Мультилабораторная модель тромбоэмболического инсульта с тромболизом Сети доклинической оценки инсульта: TE-MCAo

Краткое содержание

Для имитации тромбоэмболического инсульта в среднюю артерию мозга вводились эмболы, приготовленные из гетерологичной крови крыс, после чего применялся системный тромболиз для реканализации. Эта версия модели оптимизирована для использования в многолабораторной сети и поддерживает тестирование нескольких кандидатов на терапию.

Аннотация

Современные трансляционные модели инсульта у грызунов индуцируют окклюзию средней церебральной артерии (MCAo) с помощью нейлоновых нитей, введённых эмболий, внутрилюминального тромбина или периваскулярного эндотелина-1 для имитации инсульта человека. Среди этих методов инъекция тромбоэмболи с последующим тромболизом лучше всего имитирует нейровоспалительные явления, наблюдаемые у пациентов, и может быть предпочтительнее наиболее широко используемого метода инертного нейлонового филамента. Однако стандартные тромбоэмболические модели, используемые в ведущих отдельных лабораториях, могут занимать много времени, давать переменные результаты и требовать значительных навыков для освоения. Для устранения этих ограничений мы разработали модель тромбоэмболического MCAo, которая нацелена на окклюзию сосудов и использует внутривенный тромболиз для достижения реканализации, параллельно системному тромболизу, применяемому в клинических случаях. Чтобы сократить количество животных, мы разработали метод хранения крови донорских животных для последующего приготовления эмболов для нескольких испытуемых. Использование готовых микрокатетеров Doccol упрощает подготовку и инъекцию тромба путём предварительной загрузки тромбоэмболов в микрокатетеры, которые затем вводятся во внутреннюю сонную артерию. Для достижения реканализации мы ввели внутривенно Тенектеплазу в дозе 1,5 мг/кг. Для повышения воспроизводимости мы подготовили и протестировали стандартные операционные процедуры, обучающие видео и практические хирургические мастер-классы. Модель использует стандартный хирургический подход, который должен быть знаком всем исследователям, использующим широко признанную модель нейлоновых филаментов. Прохождение микрокатетера в дистальную внутреннюю сонную артерию, избегая крылонебной артерии, осуществляется аналогично вставке нейлоновой нити. Восстановление и оценка после инсульта могут проводиться с использованием типичных поведенческих, рентгенографических и гистологических протоколов. Эта модель предлагает практичный, воспроизводимый и доступный подход для исследователей, ищущих тромбоэмболическую модель MCAo с контролируемой реканализацией.

Введение

Инсульт является одной из ведущих причин смерти и инвалидности во^{всём мире 1}. Многим пациентам помогает внутривенный тромболизис, а отобранные пациенты — механическая тромбэктомия. Поскольку не все пациенты прибывают в больницу вовремя для тромболизиса или тромбэктомии, а также не все пациенты получают полное выздоровление, сохраняется значительная необходимость в дальнейшей разработке дополнительных или дополнительных церебропротективных средств. Наиболее широко используемая модель ишемического инсульта у грызунов — это монофиламентная окклюзия средней церебральной артерии (МКА) с полной реперфузией. Эта модель моделирует окклюзию крупных сосудов (LVO), моделируя пациентов с крупными инсультами, успешно проходящих полную механическую тромбэктомию. Однако эта модель охватывает небольшой процент клинических инсультов. В отличие от этого, больше пациентов страдают от тромбоэмболических инсультов, вторичных после атеросклероза (разрыв атеросклеротической бляшки in situ или атеро-эмболии из-за системных заболеваний), и лечатся только системным тромболизом, который нейлоновая модель не может воспроизвести ^2,3. Кроме того, модель нейлонового филамента MCAo не имеет воспалительного каскада, характерного для тромботической^{окклюзии 4,5}. Животные модели, использующие тромбоэмболи, а затем системное введение тромболита, отражают патофизиологию и основную биологию, встречающиеся у многих пациентов с^{инсультом 4,6}. Однако на данный момент модели тромбоэмболического инсульта у грызунов известны своей сложностью и трудновоспроизведением. В изолированных лабораториях с выделенными экспертами тромбоэмболическая модель может быть достигнута с разумной воспроизводимостью. Такая модель не подходит для широкого распространения, как это необходимо в многолабораторных проектах.

Здесь мы предлагаем подробные протоколы для обновлённой и стандартизированной окклюзии тромбоэмболической средней церебральной артерии (TE-MCAo), за которой следует модель системного тромболиза. В частности, мы упростили подготовку тромба, стандартизировали загрузку тромба в катетеры и проверили масштабируемость этой модели для многолабораторных испытаний. Мы разработали эту модель для использования в Сети доклинической оценки инсульта (SPAN). Однако мы хотели, чтобы модель была полезна для любой сети, стремящейся реализовать масштабные доклинические сетевые испытания новых, подходящих методов лечения. Используя нашу стандартизированную модель, мы смогли индуцировать TE-MCAo у 6 крыс в день на каждом участке исследования в течение исследования.

SPAN и аналогичные сети выросли в ответ на повторяющиеся и продолжающиеся неудачи в переводе перспективных церебропротекторов из доклинической среды в успешные клинические^{практики 7}. В 2019 году Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (NINDS) инициировал^{SPAN 8}. SPAN стремится более эффективно отбирать потенциальные терапевтические препараты, минимизируя предвзятость с помощью централизованного маскирования, рандомизации и автоматизированного централизованного анализа результатов. SPAN 1 использовал модель нейлоновой филамента в первых двух версиях, потому что все участвующие лаборатории уже использовали её, и внедрение 9 было^{просто.} Для более точного моделирования многих аспектов тромбоэмболии и тромболиза, SPAN стремился создать модель TE-MCAo, описанную здесь. Эта модель будет полезна для доклинических хирургов, переходящих от модели нейлоновых филаментов к модели TE-MCAo. Мы рекомендуем в доклинических лабораториях подтвердить наличие инсульта через 24/48 часа после MCAo (или TE-MCAo) с помощью метода визуализации, например, магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Сеть SPAN была полностью описана в предыдущих^{исследованиях 9}, и все стандартные операционные процедуры (SOP) SPAN доступны на сайте SPAN. Вкратце, сеть управляется координационным центром (CC), который занимается распространением лекарств, контролем качества данных, проверкой соблюдения протоколов и сетевой коммуникацией. Все стандартные процедуры разрабатываются CC и утверждаются Руководящим комитетом после рассмотрения. В SPAN у всех грызунов по прибытии в исследовательские лаборатории установлен ушной бирка с штрих-кодом, совместимой с МРТ, а все участники регистрируются в базе данных SPAN Research Electronic Data Capture (REDCap). Животные рандомизируются CC с использованием таблиц рандомизации, стратифицированных по месту и полу. В SPAN 1 и SPAN 2 предполагаемые терапевтические препараты исследовались на эффективность в шести участвующих лабораториях. Все тестовые препараты упаковывались в идентичные флаконы, маркировались в координационном центре и отправлялись в исследовательские лаборатории в начале проекта.

Протокол

Все участвующие лаборатории SPAN, включая координационный центр USC, следовали рекомендациям NIH и AAALAC по гуманному и этичному обращению с животными. Одобрение местного IACUC было получено на всех объектах.

1. Подготовка тромба

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся кровь и тромб должны обрабатываться в соответствии со всеми местными институциональными рекомендациями по биологическим опасностям. Все материалы, контактирующие с кровью, должны быть либо утилизированы как биологически опасные отходы, либо, в случае хирургических инструментов, тщательно очищены и дезинфицированы автоклавом. Чтобы сократить использование животных-доноров крови в этом исследовании, мы разработали метод хранения донорской крови, а затем использования его для получения тромбоэмболи по мере необходимости.

1. Заберите свежую донорскую кровь из артерии в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл или детские микротрубки с эттилендиамином тетрауксусной кислотой (ЭДТА), заполняя только до уровня 500 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предпочитаем каннуляцию бедренной артерии для взятия крови, так как бедренная артерия имеет большой диаметр света, позволяющий катетеризацию, она двусторонняя, позволяющая делать два отдельных забора крови, и является переносливой операцией для грызунов. По нашему опыту, кровь может храниться при 4 °C в течение 4 недель.
2. Добавьте 1 мл раствора_CaCl2 (5 мг/мл) к 500 мкл хранящейся антикоагулянтой крови.
3. Сразу после обращения антикоагуляции_CaCl2 аспирировать кровь из трубки микроцентрифуги в 100-сантиметровую трубку PE-50 с помощью мягкого всасывания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка приведёт к свертыванию крови до того, как она сможет проникнуть в трубку PE-50.
4. Инкубировать скрученную трубку в предварительно подогретой фосфатно-буферной физиологической жидкости (PBS) при 37 °C в течение 2 часов в настольной духовке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установка чашки Петри на открытую горячую плиту приводит к непоследовательному результату из-за неравномерного распределения тепла.
5. По окончании двухчасовой инкубации немедленно переведите наполненную кровью трубку PE-50 до 4 °C для хранения. Она останется пригодной для использования на следующих этапах между 20 и 72 часами.

2. Загрузка катетера

1. Подключите свернутую трубку PE-50 (внутренний диаметр: 0,58 мм) к шприцу объемом 3 или 5 смл, наполненному физиологическим раствором, и аккуратно выпустите тромб в чашку Петри с PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребовать значительной силы. Уменьшите давление на месте соединения, чтобы катетер и шприц не отключились при экструзии. При необходимости катетер PE-50 можно разрезать на меньшие сегменты (10-50 см) для облегчения экструзии.
2. Резать срезы тромба длиной примерно 6 см лезвием бритвы.
3. Промыйте каждый сегмент тромба, аккуратно втянув его в катетер PE-50 и полностью выделяя 5 раз.
4. Затем промыйте тромб, аккуратно втянув его в катетер PE-10 (внутренний диаметр: 0,279 мм) и полностью выведите его 15 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если на этом этапе наблюдаются частые повреждения, рассмотрите возможность увеличения с помощью операционного микроскопа или хирургической лупы, чтобы убедиться, что тромб аспирируется по линии с отверстием катетера.
5. ПО ЖЕЛАНИЮ: Использование синего цвета Эвана для визуализации тромбов
   1. Приготовьте 4% Evan's Blue в 1x PBS-растворе.
   2. Добавьте 200 мкл 4% синего Эвана в чашку Петри, наполненную 10 мл 1x PBS. Это будет более концентрированный раствор = Синее разбавление Эвана #1.
   3. Возьмите 400 мкл Evan's Blue Diplification #1 и смешайте в отдельную чашку Петри, наполненную 20 мл 1x PBS. Это разбавленный раствор Эванс Блю = Эванс Синий Разбавление #2.
   4. Поместите сгусток в более концентрированный раствор чашки Evan's Blue (разбавление #1) на 1 секунду, а затем переложите в разбавленную чашку Evan's Blue (разбавление #2).
6. Погрузите один промытый тромб в готовые микрокатетеры (внутренний диаметр: 0,2 мм, внешний диаметр: 0,360 мм, длина: 300 мм, соединённый с женским замком Luer) без воздушного эмболу методом «мокрый-мокрый».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать увеличение (например, лупы 2,5x) для этого шага.
7. Когда тромб полностью загружен, экструдируйте достаточно тромба, чтобы в микрокатетере оставалось ровно 5,0 см. Обрежьте лишнее место лезвием бритвы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длина загруженного тромба может быть адаптирована под разные применения в зависимости от размера нужного удара.
8. Отметьте микрокатетер на расстоянии 16 мм от кончика, чтобы определить протяжённость катетера, который должен продвинуться внутри света за пределы бифуркации общей сонной артерии.

3. Хирургия и анестезия на животных

1. Индуцировать анестезию с 4% изофлураном в смеси кислород:оксид азота 30:70 и поддерживать анестезию с 1-2% изофлураном в той же газовой смеси.
2. Дайте обезболивающие карпрофен 5 мг/кг подкожно и атропин 0,05 мг/кг внутрибрюшинно для поддержания комфорта животного во время операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многие хирурги вводят в место разреза 1,0 мл бупивакаина (2,5 мг/мл).
3. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 ± 0,5 °C на протяжении всей операции с помощью грелки, контролируемой датчиком ректальной температуры.

4. Сбор донорской крови

1. Собирайте донорскую кровь с помощью катетеризации бедренной артерии. Сопоставьте биологический пол донора и реципиентов.
2. Если кровь должна быть использована в тот же день:
   1. Подготовьте три центрифугных трубки по 1,5 мл. Отметьте каждую трубку на отметке 500 мкл неизгладимой лабораторной ручкой.
   2. Подготовьте три комплекта трубок PE-50, каждая длиной 100 см, прикреплённых к шприцу объёмом 1,0 мл с помощью тупой игли 23 калибра.
3. Если для хранения для последующего использования, подготовьте шесть педиатрических микротрубок ЭДТА. Ослабьте крышки для удобства позже.
4. Подготовьте трубу PE-50 длиной 10,0 см, зажатую с одного конца резиновым зажимом и с тупым скошенным концом на другом конце.
   1. Чтобы сделать зажим с резиновой подковкой, вставьте одну тонкую часть стандартного гемостатического зажима в трубку PE-100 и накройте по размеру. Повторяйте на другой стороне.
   2. Чтобы сделать PE-50 тупым скошенным, сначала скройте конец под скошенным углом. Затем обрежьте самый кончик конической точки с помощью микроножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить острие, чтобы избежать прокола задней стенки артерии после установки, но если удалить слишком большую часть кончика, потеря эффекта скоса сильно затруднит установку катетера внутрисветово.
5. Проведите стандартный разрез бедренной артерии.
6. Подготовьте животное (побрить внутреннюю часть бедра), положите в спинное положение на операционном столе. Простерилизуйте кожу тремя промывками этанола 70%, затем одним промывкой бетадином или другим антисептическим раствором.
7. Закрепите задние лапы в разведённом положении с помощью мягких фиксаторов.
8. Сделайте вертикальный разрез на внутренней стороне бедра длиной примерно 1,5–2 см вдоль естественной складки пахового пересечения с ногой. Этот разрез будет ортогонален ожидаемому анатомическому ходу бедренной артерии.
9. С помощью тупой вскрытия аккуратно вскрытие до бедренных сосудов. Аккуратно отдельте бедренную артерию от вены и нерва, которые проходят в одном пучке.
10. Дистально перекройте бедренную артерию шелковой связкой 5-0 и используйте хвосты шва для небольшого натяжения дистально гемостатами.
11. Скелетизуйте бедренную артерию настолько проксимально, насколько это разрешено, прослеживая артерию до её ретроперитонеального происхождения. Свободно наместите петлю из 5-0 шёлка вокруг бедренной артерии и снова используйте хвосты, чтобы мягко напрягать проксимальный конец артерии. Не затягивайте шёлковый узел в этот момент. Это напряжение обеспечивает гемостаз после проведения артериотомии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Петлю можно сдвинуть дальше проксимально с помощью зажима для аневризмы.
12. Примерно на 2/3 расстояния от проксимальной петли шва положите кусок шелкового шва под артерию и сделайте небольшой артериотомический участок дистально от свободного шва с помощью микроножниц. Свободный шов будет закреплён для закрепления внутрилюминального катетера после канюляции.
13. Используя острые щипцы, поднимите верхнее отверстие артериотомии и введите тупое скошенный катетер в отверстие. Продвигайте катетер как можно ближе к нему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно трение между катетером и внутренней стенкой сосуда. Два способа могут помочь в этом: 1) покрытие внешней стороны конца катетера серозной жидкостью изнутри ножки непосредственно перед введением в сосуд, и 2) с помощью тупых щипцов с канавками одновременно удерживание внешней стороны сосуда, одновременно продвигая катетер. Это предотвращает продвижение сосуда вместе с катетером.
14. После того как кончик катетера будет продвинут почти до точки проксимальной петли, натяжение с хвостов этого шва освободите. Кровотечение следует предотвращать плотным расположением катетера внутри сосуда.
15. Продвините катетер настолько, чтобы ослабленная петля при затянии охватывала катетер. Аккуратно затягайте шов, чтобы шов не затянулся до степени, чтобы катетер не заблокировался. Также убедитесь, что шов не находится на скосе катетера, учитывая суженность этого сегмента.
16. Отпусти резиновый зажим. Катетер должен немедленно наполниться кровью.
17. Заполните открытые центрифугные трубки или педиатрические микротрубки EDTA, помещая не более 500 мкл в любой из контейнеров для сбора воздуха.
18. После заполнения микротрубок удалите катетер PE-50 из бедренной артерии, перевязывайте проксимальный конец и закройте разрез прерванным проленовым швом 5-0.
19. Если будет использована кровь позже, наместите крышки на заполненные детские ЭДТ-трубки и храните их при 4 °C.
20. Если тромб должен быть готов к использованию в тот же день, перейдите к шагу 1.2 выше.
21. Немедленно повторяйте с оставшимися центрифугными трубками.
22. Доноры артериальной крови могут быть возвращены в виварий после восстановления после анестезии, если была проведена односторонняя катетеризация. Противоположная бедренная артерия может быть катетеризована позже, но после двусторонней катетеризации бедренной артерии доноров следует эвтаназировать в соответствии с правилами IACUC.

5. TE-MCAo

ПРИМЕЧАНИЕ: Подход TE-MCAo использует стандартное сокращение общей сонной артерии. Выбор анестезии и метода снижения дозы зависят от пользователя. Протокол здесь начинается с того момента, когда хирург уже изолировал общую сонную артерию (ККА), внутреннюю сонную артерию (ИКА) и внешнюю сонную артерию (ЭКА).

1. Обнажите CCA и втяните с помощью шёлковой лигатуры 3-0. То же самое сделайте для ECA и ICA.
2. С помощью затылочной артерии обнажают и перекрывают затылочную артерию.
3. Обнажить и втянуть или перекрыть крылоподнебную артерию (ППА).
   ПРИМЕЧАНИЕ: С достаточным опытом этот шаг можно опустить. Мы рекомендуем всегда выполнять этот этап при изучении процедуры.
4. Используя мягкое втягивание, переведите ECA и ICA в конфигурацию «T».
5. Завязывайте лигатуру CCA только после выполнения всех вышеуказанных этапов.
6. Сделайте артериотомию в ECA (открытая методология Zea Longa^{CCA 10}) с помощью микроножниц.
7. Используя метод тупого скоса, описанный в шаге 4.4.2, подготовьте кончик одного из уже загруженных микрокатетеров (внутренний диаметр: 0,2 мм, внешний диаметр: 0,360 мм, длина: 300 мм, соединённый с внутренним замком Luer).
8. Аккуратно введите микрокатетер с заранее загруженным тромбом в ЭКА. Ослабьте ограничивающую петлю ICA и продвините микрокатетер внутрикраниально до 16 мм в области бифуркации сонной артерии под прямой визуализацией, чтобы избежать случайного каннулирования экстракраниальной ППА.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если катетер предпочитает входить в CCA, то мягкое давление с помощью аппликатора с острым хлопковым наконечником может помочь ориентировать катетер в ICA.
9. Закрепите внутрилюминальный микрокатетер на ICA и CCA с помощью шёлка 3-0, стараясь не затянуть слишком сильно.
10. Введите 20 мкл в шприц объёмом 1 мл с моторизованным насосом с частотой 10 мкл/мин в течение 2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно насос для шприца сначала не продвигается, пока давление не накопится достаточно.
11. Введите дополнительно 20 мкл стерильного физиологического раствора с использованием тех же настроек насоса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время изучения кровотока с помощью лазерной пятнистой визуализации мы обнаружили 100% успех при промывке на 20 мкл.
12. Удалите микрокатетер и навсегда перевязывайте ECA швом проксимально к месту артериотомии. Снимите все ограничивающие петли. Внимательно следите за утечками крови и при необходимости закрепляйте их дополнительными лигатурами.
13. Временно закройте кожный разрез скобками или непрерывным проленовым швом 5-0.
14. Выведите животное из анестезии и поместите его в тёплую клетку для восстановления.
15. Опционально: лаборатории могут использовать лазерную доплеровскую флоуметрию для подтверждения успешной окклюзии MCA. Альтернативно, магнитно-резонансная томография может быть проведена через 24 или 48 часов для подтверждения и количественной оценки инфаркта мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие пользователи предпочитают вводить 1,5 мл физиологического раствора или лактатированного раствора Рингера подкожно после операции.

6. Системный тромболиз

ПРИМЕЧАНИЕ: Тенектеплаза (TNK, 1,5 мг/мл) может быть приобретена для применения в системном тромболизисе. Пользователи могут предпочитать другие литические агенты. Отдельные флаконы по 50 мг восстанавливаются с 50 мл дистиллированной воды, а затем 2,5 мл аккуратно переливаются в флаконы по 3,0 мл. Аликвоты могут быть заморажены при -20 °C для последующего использования. Стабильность восстановленного рекомбинантного тканевого активатора плазминогена, хранящегося при -20 °C, составляет 60^{дней 11}.

1. Разморозьте по одному замороженной аликвоту TNK для каждого предмета. Разморозить при комнатной температуре около 15 минут.
2. Используя шприц объёмом 1 мл, возьмите ровно 1,5 мг/кг. Например, крысе весом 300 г потребуется 0,45 мг.
3. Повторно анестезируйте животное и удалите временное закрытие кожи.
4. Обнажите любую ветвь наружной яремной вены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хвостовая вена может использоваться, если лаборатория чувствует себя более комфортно с этим маршрутом. Мы предпочитали использовать яремную вену, так как хирурги SPAN более уверенно относятся к мобилизации наружной яремной вены, и это регулярно реализуется в нашей модели филамента.
5. Используя иглу на 30 или 32 G, вводите TNK прямым проколом в вену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала пользователи могут захотеть изолировать жилу между 3-0 шелковыми петлями. С практикой это не понадобится.
6. Закройте разрез прерванным проленом 5-0 или другим нерассасывающим швом.
7. Вернуть животное в клетку для восстановления, как в шаге 5.14.

7. Статистические методы

1. Для составления описательной статистики используйте среднее и стандартное отклонение для нормально распределённых числовых данных, а медианные и межквартильные диапазоны — для ненормально распределенных данных. Представлять категориальные данные в виде частотных распределений. Для проверки гипотез применяют t-тест или ANOVA по мере необходимости для нормально распределённых параметрических данных; В противном случае не проводите тестирование гипотез.

Результаты

Рисунок 1: Забор крови у донорских животных и подготовка тромба. Кровь была взята у донора через катетеризацию бедренной артерии и перенесена в микроцентрифугную трубку с (может храниться до 4 недель) или без ЭДТА (в тот же день). Для подготовки тромба в хранящиеся кровяные трубки добавляли раствор хлорида кальция и сразу же аспирировали в катетер PE-50. Скрученная трубка PE-50 инкубировала в предварительно нагретом фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) при 37°C в течение 2 часов в настольной печи. Через 2 часа наполненная кровью трубка PE-50 немедленно была переведена до 4°C для хранения. См. раздел 1 протокола для получения дополнительной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Загрузка тромба в катетер для инъекции. (A) В день операции MCAo тромб был выведен из трубки PE-50 в чашку Петри с PBS. (B) На чашке Петри тромб был обрезан до примерно 6 см в длину с помощью лезвия бритвы. (C) Тромб промывался PBS, втягивая его в трубку PE-50 и выталкивая 5 раз, а затем в трубу PE-10 15 раз. (D) Тромб был перемещён в чашку Петри с концентрированным раствором Эвана Блю. (E) Тромб был перемещён в чашку Петри с разбавленным раствором Эванс Блю и погружен в готовый микрокатетер. (F) Микрокатетер продвигался через внутреннюю сонную артерию крысы до тех пор, пока 16 мм от кончика катетера не прошли от бифуркации сонной артерии общей сонной артерии и не были введены с помощью моторизованного шприцового насоса. См. раздел 2 протокола для получения дополнительной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры. 

В пилотном технико-экономическом исследовании мы зарегистрировали 135 участников в 6 исследовательских лабораториях. Хотя участники были рандомизированы по одному из 8 методов лечения, здесь мы опубликуем агрегированные данные только для иллюстрации осуществимости модели. Из 135 зарегистрированных ТНК был назначен в правильной дозе и времени у 132 (98%). МРТ было проведено через 3 дня после TE-MCAo в 102 (75%) из-за гибели животных до сканирования в 33 (24%). Потеря животных до третьего дня была одинаковой во всех 6 лабораториях (Таблица 1), что указывает на то, что модель может быть внедрена на нескольких площадках. Средний размер поражений ± SD составлял 13 ± 16% (область поражения включает ишемию и отёк в процентах от ипсилатерального полушария) с некоторой вариативностью в разных лабораториях (Таблица 2). Репрезентативные изображения МРТ и посмертные эмболы можно увидеть на дополнительном рисунке 1.

	Лаборатория
Переменная	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Размер выборки (N)	23	30	11	28	24	19
МРТ выполнено	19	24	9	23	14	13

Таблица 1: Осуществимость лабораторных исследований. Лабораториями исследования были Университет Августы (AG), Дьюк (DK), Университет Айовы (IW), Массачусетская общая больница (MG), Университет Сан-Диего (SD) и Йельский университет (YL). Количество зарегистрированных животных (N) и число тех, кто выжил после МРТ, было проведено на третий день после инсульта. Эти данные подтверждают осуществимость модели.

Место	Размер выборки (N)	Объём поражения (%) Средний ± SD	Индекс сдвига по средней линии (%) Mean ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Таблица 2: Объём поражения, обнаруженных на МРТ на 3-й день, по местам. Для установления воспроизводимости модели на шести участках исследования сравнивались объём поражения (ишемия плюс отёк) и сдвиг средней линии. Объём поражения выражается в апоерационном проценте ипсилатерального полушария. Сдвиг средней линии выражается как линейный процент максимальной ширины внутричерепного пространства. Данные подтверждают гетерогенность между лабораториями.

Дополнительный рисунок 1: Репрезентативные изображения. (A-E) Различные мультиэхо, многосканированные (MEMS) изображения мозга крыс, сделанные через 48 часов после TE-MCAo. Срезы расположены примерно на 1 мм перед брегмой. (F-J) Несколько экземпляров эмболи, расположенных у истока MCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Обсуждение

Мы усовершенствовали модель ишемического инсульта у тромбоэмболических грызунов для использования в многолабораторной сети доклинических испытаний SPAN. Мы значительно сократили количество используемых животных, разработав метод хранения донорской крови для последующего использования. Мы также упростили подготовку тромбоэмболи и хирургический подход, чтобы облегчить проведение нескольких процедур MCAo за один день. Наша цель — чтобы TE-MCAo достигал такого же уровня комфорта пользователя и хирургических объёмов, как это возможно с широко используемой версией MCAo с нейлоновым филаментом. Для достижения этого результата мы провели два очных семинара по обучению хирургов, и все хирурги, участвовавшие в этом исследовании, уже имели несколько месяцев, если не лет, опыта работы с более стандартной моделью филамента. Мы продемонстрировали осуществимость в шести различных исследовательских лабораториях и продемонстрировали отличное соблюдение протокола.

При выборе реализации этого протокола исследователь должен учитывать следующие факторы, определяющие успех протокола. Во-первых, тщательная осторожность при сборе крови повлияет на успешное формирование тромба. Необходимо собирать артериальную, а не венозную, кровь, чтобы избежать преждевременного свертывания. Во-вторых, важно собирать больше крови, чем кажется необходимым. Иногда один экземпляр не тромбоза за ночь, а остальные — да. В-третьих, мы настоятельно рекомендуем делать загрузку катетера с помощью оптического увеличения — либо хирургических луп с налобным фонарём, либо с увеличением линзы с освещением. В-четвёртых, осторожная и тщательная диссекция CCA, ICA и ECA необходима для предотвращения разрывов и внутрисосудистого тромбоза. Также важно визуализировать PPA, чтобы катетер для доставки правильно попал в ICA. В-пятых, редко наблюдается побочный эффект у грызунов из-за инъекции тромболитиков. В наших исследованиях после инъекции TNK не было выявлено побочных эффектов, таких как ангиоотез или периферическое кровотечение. Это не значит, что это невозможно, но нам не известно о системных побочных эффектах тромболитиков у грызунов. Исследователю, решившему впервые применить этот протокол, вполне может посоветоваться с одним из соавторов, так как персонализированное обучение оказалось очень полезным.

При выборе модели заболевания на животных для тестирования кандидатных терапий важно точно представить популяцию пациентов, для которых предназначен препарат. Фокальные ишемические модели инсульта включают фототромботические модели Rose Bengal, окклюзию кортикальной пиальной артерии и стереотаксическую инъекцию эндотелина-1 13,14,15. Эти модели имеют преимущество в создании высоковоспроизводимых поражений в предсказуемых областях коры. Это преимущество делает их предпочтительными для изучения клеточных механизмов или для корреляции расположения поражения с поведенческими исходами. Дополнительная стоимость, сложность и отсутствие реперфузионного компонента делают их менее полезными для скрининга на наркотики.

MCAo с внутрилюминационным монофиламентом или тромбоэмболией являются проверенными моделями выбора для окклюзии крупных сосудов (LVO⁾10,16,17. Модель монофиламента с кремниевым покрытием простая в выполнении и широко используется. Хотя расположение и размер поражения менее предсказуемы, в масштабных тестах на лекарства эта гетерогенность рассматривается как преимущество, поскольку инсульты у людей также довольно ^{разнородны.} Недостатком метода монофиламента является биологическая инертность окклюзии. У пациентов тромби и тромболизис вызывают воспалительные каскады, связанные с высвобождением тромбина, плазминогена и других тромбных^{элементов} 20,21,22. Чтобы преодолеть это ограничение, многие предложили модели тромбоэмболии в исследованиях кроликов, свиней, собак и нечеловеческих^{приматов} 23,24,25,26,27. Эти исследования сложны и требуют специализированной экспертизы в целом. Тем не менее, мы стремились адаптировать тромбоэмболическую модель для использования в нашей многолабораторной, доклинической сети испытаний. Это потребовало упрощения подготовки тромбоэмболи, оптимизации хирургического подхода и значительного сокращения количества необходимых животных. Мы разработали тромбоэмболическую модель TE-MCAo, которую можно было успешно внедрять в шести различных лабораториях при отличном соблюдении протокола (Таблица 1) и достаточно стабильном размере поражения (Таблица 2). Пропускная способность была достаточной, в среднем 6 предметов в неделю.

Существует несколько шагов по устранению неполадок, которые могут стать полезными. Недостаток тромбоза в крови является самым частым источником сбоя протокола и чаще всего связан с загрязнением катетера препарата ЭДТА или гепарином, если он установлен на операционном столе. Мы рекомендуем тщательно применять технику сбора коллекции. Мы также рекомендуем готовить раствор хлорида кальция, используемый для инактивации ЭДТА, свежим каждую неделю или раз в две недели. После выделения тромба из катетера бывает сложно разрезать тромб на необходимые фрагменты диаметром 5 см. Некоторые тромбы хрупкие и легко ломаются. Мы рекомендуем готовить тромбы с помощью оптического увеличения, а в крайних случаях переходить к другому донорскому тромбу. Аспирация и элюция тромбов требуют умеренного уровня мастерства; Поэтому мы рекомендуем довольно длительный период обучения. Убедитесь, что кончик аспирационного катетера свободен от зацепок с помощью оптического увеличения. Тромби могут быть заклинены в имплантационном катетере — мы рекомендуем мягкое чередование аспирации и элуции. Для хирургов, опытных с типичной моделью филамента MCAo, идентификация PPA может стать новым шагом. Мы настоятельно рекомендуем маркировать тромби синим цветом Эвана, чтобы катетер можно было отслеживать и отслеживать по мере его подъёма по ICA. Бифуркация ICA/PPA может быть легко обнаружена тщательной, глубокой диссекцией после ICA, и она надёжно расположена глубоко до тонкой ветви внутреннего сонного нерва.

Этот протокол имеет некоторые ограничения. Для проведения канюляции сонных артерий грызунов необходим элемент хирургического мастерства. Однако это также верно и для модели филамента. Работа с тромбами в крови также требует хирургического мастерства. Как и во всех тромбоэмболических моделях, уровень успешного инфаркта ниже по сравнению с моделью нити. Если цель исследования — более частые случаи инфаркта, предпочтительнее будет модель филамента. С другой стороны, если цель — репликация тромба и тромболиза, то такая модель желательна.

Эта модель предназначена для тестирования кандидатов на церебральные протекторы с использованием модели, которая точно использует тромб и тромболиз. Будущие направления могут включать также исследования адъювантной терапии, направленной на феномен отсутствия рефлоута. Многие предлагают для этой цели антикоагулянты и антитромбоцитарные препараты.

В заключение, представленный здесь протокол TE-MCAo адаптирован для разработки в нескольких лабораториях. Мы упростили подготовку тромбов и упростили хирургический подход. Мы разработали метод хранения донорской крови, значительно сократив количество необходимых животных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл шприц	BD	309628
10 луп
Шприц объёмом 1 куб. см	Тэрумо	SS-01T
23 г тупой иглы	Грейнджер	5FVK7
Шприц 3,0 куб. см	BD	309656
Шёлковая лигатура 3-0
Игла 30 г	BD	305128
5-0 проленовый шов	Ethicon	8698	Чтобы закрыть кожный порез
5-0 шёлковой лигатуры	Ethicon	A182
Зажим для аневризмы
Сульфат атропина	Vet One	NDC86136-006-10	Уменьшить бронхиальные секреции
Щипцы с тупыми канавками
Бупивакаин	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Местные анестетики
Хлорид кальция	Sigma	C7902
Карпрофен	Zoetis Inc	NADA #141-199	Анальгетик
Центрифугные трубки	Эппендорф	22364111	Для сбора крови
Этанол	Koptec	UN1170
Эван' s Blue	Sigma	E2129
Грелка	Аппаратура Гарварда	K021-435
Гемостатический зажим
Изофлуран	Vet One	NDC13985-528-60
Made By Me Ultimate Weaving петли	Группы горизонта	Не применимо	Мягкие фиксаторы
Микроножницы	F.S.T.	15000-00
Микрокатетеры	Корпорация Doccol	PE-FL-360-200-300	Сборные инъекционные катетеры
Катетер PE-10	BD	427401
Труба PE-100	Интрамедик	7426
Трубка PE-50	BD	427410
Детские ЭДТ-трубки	BD Microtainer	K2E-363706	Храните донорскую кровь
Чашка Петри	Эппендорф	30702115
Фосфатный буферный физиологический раствор	Фишер	B2438
Превантика	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Антисептик
Ватная палочка	VWR	89031-288
Лезвие бритвы	AccuTec Pro	71960
Физиологический раствор	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Ножницы	F.S.T.	14958-11
Острые щипцы
Шприцовый насос	New Era Pumps Inc.	BS-300
Настольная духовка	Бёкель	132000
Tenecteplase (TNK)	Genentech, Сан-Франциско	NDC50242-120-47	тромболиз
Бирка для ушей	RapID Lab, Сан-Франциско, Калифорния;	Теги RapID