 мкл 0,1% FA непосредственно в небольшой наконечник для дозатора, упакованный в C18, чтобы раствор полностью пропитал материал C18. Центрифугируйте при 400 × г и выбросьте проточный. Повторите этот шаг дважды, чтобы удалить соли и мешающие вещества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым отжимом убедитесь, что жидкость полностью протекает через материал C18. Чтобы избежать улавливания пузырьков воздуха, медленно распыляйте промывочный раствор вниз по стенке наконечника дозатора.
    4. Элюируйте связанные пептиды путем пипетирования 50 мкл 70% ACN/0,1% FA в небольшой наконечник для дозатора, упакованный в C18. Центрифугируйте при давлении 300 × г и соберите элюат в чистую микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания. Повторите этот шаг дважды, чтобы обеспечить полное вымывание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного восстановления элюата может потребоваться несколько раундов центрифугирования. Если остаточная жидкость осталась в основании наконечника, осторожно постучите по маленькому наконечнику пипетки, упакованному в C18, или выполните короткие дополнительные отжимы, чтобы собрать оставшийся объем. Объедините элюаторы и проверьте итоговый объем, прежде чем продолжить.
    5. Заморозьте и высушите элюированные пептиды с помощью вакуумного концентратора до полного высыхания. Убедитесь, что крышка расположена неплотно, чтобы обеспечить вентиляцию, но избегайте разбрызгивания.
    6. Восстановите высушенные пептиды, добавив 12 мкл 0,1% FA в воду класса LC-MS непосредственно на дно пробирки. Аккуратно оборчите и обработайте трубки ультразвуком, чтобы полностью растворить пептиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вся пеллета или высушенная пленка полностью восстановлены. Растворение с помощью пипеток сопряжено с риском потери пептидов из-за прилипания к поверхностям наконечников.
    7. Ультразвуком обрабатывайте восстановленные пептиды в течение 5 минут в сонике для ванны, наполненном прохладной водой, чтобы обеспечить полное растворение и предотвратить перегрев.
    8. Центрифугируйте пептиды при 20 000 × г при 4 °C в течение 10 минут. Перенесите пептидную надосадочную жидкость в соответствующую пробирку автосамплера для загрузки в систему LC-MS. Используйте высококачественные полипропиленовые флаконы малого объема, проверенные методом газовой хроматографии (ГХ), со связующими крышками перегородки из силикона/политетрафторэтилена (ПТФЭ), чтобы свести к минимуму потери пробы. Четко маркируйте флаконы с указанием идентификатора образца и порядка инъекции.
    9. Оцените концентрацию пептидов с помощью спектрофотометра на длине волны 280 нм. Обратите внимание, что это приблизительное значение и может зависеть от содержания ароматических остатков или загрязняющих веществ. В качестве альтернативы используйте колориметрические пептидные анализы для более точного количественного определения.
  3. Параметры LC и MS
    Примечание: Следующие параметры LC и MS оптимизированы для системы nano-LC в сочетании с масс-спектрометром, используемым в текущем протоколе. Для других систем nano-LC и масс-спектрометров параметры должны быть скорректированы соответствующим образом.
    1. Еженедельно подготавливайте мобильные фазы, чтобы обеспечить совместимость с LC-MS и свести к минимуму загрязнение: (1) Мобильная фаза A: добавьте 1 мл FA класса LC-MS к 1 л воды класса LC-MS и (2) Mobile Phase B: добавьте 1 мл FA класса LC-MS к 1 л ACN класса LC-MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только растворители и кислоту класса LC-MS. Подготовьте обе фазы в чистых стеклянных бутылках и при необходимости дегазируйте систему LC. Откажитесь от неиспользованных фаз еженедельно, чтобы избежать роста или деградации микроорганизмов.
    2. Установите капиллярную колонку из плавленого кремнезема длиной 25 см и внутренним диаметром 75 мкм, наполненную частицами обратной фазы C18 размером 1,7 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с колоннами осторожно, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха или повреждения упаковочного материала. Следуйте инструкциям производителя по установке и балансировке колонн.
    3. Кондиционируйте колонну, постепенно увеличивая расход с 50 нл/мин до 300 нл/мин с помощью 3% подвижной фазы B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап обеспечивает надлежащее увлажнение и балансировку неподвижной фазы перед введением образца. Контролируйте давление в колонне во время увеличения расхода. Резкие скачки давления могут указывать на пузырьки воздуха или засорение колонки. Равновесие можно считать завершенным, когда базовое давление стабилизируется.
    4. Поддерживайте температуру колонки на уровне 50 °C для обеспечения оптимальных хроматографических характеристик.
    5. Введите 100 нг триптического расщепления клеток HeLa в качестве стандарта контроля качества (QC) для оценки производительности системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция контроля качества служит эталоном для оценки постоянства времени удержания LC, чувствительности MS и покрытия протеома между прогонами. Сравнивайте количество идентификационных белков, воспроизводимость времени удержания и интенсивность сигнала с эталонным набором данных контроля качества, чтобы подтвердить готовность системы перед анализом экспериментальных образцов. Используйте коммерческие стандарты дайджеста HeLa, приготовленные в известных концентрациях, для воспроизводимости в экспериментах.
    6. Используйте градиентное элюирование от 2% до 35% подвижной фазы B в течение 90 мин при расходе 300 нл/мин. 90-минутный градиент обеспечивает разделение пептидов с высоким разрешением, подходящее для сложных протеомов. Следуя градиенту, задержитесь на 95% Mobile Phase B в течение 7 минут, чтобы промыть колонну.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включите этап повторного уравновешивания (например, возврат к 2% B в течение 10-15 мин) перед следующей инъекцией, чтобы обеспечить воспроизводимость столбцов между прогонами. Избегайте резких изменений градиента, которые могут повлиять на стабильность времени удержания и форму пика.
    7. Проведите анализ МС с помощью масс-спектрометра, оснащенного совместимым с нанопотоком источником ионизации электроспрея (например, типа CaptiveSpray).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Источник ионов CaptiveSpray обеспечивает стабильное электрораспыление при низких скоростях нанопотока, повышая эффективность ионизации и чувствительность. Для лабораторий, использующих альтернативные масс-спектрометры, соответствующим образом регулируют параметры сбора данных и ионизации. Обеспечьте надлежащую настройку и калибровку перед анализом для поддержания точности и разрешения. Правильно расположите излучатель распыления и следите за стабильностью распыления во время работы, чтобы предотвратить выпадение сигнала.
    8. Используйте метод diaPASEF, не зависящий от данных,32. Для пользователей, не знакомых с diaPASEF, обратитесь к технической документации производителя или последним протоколам, описывающим рабочие процессы спектрометрии подвижности захваченных ионов (TIMS)-DIA33 для оптимизации для различных типов образцов или длин градиента.
      Примечание: diaPASEF сочетает TIMS с DIA для увеличения скорости и чувствительности секвенирования за счет выравнивания ионов прекурсора и фрагмента в измерении подвижности34. Убедитесь, что устройство TIMS правильно откалибровано и синхронизировано с квадруполем, чтобы избежать смещения ионной подвижности и массовых окон.
    9. Используйте следующие настройки прибора: (1) Диапазон масс: от 100 до 1700 м/з; (2) Диапазон подвижности ионов: 0,60-1,60 В·с/см²; (3) Энергия столкновения: 20-59 эВ, с наклоном; (4) Время нарастания: 100 мс; (5) Время накопления: 100 мс; (6) Диапазон масс для diaPASEF: 400-1201 Да; (7) Ширина окна массы: 26 Да с перекрытием 1 Да; (8) Количество массовых ступеней за цикл: 32; (9) Время цикла: ~1,8 с
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки оптимизированы для обеспечения баланса между глубиной покрытия и скоростью сканирования. Могут потребоваться незначительные корректировки (например, ширина окна или количество ступеней) в зависимости от сложности выборки, длины градиента и производительности системы LC-MS. Идентификация более 7500 белков для расщепления HeLa указывает на оптимальную производительность системы. Количество опознавательных знаков может варьироваться в зависимости от прибора и должно оцениваться соответствующим образом.
    10. Загружайте 300-400 нг пептидной пробы за одну инъекцию, чтобы не допустить перегрузки аналитической колонки. Перегрузка может привести к уширению пиков, подавлению ионов и снижению воспроизводимости. Подтвердите концентрацию пептида перед инъекцией с помощью спектрофотометра или колориметрического пептидного анализа, чтобы избежать вариабельности между прогонами.
    11. Выполняйте инъекции холостых патронов между группами образцов, чтобы избежать переноса. Используйте 100% подвижную фазу A (вода с 0,1% FA) в качестве бланка для впрыска. Это вымывает остаточные пептиды из колонки и снижает загрязнение между прогонами. Контролируйте исходный уровень и фоновые ионы, чтобы убедиться в достаточной очистке.
  4. Анализ данных DIA
    1. Используйте подходящее программное обеспечение, поддерживающее анализ данных с использованием directDIA workflow35 и обработку данных протеомики DIA без использования библиотек. Выполнение идентификации и количественного определения белка на основе базы данных UniProt FASTA36 со стандартными параметрами поиска и настройками количественного определения по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все параметры, включая специфичность фермента, настройки модификации, пороговые значения FDR и результаты анализа после анализа, подробно описаны в дополнительном файле 1. Альтернативные платформы анализа DIA, такие как DIA-NN37 , также могут использоваться, если они поддерживают аналогичные рабочие процессы и результаты.
    2. Запуск directDIA без библиотеки с пороговыми значениями q-значения, соответствующими 1% FDR на уровне предшественников, пептидов и белковых групп; Исключите идентификацию ложных целей до последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарты iRT не были добавлены; Производительность была сравнительна с помощью дайджеста HeLa в соответствии с предопределенными критериями идентификации и стабильности времени хранения.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После успешного выполнения протокола пользователи должны получить высококачественные наборы данных о взаимодействии, подходящие для последующего анализа dfPPI. Идентификация белка выполняется по данным DIA при 1% FDR (уровни PSM и белка), а количественная оценка использует исходные интенсивности или спектральные подсчеты MS/MS (не LFQ). Ожидаемые сигнатуры контроля качества включают: тесную кластеризацию технических репликатов по PCA, медиану CV предшественников/белков примерно 10-12%, иерархическую кластеризацию, обусловленную биологическим происхождением, а не репликацией, и надежное обогащение на уровне пути на g:Profiler/Reactome.

Генерация PU-шарикового зонда и проверка активности перед использованием

ПУ-гранулы получают путем связывания эпихапером-связывающего низкомолекулярного аналога с NHS-активируемой агарозой, как описано ранее25. Стандартная упаковка смолы объемом 25 мл дает ~25 мл полиуретановых гранул, хранящихся в соотношении 1:1 в изопропаноле. Аликвот в пробирки с низким уровнем связывания и хранить при температуре −20 °C, защищенном от света (например, завернуть в алюминиевую фольгу). В этих условиях партия остается стабильной в течение ≥12 месяцев. Перед применением удалите изопропанол и уравновесьте гранулы в нативном связывающем буфере (шаг 1.3). Каждую партию квалифицируют при синтезе и периодически в дальнейшем используют два анализа (рис. 2): (i) Биологическая специфичность – согласованные вытяжки из эпихаперома с высоким содержанием лизата (например, MDA-MB-468) и эпихаперома с низким содержанием лизата (например, ASPC1) в идентичных условиях (40 мкл суспензии из гранул с общим содержанием белка 250 мкг; 3 ч при 4 °C; нативные смывыва), элюирования/денатурации и иммуноблоттинга для HSP90, HSC70 и HOP. Принятие: сильное обогащение в образце эпихапером-высокого уровня с минимальным сигналом в низком образце; Отношение полосы к интенсивности сравнимо с эталонным участком (±20-30%). (ii) Параллельный захват профиля груза из эпихаперома с высоким содержанием лизата с полиуретановыми шариками в сравнении с соответствующими инертными контрольными шариками, загрузка равных объемов элюата в SDS-PAGE и окрашивание Кумасси. Приемка: Полиуретановые бусины показывают богатый, высокомолекулярный груз с минимальным фоном на полосе контрольных бортов. Партия объемом 25 мл поддерживает ~600 захватов по 40 мкл на образец; Часто отходят от эксплуатации, если специфика или профиль груза выходят за рамки приемлемости после повторной промывки/восстановления равновесия.

Репрезентативные результаты протоколов in-gel и on-bead

В пилотном сравнении клеток MDA-MB-468 с высоким эпихаперомом, рабочие процессы в геле и на гранулах производили высококонкордантные взаимодействия: 4616 из 6333 белков (73%) были общими на уровне белковых групп, при этом 1275 (20%) были обнаружены только с помощью внутригельного слоя и 442 (7%) только с помощью гранул. Согласие на уровне пути было еще выше: из 860 терминов Reactome 727 (85%) были общими, 81 (9%) — уникальными для in-gel и 52 (6%) — уникальными. Медианная интенсивность белка была на ~3× выше для in-gel, чем для in-bead, что согласуется с концентрацией геле-элюирования, но это существенно не влияло на конкорданцию пути.

Пример когортного масштаба и сигнатуры контроля качества

В качестве примера мы проанализировали двенадцать биологических образцов (рис. 3). Четыре образца были элюированы и обработаны путем разложения в геле; восемь образцов подвергались аффинной очистке эпихаперомных комплексов с последующим расщеплением на бусинах и нано-ЖХ-МС/МС в техническом дублиру. Наблюдались ожидаемые сигнатуры контроля качества: тесная кластеризация технических репликатов по PCA, медиана CV предшественников/белков ~10-12%, иерархическая кластеризация, обусловленная биологическим происхождением, а не репликацией, и надежное обогащение на уровне пути на g:Profiler/Reactome. Эти результаты иллюстрируют воспроизводимость компонентов рабочего процесса, широкое обнаружение белков, вовлеченных эпихаперомом, и четкую функциональную интерпретируемость дифференциальных интеракторов на уровне путей. Обогащение путей, полученных в обоих рабочих процессах, соответствовало нашим опубликованным результатам dfPPI для этой линии, подтвержденным несколькими биохимическими и функциональными ортогональными анализами17.

Качество исходного материала и разложения

Репрезентативный гель SDS-PAGE, окрашенный по методу Кумасси, показан для четырех образцов, обработанных методом разложения в геле (рис. 3A). Гель иллюстрирует воспроизводимый захват белка и последовательное распределение полос по полосам, подтверждая успешное обогащение белковых комплексов из нативных лизатов до масс-спектрометрии. Эти денатурированные интерактомные профили демонстрируют, что стадия аффинного захвата дает достаточный и стабильный ввод белка для последующего анализа МС.

Захваченные интерактомы демонстрируют широкий белковый охват по молекулярным массам, что отражает успешное обогащение белковых сборок из нативных лизатов. Важно отметить, что это восстановление не ограничивается обильными белками, а включает в себя интеракторы с меньшим количеством, что обеспечивает сложность и глубину, необходимые для анализа на системном уровне.

Элементы управления и специфичность в масштабе

В этом рабочем процессе мы используем контрольные валики только для предварительной очистки (см. шаги 1.3 и 1.4); Мы не проводим рутинных сравнительных захватов «инертным зондом» на каждом биообразце. Для больших клинических когорт инертные снимки потребляют ценный материал, но не имеют большой интерпретативной ценности для dfPPI, поскольку нисходящая статистика работает на уровне сети/пути, а не на уровне какого-либо отдельного белка. Случайные или липкие к смоле загрязнители не проявляются скоординированным образом в элементах одного и того же пути и, следовательно, не выдерживают тестов на обогащение на уровне пути или фильтров консистенции на уровне когорты. На практике специфичность обеспечивается (i) предварительной очисткой, (ii) точной воспроизводимостью репликации (PCA/CV) и (iii) стабильностью пути через пороговые значения и повторной дискретизацией. Исторически мы оценивали эксперименты с инертным захватом и растворимым конкурентом (PU-H71) и обнаружили, что они не изменяли исходы пути dfPPI16,17,21 при потреблении незаменимого клинического материала; Следовательно, мы оставляем их только для пилотной проверки. Для групп, предпочитающих явные проверки на уровне прогона, мы отмечаем, что оба варианта совместимы с протоколом, но не являются обязательными для анализа dfPPI в масштабе когорты.

Тиражируемое число

Вывод путей в dfPPI основан на множестве и не требует фиксированного номера репликации. При надежном сборе данных одна выборка для каждого условия может дать вызовы исследовательских путей. Для подтверждающих анализов мы рекомендуем ≥3 биологических репликации на одно состояние для культивируемых клеток (с дублированием инъекций ЖХ-МС/МС, когда это возможно) и соответствующие когорте N для тканей человека (обычно ≥5-10 на группу для обнаружения, больше при стратификации по ковариатам). Мы оцениваем стабильность с помощью кластеризации репликации (PCA), медианы CV предшественника (цель ~10-15%) и бутстрепа/повторной выборки результатов обогащения.

Техническая воспроизводимость при выполнении нескольких прогонов

Техническая воспроизводимость оценивалась с помощью анализа главных компонент (PCA) (рис. 3B) данных об интенсивности пептидов из расщепленных на бусинах образцов (восемь мозгов мышей, выполненных в двух экземплярах). Репликации плотно сгруппированы для каждого биологического образца, в то время как разные образцы четко разделены по первым двум основным компонентам. Первые два основных компонента объясняли 28,6% и 22,0% общей дисперсии соответственно и распределяли выборки в соответствии с биологическими различиями, а не техническим шумом. Эта структура отражает высокую аналитическую согласованность и подтверждает, что метод сохраняет биологически значимые различия, что имеет решающее значение для того, чтобы dfPPI мог обнаруживать переподключение сети по конкретному состоянию.

Согласованность обнаружения по образцам

Распределение коэффициентов вариации (CV) для интенсивностей ионов-предшественников показывает, что подавляющее большинство признаков находятся ниже 20% CV, при этом медианные значения варьируются от 9,7% до 11,9% в зависимости от условий (рисунок 3C). Эти результаты подтверждают последовательное обнаружение РС и восстановление пептидов во всех репликациях.

Динамический диапазон и покрытие протеома

Иерархическая кластеризация логарифмически преобразованных значений распространенности белка (рисунок 3D) показала сильное разделение образцов и сохранение вариаций между образцами, а также отразила широкий динамический диапазон, захваченный в прогонах MS. Интенсивность белка варьировалась от интеракторов с низким содержанием до высокообогащенных белковых групп, что визуализируется градиентом от синего до желтого. Данные подтверждают, что протокол позволяет обнаруживать различные белковые сборки и интеракторы, захватывая как ядро, так и периферические компоненты.

Функциональный перевод через dfPPI

Для поддержки интерпретации и воспроизводимости мы предоставляем два дополнительных ресурса для анализа набора данных dfPPI: (i) интерактивное веб-приложение Shiny (https://epichaperomics.mskcc.org/ обновлено до https://dfppi.mskcc.org) и (ii) открытые рабочие процессы с поддержкой сценариев и файлы сеансов Cytoscape, выпущенные с предыдущими исследованиями dfPPI (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. Приложение принимает необработанные таблицы интенсивности или спектрального подсчета MS/MS, выполняет контроль качества (кластеризация репликации, проверка пропущенных значений), необязательную обработку шума/пакетов (ковариатная регрессия), идентифицирует дифференциально вовлеченные белки и предоставляет показания путей/сети с помощью интерактивных графиков и загружаемых отчетов — без необходимости кодирования.

dfPPI рассматривает измеренную интенсивность или спектральные подсчеты в качестве прокси для «эпихаперомного взаимодействия». Пользователи выбирают модель дифференциальной связности (DC), варьирующуюся от простого двустороннего t-критерия (по умолчанию) до линейных моделей с поддержкой ковариаций; Шаг постоянного тока также можно пропустить. После DC пользователи устанавливают пороговые значения fold-change и p-значения (по умолчанию отражают предыдущую работу dfPPI; например, FC > 1.0, номинальный p ≤ 0.25) для передачи кандидатов на обогащение. Доступны два движка обогащения: ранговый GSEA (на основе знаковой статистики) и сверхпредставление (гипергеометрический) через g:Profiler с коррекцией множественного тестирования. Для контекста, ориентированного на шаперон, конвейер также предоставляет интерактомный анализ обогащения (iEA), чтобы проверить, являются ли прямые интеракторы шапероновых скаффолдных белков чрезмерно представленными среди дифференциально вовлеченных белков. Сеть просматривает весовые узлы/ребра по размеру эффекта и/или статистическому обеспечению, что позволяет визуализировать скоординированное перепрограммирование, а не эффекты одного белка. Для пользователей, предпочитающих скриптовые рабочие процессы, базовый код R и файлы сеансов Cytoscape, используемые для построения сетевых карт и рисунков, находятся в открытом доступе (например, GitHub/Zenodo)38,39,40,41 с соответствующими публикациями 17,18,19,20 и могут быть запущены локально или адаптированы для новых наборов данных.

Разрешающий отсечка (изменение при сворачивании > 1,0; номинальное p ≤ 0,25) рекомендуется для сохранения сигналов состояния взаимодействия, вносимых аффинным обогащением. Затем мы переносим статистический контроль на уровень путей: белки-кандидаты тестируются на обогащение по курируемым онтологиям (например, GO, Reactome) с помощью g:Profiler, а p-значения пути, скорректированные с помощью множественного тестирования, определяют значимость и ранжирование. Этот дизайн отражает цель dfPPI — обнаруживать скоординированную перестройку сети, а не дифференциальную экспрессию одного белка — и позволяет избежать нормализации на уровне протеома, которая может скрыть сигналы обогащения в наборах данных. Как показано в предыдущих исследованиях dfPPI 17,20, более мягкие пороговые значения уровня белка дают стабильные, релевантные для заболевания сигналы пути, в то время как другие модели (например, линейные модели с эмпирическим уменьшением по Байесу) могут быть использованы, когда дисперсия или пакетные ковариаты требуют этого, не изменяя основной вывод, ориентированный на путь.

Аффинный захват неизбежно обогащает «липкие» белки (например, кератины, цитоскелетные белки, рибосомные белки), а ПУ-гранулы могут также захватывать общие шапероновые интеракторы. В dfPPI они не влияют на биологию по нескольким причинам. Во-первых, предварительная очистка и строгая промывка удаляют большинство неспецифических связующих. Во-вторых, универсальные связующие устройства, в том числе многие шапероновые интеракторы, демонстрируют изменения кратности около 1,0 в разных условиях и/или несогласованном обнаружении и, таким образом, не проходят скрининг FC/p-значений. В-третьих, обогащение путей основано на множествах и учитывает фон: значимость вычисляется относительно обнаруженного в эксперименте протеома и требует совместного изменения нескольких членов одного и того же пути. Случайные или высокораспространенные загрязнители распределены по многим терминам и поэтому не образуют когерентных, значимых для FDR обогащений. Ни один белок — загрязнитель или что-то еще — не может «сделать» сигнал о пути. В-четвертых, dfPPI интерпретирует когерентность на сетевом уровне, а не отдельные белки; Вызовы путей должны выдержать коррекцию множественных тестов (например, скорректированные p-значения g:Profiler), минимальные размеры набора генов и согласованность репликации. Вместе с согласованными преклирами инертных гранул и фильтрацией общих загрязнителей эта структура делает dfPPI устойчивым к фону: даже если присутствуют сотни неинформативных белков, они не изменяют ранжирование путей, потому что обогащение зависит от количества конкордантных белков внутри пути, а не от общей длины списка белков. Более того, все опубликованные на сегодняшний день исследования dfPPI подтверждают прогнозы на уровне путей и сетей с обширной экспериментальной валидацией (например, целевая биохимия, считывание сигналов, генетические или фармакологические возмущения)16,17,18,19,20, демонстрируя, что выходные данные dfPPI являются не просто зашумленными списками белков, а воспроизводимыми картами дисфункции сети ИПП, связанной с заболеванием.

Чтобы оценить функциональный ландшафт, захваченный набором данных dfPPI из рисунка 3D, мы выполнили анализ обогащения с помощью g:Profiler42 (рисунок 3E). Результаты демонстрируют надежный охват аннотаций по всем основным функциональным онтологиям, включая биологический процесс Gene Ontology (GO-BP), молекулярную функцию (GO-MF) и клеточный компонент (GO-CC), а также курируемые ресурсы путей, такие как Reactome, KEGG и WikiPathways. Этот репрезентативный анализ иллюстрирует ключевое преимущество подхода dfPPI: его способность выявлять биологически значимые ассоциации путей в различных типах аннотаций, даже из относительно небольших размеров выборки. Наблюдаемый здесь широкий охват Reactome, вероятно, отражает тот факт, что dfPPI основан на перестройке белковых сетей на уровне взаимодействия, которая напрямую отражается на многокомпонентных процессах и сигнальных каскадах, которые хорошо представлены в структуре Reactome. Поскольку dfPPI использует изменения в связности, а не экспрессию, он особенно хорошо подходит для обнаружения функциональных сдвигов на системном уровне, которые могут быть пропущены транскриптомикой или протеомикой, основанной только на изобилии. Этот вывод согласуется с другими работами, в которых Reactome последовательно получал наиболее когерентные и связанные с заболеванием обогащения из наборов белков, полученных из dfPPI: 14,15,16,17,18,20,21.

Реактом организован вокруг многобелковых процессов и комплексов (каскады передачи сигналов, модули клеточного цикла, метаболические сборки). Поскольку dfPPI обогащает взаимодействующие с эпихапером, то есть группы белков, которые функционально корекрутируются в больничные каркасы, его выход, естественно, содержит модули когезивных путей, а не изолированные попадания. Этот скоординированный захват дает широкое, высокозначимое покрытие Reactome по связанным подпутям и иерархиям. Напротив, омиксы, ориентированные на изобилие (транскриптомика; глобальная протеомика), сообщают об изменениях экспрессии, а не о состояниях взаимодействия; AP-MS для одной приманки или бесконтактная маркировка обеспечивают местные районы вокруг одной инженерной приманки за раз; и сшивка/совместное фракционирование часто обеспечивают разреженную связность. Ни один из них, сам по себе, обычно не создает контекстно-отобранные наборы системного уровня, которые dfPPI возвращает из одного эндогенного захвата в клетках или тканях. В результате происходит обогащение путей, которое является одновременно широким (загораются множественные ветви Reactome) и механистически когерентным (белки смещаются вместе, потому что их взаимодействия, а не только их количество, перестраиваются эпихаперомами). Тем не менее, мы отмечаем, что dfPPI является дополнением, а не заменой: каждый метод интерактомики имеет свои сильные стороны и ограничения, и оптимальный выбор (или комбинация) должен определяться биологическим вопросом, ограничениями выборки и требуемым разрешением.

В совокупности эти результаты подтверждают, что протокол дает воспроизводимые, биологически информативные наборы данных, которые могут быть использованы для выявления дифференциального интерактомного ремоделирования при заболеваниях или экспериментальных возмущениях. Выходные данные dfPPI хорошо подходят для интеграции с фреймворками обогащения путей и позволяют отображать события функциональной перестройки, которые не могут быть обнаружены стандартными методами, основанными на изобилии.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор платформы dfPPI. (A) Платформа dfPPI (дисфункциональный белок-белковый интерактом) позволяет идентифицировать дисфункции сети ИПП, специфичные для конкретного заболевания, с помощью хемопротеомного рабочего процесса. Раздел 1 включает в себя подготовку образцов и интерактомный захват с использованием химических зондов, нацеленных на эпихапером, иммобилизованных на аффинных матрицах (например, PU-гранулах). В разделах 2 и 3 описаны два совместимых процесса разложения: на гранулах или в геле, за которыми следует ЖХ-МС/МС без меток для интерактомной идентификации. Вычислительный анализ, включая статистическое моделирование и обогащение путей, выполняется с использованием биоинформатического конвейера dfPPI, который не охвачен этим протоколом, но находится в свободном доступе по адресу https://epichaperomics.mskcc.org/. (B) Принцип dfPPI. В контекстах, связанных с заболеванием, эндогенные эпихаперомы образуют супрамолекулярные каркасы, которые реорганизуют сети ИПП. Эпихаперомные химические зонды (например, PU-шарики или их аналоги) захватывают эти каркасы вместе с их связанными интеракторами непосредственно из интактных клеток или из нативных лизатов, что приводит к многократному вытягиванию приманки в одном эксперименте. Согласованные элементы управления (например, контроль инертными шариками и/или конкуренция со свободным зондом) могут обрабатываться параллельно. Захваченный материал элюируется и расщепляется на бусине или в геле, анализируется с помощью LC-MS/MS, а белки количественно оцениваются (интенсивность или спектральные подсчеты MS/MS). Полученный интерактом используется для вычисления дифференциальных интеракторов в разных условиях и для выполнения обогащения пути/сети, выявляя контекстно-зависимую дисфункцию ИПП на системном уровне. Рабочий процесс не требует генетической маркировки или сверхэкспрессии, совместим как с клетками, так и с тканями, и масштабируется для когортных исследований. И наоборот, традиционная МС affinity-purification-MS сосредотачивается на одной помеченной приманке за раз, создавая локальное соседство для каждой конструкции и, как правило, требуя много конструкций/прогонов для отбора проб сети. В отличие от этого, dfPPI использует эндогенные эпихаперомы в качестве приманки, захватывая множество дисфункциональных ИПП одновременно из нативной системы, что ускоряет обнаружение перестройки сети, специфичной для конкретного заболевания, и обеспечивает считывание на уровне пути из одного захвата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Валидация партии PU-гранул и специфичность захвата. (A) Биологическая специфичность и согласованность от партии к партии. MDA-MB-468 (эпихапером-высокий) и ASPC1 (эпихапером-низкий) клетки лизировали в нативном буфере (20 мМ Трис, рН 7,4; 20 мМ KCl; 5 мМ MgCl2; 0,01% NP-40; ингибиторы протеазы/фосфатазы). Для каждого захвата 40 мкл суспензии из полиуретановых гранул инкубировали с 250 мкг общего белка (1 мкг/мкл) в течение 3 ч при 4 °C с вращением. Бусины промывались в родном буфере; комплексы денатурировали/элюировали в ~100 мкл буфера для проб SDS. 5-10 мкл каждого элюата растворяли с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттингом для HSP90, HSC70 и HOP. Входные лизаты приведены для справки. Две партии PU-гранул (Партия 1, свежая; Batch 2, aged (состаренные) дают сильное обогащение в MDA-MB-468 и минимальный сигнал в ASPC1, демонстрируя сохраненную специфичность и постоянство партии. (B) Глобальные грузы в сравнении с контрольными бусинами. Лизаты MDA-MB-468 обрабатывали так, как показано на рисунке (А), либо с помощью ПУ-гранул, либо согласованных контрольных шариков. Загружали ~20 мкл каждого элюата, разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали в Кумасси. Полиуретановые шарики восстанавливают сложный, высокомегаваттный груз, характерный для сборок, связанных с эпихапером, в то время как контрольные бусины имеют минимальный фон. Указываются молекулярно-весовые маркеры (кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Репрезентативные результаты аффинного захвата dfPPI, интерактомной идентификации и биоинформатического анализа. (A) Окрашенный в Кумасси гель SDS-PAGE белков, элюированных из аффинных захватов PU-гранул связанных с эпихаперомом интерактомов из четырех репрезентативных образцов человеческого мозга (PT1-PT4). Связанные с гранулами белковые сборки денатурировали кипячением в буфере для образцов SDS, разрешали с помощью SDS-PAGE и окрашивали для оценки восстановления интерактома по молекулярным массам. Каждая проба загружалась в отдельную полосу с пустой полосой между пробами для минимизации перекрестного загрязнения; Слабый сигнал, иногда наблюдаемый в этих пустых дорожках, отражает незначительное распространение образца во время электрофореза. Эти гели являются репрезентативными для образцов, представленных в центр MS, где каждая полоса была разделена на пять срезов для расщепления в геле и идентификации белка с помощью MS. (B) Анализ главных компонент (PCA) идентифицированных интенсивностей белка из интерактивомов эпихаперома на бисере из восьми репрезентативных образцов мозга мышей (выполненных в двух экземплярах) показывает тесную кластеризацию технических реплик и четкое биологическое разделение вдоль PC1 и PC2. Это подтверждает высокую техническую воспроизводимость и достаточную биологическую вариативность для надежного анализа dfPPI. Структура данных демонстрирует, что различия на уровне взаимодействия, а не технические артефакты, стимулируют разделение образцов, обеспечивая прочную основу для последующего дифференциального интерактомного моделирования без необходимости искусственной нормализации. (C) Распределения коэффициента вариации (CV) для интенсивностей ионов-предшественников в восьми группах выборки показывают стабильно низкую дисперсию, со средними значениями CV в диапазоне от 9,7% до 11,9% (обозначены вертикальными пунктирными линиями). Эти низкие CV подчеркивают воспроизводимость и надежность конвейера обнаружения и количественной оценки MS. Согласованность поддерживает использование исходных значений интенсивности или значений MS/MS в качестве надежных входных данных для анализа dfPPI, где дисперсия в силе взаимодействия, а не глобальная экспрессия белка, является биологическим сигналом, представляющим интерес. (D) Иерархическая кластерная тепловая карта логарифмически2-преобразованных значений интенсивности белка по всем образцам (с отображением технических дубликатов). Образцы кластеризуются по биологическому происхождению, а не реплицируются, что подтверждает надежный захват связанных с эпихаперомом интерактом и сохранение биологически значимой изменчивости. Широкий динамический диапазон и последовательное обнаружение белков дополнительно поддерживают качество набора данных для анализа dfPPI. Масштабная линейка представляет логарифмически 2-преобразованные значения интенсивности белка в диапазоне от 2 (синий, низкая численность) до 14 (желтый, высокая распространенность). (E) Манхэттенский график анализа обогащения путей, выполненный на дифференциально взаимодействующих белках, идентифицированных с помощью dfPPI. Обогащение проводилось с помощью g:Profiler, а значимые члены были построены по формуле −log10 (p-значение), раскрашены по источнику аннотации: GO Molecular Function (GO:MF), GO Biological Process (GO:BP), GO Cellular Component (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways и Human Phenotype Ontology (HP). Этот результат представляет собой основную полезность dfPPI: выявление биологически значимых функциональных путей, нарушенных в результате интерактомного ремоделирования, вызванного эпихаперомом. Широкий охват аннотаций подчеркивает понимание системного уровня, достижимое с помощью этого подхода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

МетодЧто он фиксируетОсновные сильные стороныКлючевые ограниченияТипичное использованиеМасштабируемость (когорты)
AP-MS (аффинити-очистка – MS)Прямые/почти прямые взаимодействия одной приманкиВысокая специфичность; количественный; Хорошо подходит для сложной композицииТребуется приманка/бирка/антитела; одна приманка за раз; может пропустить переходные/слабыеОпределение партнеров интересующего белкаНизкий–умеренный (требуется много приманок)
Бесконтактное мечение (например, варианты BioID/APEX)Белки в наноразмерной окрестности приманки с течением времениЗахватывает переходных/слабых соседей; работает в живых клеткахГенная инженерия; нецелевая маркировка; с большим количеством параметровКарты местных районов; динамикаНизкий–умеренный (инженерия на приманку)
XL-MS (сшивающий MS)Пространственная близость/контакты внутри/между белкамиСтруктурные ограничения; Захват переходных контактовКомплексный анализ; меньшая ширина протеома; Специфичный для конкретного образцаСтруктурная/контекстуальная топологияНизкий (специализированный)
Совместное фракционирование/МС (КФ-МС)Коэлюирование нативных сборокОтсутствие тегов; Нативные сборкиТрудоемкость; комплексный вывод; ограниченная чувствительностьГлобальный сложный ландшафтУмеренный
CETSA/TPPПрофили костабильности/коагрегацииБез этикеток; Естественные условияКосвенный для ИЦП; Ограничения по растворимостиЦелевое вовлечение; Тепловые сдвигиУмеренный
dfPPI (эпихаперомика)Перепрограммирование взаимодействий на сетевом уровне, захваченное эндогенными эпихаперомами в качестве мультиплексных приманокЭндогенный; отсутствие тегов; один захват допрашивает тысячи дисфункциональных ИПП; считывание путей/сети; тканесовместимость; Совместимость с когортамиПрименимо только к контексту заболевания; специализированные щупы (PU-шарики, YK5-B); Не предназначено для общего обнаружения сложныхРемоделирование интерактома в зависимости от заболевания, приоритизация путей развития, генерация гипотезВысокий (возможны сотни образцов)

Таблица 1: Сравнение подходов к картированию PPI и dfPPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Полные настройки параметров Spectronaut. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол позволяет картировать дисфункциональные ИПП в нативных биологических образцах с использованием платформы dfPPI. В отличие от традиционных методов, которые делают вывод о дисфункции на основе избытка или изменений экспрессии, эта платформа фиксирует перестройку сети на структурном уровне путем выделения специфических для заболевания интеракторов путем аффинной очистки с помощью зондов, нацеленных на эпихапером, с последующим количественным РС на основе интенсивности без меток. Несмотря на то, что в настоящее время основное внимание уделяется посмертной ткани мозга, этот метод широко применим к другим типам образцов и моделям заболеваний, включая культивируемые клетки и ткани из моделей рака, нейродегенерации и иммунной дисфункции 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI опирается на зонды, которые кинетически выбирают эпихаперомы и захватывают сборки с их связанными интеракторами. PU-гранулы (полученные из эпихапером-связывающих хемотипов, таких как PU-H71/PU-AD) взаимодействуют с HSP90-ядерными эпихаперомами нековалентно, но с длительным временем пребывания, что является отличительной чертой кинетической селективности для конформации эпихаперома по сравнению с обычными шапероновыми комплексами23. YK5-B представляет собой биотинилированный ковалентный зонд, направленный на HSC70 в эпихаперомах, что позволяет захватывать клетки до лизиса и сохранять эндогенные ИПП17. Селективность обусловлена связанными с заболеванием ПТМ, которые ремоделируют конформации HSP90/HSC70 и карманный химический состав и стабилизируют сборки эпихаперома 14,23,43,44; Эти изменения приводят к высокоаффинному, медленномусвязыванию k для нековалентных зондов45 типа PU (и позволяют осуществлять ковалентный захват с помощью HSC70-направленного YK5-B), тем самым кинетически сохраняя эпихаперомные комплексы и коизолируя их прямых и косвенных интеракторов для ЖХ-МС/МС. На практике полиуретановые шарики оптимальны для рабочих процессов лизата/гомогената, в то время как YK5-B поддерживает захват живых клеток; оба сохраняют контекстно-зависимые сборки, которые могут быть идентифицированы с помощью LC-MS/MS и использованы для нисходящего анализа dfPPI.

Для синтеза зондов захвата dfPPI требуются специализированные знания в области химии. Тем не менее, это требование не является уникальным для dfPPI: широко используемые методы PPI (AP-MS, бесконтактное мечение, XL-MS) также опираются на специализированные навыки, например, клонирование/разработку меченых приманок, создание стабильных клеточных линий, оптимизацию мечения/сшивания и сложные биоинформационные конвейеры. В отличие от этого, dfPPI позволяет избежать генетических манипуляций и сверхэкспрессии приманки, воздействует непосредственно на нативные клетки или ткани (включая дефицитные клинические биообразцы) и использует стандартные рабочие процессы аффинного захвата и LC-MS, которые уже рутинны в ядрах протеомики. Для снижения барьеров внедрения валидированные полиуретановые шарики и соответствующие контрольные бусины доступны через MTA из лаборатории Chiosis, а этапы обработки/контроля качества полностью описаны в шагах 1.3 и 1.4. Наконец, анализ поддерживается веб-приложением dfPPI, которое реализует необходимую статистику и считывание путей/сети, снижая нагрузку на биоинформатику (т.е. для пользователей без опыта программирования и только с базовыми навыками биоинформатики).

AP-MS, XL-MS, близкая маркировка, кофракционирование и CETSA/TPP отвечают на разные вопросы (прямые связующие вещества, пространственная близость, маркировка по соседству, совместная сборка или термическая костабильность). dfPPI является предпочтительным методом, когда целью является картирование эндогенных, зависящих от контекста перестроек при заболевании, особенно в нативных тканях или больших клинических когортах, где генетическое мечение неосуществимо, и когда желательно считывание на уровне пути/сети из одного захвата. dfPPI использует эпихаперомы в качестве мультиплексной приманки для фиксации скоординированных изменений взаимодействия между многими белками за одну вытягивание, что позволяет проводить масштабируемую идентификацию ЖХ-МС/МС и анализ, ориентированный на путь, из первичного материала. На практике dfPPI может засеивать вниз по течению, ориентированную на приманку валидацию (например, AP-MS на конкретных узлах), в то время как традиционные методы могут уточнять топологию (прямые контакты, пространственные ограничения) для комплексов, выделенных dfPPI. В таблице 1 приведено параллельное сравнение.

Несколько важных этапов влияют на успех рабочего процесса. Во-первых, необходимы высококачественные белковые экстракты. Это требует бережного обращения с тканями или клетками, в идеале замороженными и хранящимися при температуре -80 °C, чтобы свести к минимуму протеолиз и сохранить нативные комплексы. Включение ингибиторов протеазы и фосфатазы не подлежит обсуждению: целостность эпихапероза, которая выступает в качестве функциональной «приманки» в этом анализе, зависит от специфических посттрансляционных модификаций основных компонентов, таких как HSP9023,43. Например, фосфорилирование Ser226 и Ser255 имеет важное значение для стабилизации конформации эпихаперома и сохранения его скаффолдинговой функции23. Отказ от ингибиторов фосфатазы чреват структурным коллапсом и потерей биологической специфичности.

Еще одним ключевым фактором, определяющим фактор, является качество и обработка матрицы аффинности полиуретановых шариков. Шарики следует хранить в 100% изопропаноле при температуре -20 °C и использовать в течение определенного окна активности, в идеале в течение 1-2 лет. Активность должна быть подтверждена до проведения критических экспериментов, так как состаренные бусины могут демонстрировать сниженную связывающую способность или повышенное неспецифическое взаимодействие. Время инкубации и поступление белка также должны быть оптимизированы: чрезмерная инкубация может привести к повышению фона, в то время как недостаточное поступление белка может поставить под угрозу глубину обнаружения. Мы рекомендуем 3-часовую инкубацию и пилотные вытягивания для калибровки соответствующего входа для каждого типа образца.

С этим протоколом совместимы две стратегии пищеварения: на гранулах и в геле. Несмотря на то, что оба рабочих процесса дают воспроизводимые результаты, каждый из них предлагает компромиссы. Пищеварение в геле может привести к появлению загрязняющих веществ, таких как кератин, и требует дополнительных действий по обработке. Разложение на гранулах оптимизирует рабочий процесс и, как правило, предпочтительно в тех случаях, когда пропускная способность или количество поступающих образцов ограничены. Тем не менее, количество протеазы должно быть откалибровано на основе общего ввода белка: хотя метод рассчитан на 750 нг трипсина, при высоком уровне белка может произойти неполное переваривание, что приведет к пропущенному расщеплению и снижению восстановления пептидов. Рекомендуется оценить эффективность пищеварения и соответствующим образом скорректировать поступление ферментов. Все этапы разложения должны выполняться в пробирках с низким уровнем связывания с использованием свежеприготовленных реагентов, не содержащих загрязнений, чтобы обеспечить консистенцию и свести к минимуму фон.

Загрузка белка за одну инъекцию ЖХ-МС зависит от рабочего процесса захвата, выхода пептида и емкости колонки. Для расщепления на зернах, анализируемого на стандартных колонках nano-LC C18 (внутренний диаметр ~50-75 мкм, ~15-25 см), мы обычно загружаем 300-500 нг за впрыск; Мы не наблюдали прироста производительности выше ~400-500 нг, в то время как более высокие нагрузки могут привести к подавлению ионов и расширению пиков. Для рабочих процессов в геле (например, пять ломтиков на дорожку) мы обычно вводим ~25% обессоленного материала на срез на репликацию и оставляем ~50% в качестве резерва для повторного впрыска в случае необходимости. Во всех случаях измеряйте концентрацию пептидов перед инъекцией, проверяйте линейный отклик с помощью дайджеста контроля качества и настраивайте нагрузку таким образом, чтобы форма хроматографического пика и глубина идентификации сохранялись без перегрузки.

Количественное определение без меток с помощью DIA широко используется в протеомике благодаря своей воспроизводимости и глубине46. Тем не менее, в контексте экспериментов по захвату аффинности, подобных этому, где целью является идентификация белков, взаимодействующих с эпихаперомными скаффолдами, а не измерение глобальной численности, стратегии нормализации численности, такие как MaxLFQ, нецелесообразны. Эти подходы предполагают однородный вход и сходство на уровне протеома, которые нарушаются стадией обогащения, присущей этому протоколу. Вместо этого значения интенсивности или спектральные подсчеты МС/МС обеспечивают достаточную и биологически значимую количественную оценку для последующего функционального анализа. Эти метрики отражают относительную силу взаимодействия белков с эпихаперомами в разных условиях. Как было показано в предыдущих исследованиях 16,17,18,20, эти значения хорошо подходят для интерактомного анализа на системном уровне, такого как dfPPI, который идентифицирует измененные биологические пути без опоры на нормализацию в масштабах всего протеома. Сохраняя истинную биологическую изменчивость, вызванную заболеванием или лечением, количественная оценка интенсивности или МС/РС позволяет точно и надежно картировать дисфункции сети ИПП.

Несмотря на то, что аффинный захват уменьшает пространство поиска по сравнению с целым лизатом, вытягивающие данные dfPPI по-прежнему содержат от сотен до тысяч белков, охватывающих широкий динамический диапазон, а также сообогащенный фон. Для сравнения в масштабе когорт стохастический отбор предшественников DDA приводит к пропущенным значениям и переменной выборке интеракторов с низкой численностью18. DIA систематически фрагментирует все ионы в заранее заданных окнах, обеспечивая большую глубину, меньшее количество пропущенных значений и более высокие воспроизводимые свойства при каждом прохождении, которые имеют решающее значение, когда вывод ниже по потоку осуществляется на уровне пути/сети, а не на уровне одного белка. Вот почему мы стандартизируем DIA для dfPPI.

Как и во всех методах аффинного захвата, неспецифическое связывание с белками является неотъемлемым фактором. Белки могут сохраняться из-за липкости к смоле, высокой концентрации или агрегации. Несмотря на то, что такие неспецифические интеракторы могут присутствовать в нисходящем элюате, их присутствие не подрывает аналитическую цель данного протокола. Рабочий процесс dfPPI предназначен не для определения двоичных взаимодействий, а для извлечения шаблонов перестройки PPI на системном уровне. Анализ функционального обогащения выполняется на дифференциальных интеракторах и использует сетевую статистику для выявления скоординированных изменений на уровне путей. Как было показано в предыдущей работе17, этот системный подход сводит к минимуму влияние изолированных неспецифических белков и позволяет делать надежные биологические выводы на основе данных на уровне когорты.

По сравнению с традиционными подходами к интерактомному картированию, такими как ко-иммунопреципитация, близкая маркировка или сшивка, платформа dfPPI имеет явное преимущество: она фиксирует функциональное ремоделирование интерактома в условиях, связанных с заболеванием, не требуя разработки приманок или сверхэкспрессии. Поскольку метод изолирует белковые комплексы, образующиеся вокруг супрамолекулярных эпихапером, он обнаруживает возникающие белковые сборки, которые отсутствуют в здоровых системах, что позволяет обнаружить новые факторы заболеваний. Этот подход является масштабируемым и адаптируемым к различным тканям, видам и заболеваниям, и он уже позволил получить уникальное представление о ремоделировании протеома при раке и нейродегенерации. Таким образом, этот метод предлагает мощный инструмент для выявления функциональных сетей, нарушенных при заболевании человека.

Помимо приведенных здесь примеров, dfPPI имеет хорошие возможности для (i) больших клинических когорт для стратификации пациентов по дисфункции сети и для обнаружения фармакодинамических биомаркеров, которые сообщают о вовлечении мишени и коррекции пути; (ii) продольная выборка (например, до/после терапии, определение стадии заболевания) для отслеживания перестройки траекторий и прогнозирования ответивших факторов; (iii) интеграция с фосфопротеомикой и другими омиксами, учитывающими PTM, для увязки изменений состояния взаимодействия с восходящей сигнализацией; (iv) пространственно разрешенные захваты из микродиссектированных областей (интерфейсы опухоль-норма, субрегионы мозга) для картирования локальной сети патобиологии; (v) скрининги возмущений (генетические или комбинированные), где показания dfPPI указывают на действующие узлы и механизмы действия; и (vi) моделирование графов/искусственного интеллекта, которое изучает особенности сети, специфичные для заболевания, из карт dfPPI для прогнозирования и терапевтического дизайна. С методологической точки зрения, миниатюризация, автоматизация (например, 96-луночные форматы) и стандартизированный контроль качества позволят создать высокопроизводительные конвейеры для трансляционных исследований и клинических испытаний. Наконец, выходные данные dfPPI могут инициировать целевые последующие наблюдения — AP-MS, XL-MS или маркировку близости — для решения топологии приоритетных модулей, подчеркивая взаимодополняемость метода в наборе инструментов интерактомики.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мемориальный онкологический центр им. Слоуна-Кеттеринга (MSKCC) владеет интеллектуальными правами на портфель эпихапером. G.C., A.R., C.S.D. и S.S. являются изобретателями на лицензированной интеллектуальной собственности. Все остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH (R01 CA172546, U01 AG032969, P01 CA186866, R56 AG061869, R01 AG067598, R01 AG074004, R01 AG072599, R56 AG072599, RF1 AG071805, P30 CA008748, S10 RR027990) и г-ном Уильямом Х. и г-жой Элис Гудвин, а также Фондом Содружества по исследованию рака и Центром экспериментальной терапии MSKCC (G.C.). S.S. выражает благодарность за финансовую поддержку от BrightFocus Foundation (ID награды: A2022020F).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолСигма-ОлдричM6250Токсичный, взрывающийся
Acetonitrile (ACN) Optima Fisher Scientific A955-1Класс LC/MS (Горючий)
Активированная аффинная хроматографическая среда Affi-Gel 10Био-Рад1536099Используется для изготовления ПУ-бусинок и контроля бусинок (горючие)
Аммоний бикарбонат (ABC)Сигма-Олдрич09830-500G
Колонка Aurora Ultimate 25x75 C18 UHPLCIonOpticksAUR3-25075C18-CSI
Авторадиографическая плёнкаЮЭН-ПАРКЕР ИКС-РЭЙ КОРПEBA45Альтернатива для обнаружения хемилюминесцентных сигналов после западного блота
Биомашер микротканевой гомогенизаторDWK Life Sciences Кимбл7496250010Используется для гомогенизации замороженной мозговой ткани с целью экстракции белка
Бромофенол синийБиореагент FisherBP115-25
Центрифуга для трубок объёмом 1,5 млЭппендорф5424
Центрифуга для трубок объёмом 1,5 мл;Эппендорф5417RС контролем температуры
Центрифуга для трубок объемом 15-50 млЭппендорф5810RИспользуется для конических трубок
Система визуализации MP ChemiDocБио-Рад17001402Используется для гелевой/блот денситометрии
Колонная печьSonation GmBH, ГерманияES071/ES072Поддерживает колонку nanoLC при 50 и градусах; C — для стабильного удержания
Конические трубки (15 мл)Fisher Scientific352096
Контрольные бусиныЛаборатория по хиозуН/ДTaldone и др. (PMID:  21459002)
Морилка Coomassie G-250 (Bio-safe)Био-Рад1610786
Тёмные трубки Эппендорфа (1,5 мл)США Scientific1415-2507
Дитиотрейтол (DTT)Рош10197777001Раздражитель
Easy nLC 1000Термо Фишер СайентификEasy nLC 1000Система LC, используемая с Q Exactive HF
Диски для экстракции твердой фазы EmporeРота 3M2215-C18 (Октадециль)Используется для подготовки StageTips для обезсоли пептидами; Активировано 100% метанолом
Комплект для улучшенной хемилюминесценции (ECL)Термо Фишер Сайентифик32209
Трубки Эппендорфа (1,5 мл)Fisher Scientific05-408-129
Оптимация муравьиной кислоты (FA)  Fisher ScientificA117-10X1AMPLC/MS класса
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)BIIT Group — Тарту и Уумл; likoolhttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostОбогащение путей
ГлицеринБиореагент FisherBP229-1Степень молекулярной биологии
ГлицинБиореагент FisherBP381-5Кристаллический порошок
Козля антимышиный вторичный антитела, конъюгированный с HRP (RRID: AB_2619742)Sothern Biotech1030-05Вторичная для антитела к H90-10
Козьи антикроликовый вторичный антитела, конъюгированный с HRP (RRID: AB_2632593)Sothern Biotech4010-05Вторичная для HSP90 и альфа; и антитела к HOP
Козлиный анти-крыс с HRP-конъюгированным вторичным антителом (RRID: AB_2716837)Sothern Biotech3030-05Вторичная для антитела к HSC70
Нагреваемый орбитальный встряхивающийЭппендорфThermoMixer C (2231001127)
HeLa протеиновый дайджест стандарт-PierceТермо Фишер Сайентифик88329Используется для оценки качества качества LC-MS
Антитела к HOP (RRID: AB_10828378)Клеточная сигнализация5670Для контроля качества PU-шариков
Антитела к HSC70 (RRID: AB_10617277)ЭнцоSPA-815Для контроля качества PU-шариков
Антитела к HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)StressMarqSMC-107Для контроля качества PU-шариков
Альфа-антитела к HSP90 (RRID: AB_303423)AbcamAb2928Для нормализации согласно разделу 1.2
Человеческая клеточная линия: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)ATCCCRL-1682Линия контрольной клетки, эпичапером низкий/шаперон высокий
Человеческая клеточная линия: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)ATCCHTB-132Линия контрольной клетки, эпихапером/шаперон кайф
ImageJ (v1.54p)Уэйн Расбандhttps://imagej.net/ij/Денситометрия
Йодоацетамид (IAA)Сигма-ОлдричI1149-5GТоксичный
Микроцентрифугные трубки с низким содержанием белкаСарштедт72.706.600
Протеаза Lys-CPromega VA1170LC/MS класса
Хлорид магнияСигма-Олдрич63068Степень молекулярной биологии
MaxQuant (v2.1.1.0)Институт биохимии Макса Планкаhttps://www.maxquant.org/Рабочий процесс MaxDIA для идентификации пептидов/белков и количественной оценки интенсивности без маркировки
МетанолФишер КемикалA454-4Класс ВЭЖХ, горючий, токсичен
Мини-таблетка коктейля с ингибитором протеазы (в полном составе)Рош4693124001
Электрофоретическая трансферная клетка Mini Trans BlotБио-Рад1703930
Мини-гель электрофорезный резервуар, nbsp;Термо Фишер СайентификA25977Используется для сборных гелей Novex
Вертикальная электрофорезная клетка Mini-PROTEAN Tetra Био-Рад1658004Используется для Mini-PROTEAN Precast Protein Gels или гелей ручного отливки
Mini-PROTEAN  TGX Precast Protein Gels (4– 20%)Био-Рад4561094
NanoDropAgilentBioTek Synergy H1Используется для оценки концентрации пептида перед введением LC-MS
NanoElute 2Brukerhttps://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdfИспользуется в рабочем процессе diaPASEF
Источник Nanospray FlexТермо Фишер СайентификES071Для наноспреевого ESI-соединения
Новая цель: PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/PNew Objective Inc.PF360-75-10-N-5Упакован суспензией C18 длиной до 20 см
Мембрана нитроцеллюлозыЦитива Амершам10600006
Обезжиренное сухое молокоLab ScientificM0841
Сборные гели Novex с 8% Tris-GlycineТермо Фишер СайентификXP00080BOX
NP-40Рош11754599001
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Gibco10010023
Коктейль с ингибитором фосфатазы PhosSTOPРош4906837001
Белковый анализ Pierce BCAТермо Фишер Сайентифик23225
Пластиковые контейнерыFisher ScientificFB0875711A
Платформенный качалкаКорнинг6705
Хлорид калияБиореагент FisherBP366-1Белые кристаллы
Универсальный блок питания PowerPacБио-Рад1645070
Стандарт предварительно окрасленного белка Precision Plus Protein KaleidoscopeБио-Рад1610375
PU-бусиныЛаборатория по хиозуН/ДTaldone и др. (PMID:  21459002)
Эксактивный масс-спектрометр HF Orbitrap QТермо Фишер Сайентификhttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdfИспользуется для DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 и микро; mDr. Maisch GmbH, ГерманияR13.aqКремнеземные среды для разделения пептидов; Смесь порошка/метанола (1:3, v/v)
Вращательный блок (вращательный механизм с концом над концом)Barnstead  Международный400110
Патроны Sep-Pak C18 (100 мг)Корпорация УотерсWAT023590
Додецилсульфат натрия (SDS)Биореагент FisherBP166-500Класс электрофореза
СоникаторБрэнсон2510
SpectraMax Paradigm многорежимный микропластинчатый считывательМолекулярные устройстваПарадигма SpectraMax
SpectronautБиогнозииhttps://biognosys.com/software/spectronaut/Рабочий процесс directDIA
Концентратор SpeedVacThermo Fisher Scientific Savant SPD111V
Вакуум всасыванияКардинал ХелсCDL-65651-320
Масс-спектрометр TimsTOF HTBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.htmlИспользуется для анализа diaPASEF
Трифторацитовая кислота (TFA) OptimaСигма-ОлдричT6508-10AMPLC/MS класса (коррозийный, горючий)
ТрисБиореагент FisherBP152-5Кристаллический порошок; Степень молекулярной биологии
Трис, pH 6,8 (1 м)TeknovaT1068
Tris, pH 7,5 (1 М)Биореагент FisherBP1757-500Степень молекулярной биологии
Трис-буферный физиологический раствор (20x TBS)VWR, биологические науки97064-338
Гель-буфер Tris-Glycine-SDS (TGS 10x)Биореагент FisherBP13414Электрофорез
Trypsin PromegaV5111Степень секвенирования
Трипсин ГолдPromegaV5280
Tween 20Биореагент FisherBP337-100
МочевинаСигма-ОлдричU0631-500G
ВихрьFisher Scientific02-215-414
ВодаFisher ScientificW6-1Оценка LC/MS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, Z., Miller, D., Li, F., Liu, X., Levy, S. F. A large accessory protein interactome is rewired across environments. Elife. 9, e62365(2020).
  2. Omranian, S., Nikoloski, Z., Grimm, D. G. Computational identification of protein complexes from network interactions: Present state, challenges, and the way forward. Comput Struct Biotechnol J. 20, 2699-2712 (2022).
  3. Ginsberg, S. D., Sharma, S., Norton, L., Chiosis, G. Targeting stressor-induced dysfunctions in protein-protein interaction networks via epichaperomes. Trends Pharmacol Sci. 44 (1), 20-33 (2023).
  4. Nussinov, R. Pioneer in molecular biology: Conformational ensembles in molecular recognition, allostery, and cell function. J Mol Biol. 437 (11), 169044(2025).
  5. Lacoste, J., et al. Pervasive mislocalization of pathogenic coding variants underlying human disorders. Cell. 187 (23), 6725-6741.e13 (2024).
  6. Liu, X., Abad, L., Chatterjee, L., Cristea, I. M., Varjosalo, M. Mapping protein-protein interactions by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. , (2024).
  7. Luck, K., Sheynkman, G. M., Zhang, I., Vidal, M. Proteome-scale human interactomics. Trends Biochem Sci. 42 (5), 342-354 (2017).
  8. Greenblatt, J. F., Alberts, B. M., Krogan, N. J. Discovery and significance of protein-protein interactions in health and disease. Cell. 187 (23), 6501-6517 (2024).
  9. Gonzalez-Avendano, M., Lopez, J., Vergara-Jaque, A., Cerda, O. The power of computational proteomics platforms to decipher protein-protein interactions. Curr Opin Struct Biol. 88, 102882(2024).
  10. Komives, E. A., Chiosis, G. Editorial overview: Protein networks in health and disease. Curr Opin Struct Biol. 90, 102953(2025).
  11. Botticelli, L., et al. Chemical cross-linking and mass spectrometry enabled systems-level structural biology. Curr Opin Struct Biol. 87, 102872(2024).
  12. Chakrabarty, S., Wang, S., Roychowdhury, T., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. Introducing dysfunctional protein-protein interactome (dfppi) - a platform for systems-level protein-protein interaction (ppi) dysfunction investigation in disease. Curr Opin Struct Biol. 88, 102886(2024).
  13. Pasala, C., et al. Epichaperomes: Redefining chaperone biology and therapeutic strategies in complex diseases. RSC Chem Biol. 6 (5), 678-698 (2025).
  14. Chu, F., Sharma, S., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. PTMs as molecular encoders: Reprogramming chaperones into epichaperomes for network control in disease. Trends Biochem Sci. , (2025).
  15. Chiosis, G., Digwal, C. S., Trepel, J. B., Neckers, L. Structural and functional complexity of hsp90 in cellular homeostasis and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (11), 797-815 (2023).
  16. Rodina, A., et al. The epichaperome is an integrated chaperome network that facilitates tumour survival. Nature. 538 (7625), 397(2016).
  17. Rodina, A., et al. Systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation. Nat Commun. 14 (1), 26(2023).
  18. Inda, M. C., et al. The epichaperome is a mediator of toxic hippocampal stress and leads to protein connectivity-based dysfunction. Nat Commun. 11 (1), 19(2020).
  19. Joshi, S., et al. Pharmacologically controlling protein-protein interactions through epichaperomes for therapeutic vulnerability in cancer. Commun Biol. 4 (1), 20(2021).
  20. Bay, S., et al. Systems-level interactome mapping reveals actionable protein network dysregulation across the alzheimer's disease spectrum. Res Sq. , (2025).
  21. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by HSP90. Nat Chem Biol. 7 (11), 818-826 (2011).
  22. Kishinevsky, S., et al. Hsp90-incorporating chaperome networks as biosensor for disease-related pathways in patient-specific midbrain dopamine neurons. Nat Commun. 9, 15(2018).
  23. Roychowdhury, T., et al. Phosphorylation-driven epichaperome assembly is a regulator of cellular adaptability and proliferation. Nat Commun. 15 (1), 8912(2024).
  24. Roychowdhury, T., et al. Use of native-page for the identification of epichaperomes in cell lines. Methods Mol Biol. 2693, 175-191 (2023).
  25. Taldone, T., et al. synthesis, and evaluation of small molecule HSP90 probes. Bioorg Med Chem. 19 (8), 2603-2614 (2011).
  26. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  27. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  28. Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. Flashpack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Mol Cell Proteomics. 18 (2), 383-390 (2019).
  29. Sinitcyn, P., et al. Maxdia enables library-based and library-free data-independent acquisition proteomics. Nat Biotechnol. 39 (12), 1563-1573 (2021).
  30. DiscoveryLibraries. , The Max Planck Institute of Biochemistry. Available from: https://datashare.biochem.mpg.de/s/qe1IqcKbz2j2Ruf?dir=/DiscoveryLibraries (2025).
  31. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75 (3), 663-670 (2003).
  32. Meier, F., et al. Diapasef: Parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 17 (12), 1229-1236 (2020).
  33. Lou, R., et al. Benchmarking commonly used software suites and analysis workflows for dia proteomics and phosphoproteomics. Nat Commun. 14 (1), 94(2023).
  34. Demichev, V., et al. Dia-pasef data analysis using fragpipe and dia-nn for deep proteomics of low sample amounts. Nat Commun. 13 (1), 3944(2022).
  35. Wen, C., et al. Evaluation of DDA library-free strategies for phosphoproteomics and ubiquitinomics data-independent acquisition data. J Proteome Res. 22 (7), 2232-2245 (2023).
  36. Bowler-Barnett, E. H., et al. Uniprot and mass spectrometry-based proteomics-A 2-way working relationship. Mol Cell Proteomics. 22 (8), 100591(2023).
  37. Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. Dia-nn: Neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods. 17 (1), 41-44 (2020).
  38. Wang, T., Digwal, C. S., Alam, A., Chiosis, G. R. script epichaperomics - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation. Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7416220 (2022).
  39. Chaperomics_ad_2019. , Chiosislab. https://github.com/chiosislab/Chaperomics_AD_2019 (2019).
  40. Chaperomics_controllability_2020. , Chiosislab. https://github.com/chiosislab/Chaperomics_controllability_2020 (2019).
  41. Alam, A., Wang, T., Chiosis, G. Cytoscape files - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation [data set]. Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7433980 (2022).
  42. Kolberg, L., et al. G:Profiler-interoperable web service for functional enrichment analysis and gene identifier mapping (2023 update). Nucleic Acids Res. 51 (W1), W207-W212 (2023).
  43. Yan, P. R., et al. Molecular stressors engender protein connectivity dysfunction through aberrant n-glycosylation of a chaperone. Cell Reports. 31 (13), 27(2020).
  44. Castelli, M., et al. How aberrant n-glycosylation can alter protein functionality and ligand binding: An atomistic view. Structure. 31 (8), 987-1004.e8 (2023).
  45. Sharma, S., et al. Unraveling the mechanism of epichaperome modulation by zelavespib: Biochemical insights on target occupancy and extended residence time at the site of action. Biomedicines. 11 (10), 2599(2023).
  46. Guzman, U. H., et al. Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition. Nat Biotechnol. 42 (12), 1855-1866 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи