Практический подход к генетического картирования Судьба индуцибельной: Путеводитель по Марку и Трек Клетки В Vivo

Карты развития создаются путем маркировки и отслеживания клеток in vivo, чтобы определить, как клетки-предшественники формируют специфические структуры и типы клеток в развивающихся и взрослых тканях. Развитием этой концепции является генетически индуцируемое картирование развития (GIFM), которое связывает экспрессию генов с поведением клеток in vivo для создания карт развития на основе генетических линий. Здравствуйте, меня зовут Дебора Эллисор, я представляю лабораторию Марка и кафедру молекулярной, клеточной и биохимической биологии Университета Брауна.

Сегодня мои коллеги Эшли Браун, Лиз Норман, Нин Хаген, Стив Браун и я продемонстрируем процедуру генетического картирования судьбы клеток с использованием индуцибельных систем. Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения раннего развития мозга. Данный метод также может быть применен в исследованиях по инактивации генов и при создании моделей заболеваний человека на животных.

Итак, приступим. В эмбрионах X cre, E-R-M-G-F-P MGFP LAE представляет собой репортерный аллель, присутствующий во всех клетках, которые обозначены серыми овалами. В X cre, er, где X обозначает генные регуляторные элементы, экспрессия C ER пространственно ограничена доменом экспрессии гена X, показанным синим цветом, а белок CRE ER удерживается в цитоплазме белком HSP 90.

В отсутствие тамоксифена репортер будет неактивен. Введение тамоксифена приводит к картированию судьбы клеток в домене X, поскольку CER высвобождается из HSP 90, транслоцируется в ядро и удаляет стоп-кассету из репортерного аллеля. Постоянная и наследуемая рекомбинация обеспечивает конститутивную экспрессию MG FP LA Z в клетках. Сочетание репортерного аллеля CER и тамоксифена позволяет осуществлять маркировку следующим образом: когда популяция клеток изначально маркируется в примордиальном отделе мозга эмбриона на основе экспрессии генов, эти клетки с картированной судьбой отслеживаются даже после того, как первоначальная экспрессия генов, стимулирующая CER, прекращается.

Таким образом, в организме взрослой особи можно определить конечное распределение и терминальную судьбу генетически определенной клеточной линии. Данная процедура начинается с приготовления стокового раствора тамоксифена в концентрации 20 мг/мл: растворите 200 мг тамоксифена в 10 мл предварительно подогретого кукурузного масла в стеклянном флаконе для ингаляций.

Затем инкубируйте раствор при 37 °C в течение двух часов на вортексе Tator. Приготовленный стоковый раствор тамоксифена следует периодически защищать от света, обернув флакон фольгой, и хранить при 4 °C. Срок годности стокового раствора составляет до одного месяца.

Для экспериментов по картированию клеточных линий сформируйте репродуктивную пару, состоящую из самки линии Swiss Webster дикого типа и самца, несущего как ген-специфичный аллель CreER, так и репортерный аллель. Для данной демонстрации мы будем использовать самца win to one CreER MG FP. Каждое утро проверяйте самку Swiss Webster на наличие вагинальной пробки.

Считайте утро дня обнаружения вагинальной пробки как 0,5 дня после коитуса и рассчитайте дату введения Тамоксифена. Исходя из этой отправной точки в данном эксперименте, Тамоксифен будет введен на 8,5 эмбриональный день. С помощью одномиллилитрового шприца с иглой для кормления животных наберите 200 µL стокового раствора Тамоксифена.

Надежно зафиксируйте беременную самку мыши линии Swiss Webster с установленным сроком беременности, захватив ее за загривок и спину, чтобы обездвижить голову, и переверните мышь брюшной стороной вверх. Удерживайте хвост свободными пальцами, чтобы тело оставалось в выпрямленном положении. Затем введите зонд для кормления в угол рта и осторожно направляйте его параллельно небу до тех пор, пока кончик зонда не окажется примерно на уровне глаза.

Осторожно отклоните голову назад, чтобы обеспечить доступ к пищеводу. Проведите иглу мимо надгортанника вниз по пищеводу в сторону желудка. Будьте осторожны, чтобы не попасть в трахею.

После того как игла для кормления окажется в желудке, введите тамоксифен и извлеките иглу. Затем верните самку в домашнюю клетку до даты диссекции. В день диссекции эмбрионы стадии E 12.5 из беременной самки с точно определенным сроком беременности извлекают и оценивают на наличие GFP-маркировки.

В эмбрионе, положительном по GFP, мы наблюдаем, что нейроны, производные от wind one, вносят вклад в формирование среднего мозга, ромбенцефалона и спинного мозга. Репортер MG FP маркирует аксональные проекции, которые также можно увидеть, перенеся GFP-положительных эмбрионов целиком на чашку Петри с PPS и сфотографировав их с помощью picture frame. После фотографирования эмбрионов с помощью пинцета отщипните небольшой фрагмент хвоста от каждого эмбриона и поместите каждый фрагмент в ПЦР-пробирку. Ткани будут генотипированы с помощью ПЦР на оба аллеля для подтверждения результатов, полученных в ходе анализа целых эмбрионов.

Следующие процедуры позволяют проанализировать, как меченые клетки, полученные из эмбриональных областей, заселяют мозг взрослого животного перед началом краниотомии. Убедитесь с помощью щипка за пальца ноги, что мышь полностью находится под воздействием небутала. Выполните разрезы для получения доступа к сердцу через грудную клетку.

Затем введите бабочкообразную иглу в верхушку или левый желудочек сердца и зафиксируйте ее с помощью С-образного зажима. С помощью ножниц создайте отверстие для оттока жидкости в правом предсердии, затем проведите перфузию 10–15 миллилитрами ледяного физиологического раствора до тех пор, пока вытекающая жидкость не станет прозрачной. После этого введите 20–25 миллилитров 4% параформальдегида.

После завершения внутрисердечной перфузии удалите голову с помощью ножниц, перерезав позвоночник сразу над плечами. Проведите скальпелем по срединной линии спины головы в ростральном направлении, чтобы разрезать кожу и обнажить череп. С помощью скальпеля счистите излишки тканей или мышц по боковой и задней поверхности черепа.

С помощью пинцета проколите череп по срединной линии, чуть ростральнее обонятельных луковиц, чтобы создать небольшое отверстие для кончиков тонких ножниц. Вставьте тонкие ножницы в это отверстие и сделайте два билатеральных надреза от срединной линии вдоль обонятельных луковиц. Этот разрез приведет к разлому черепа на стыке носовой и лобной костей, что обеспечит удобный доступ для ножниц.

Разрежьте череп вдоль сагиттальных швов, следя за тем, чтобы кончики ножниц были направлены в сторону от мозга, чтобы избежать повреждения подлежащих тканей. Затем осторожно захватите череп пинцетом и отслоите кость вдоль медиального разреза, чтобы обнажить мозг. Череп может скалываться маленькими кусочками или отламываться более крупными фрагментами.

Продолжайте использовать пинцет, чтобы удалить все лобно-теменные, межтеменные и затылочные кости. Освободите параокулярии, расположенные вдоль латеральных краев мозга на уровне мозжечка, осторожно сжимая сферические кости с каждой стороны. С помощью ножниц аккуратно вырежьте дорсальную часть кости, окружающую ствол мозга.

Вставьте одну сторону ножниц непосредственно под дорсальный край кости, начиная от места разреза спинного мозга и двигаясь в направлении мозжечка. Это необходимо для высвобождения ствола мозга и мозжечка. С помощью пинцета удалите остатки кости вокруг ствола мозга.

Осторожно раздвиньте кости, переверните голову спинной стороной вниз и с помощью пинцета перережьте черепные нервы, чтобы извлечь мозг из черепа. Поместите мозг в чашку Петри со льдом. Холодный PPS. Оцените наличие GFP-маркировки в мозге взрослой особи с помощью флуоресцентного диссекционного микроскопа и сфотографируйте результат с использованием рамки для снимков.

В данном примере средний мозг маркирован GFP; помимо использования для анализа клеточных линий в ходе эмбриогенеза и у взрослых особей, GIFM может сочетаться с другими методами, широко применяемыми в биологии развития, такими как микродиссекция и эксперименты с эксплантатами тканей. Например, вентральный отдел среднего мозга является зоной прогениторов развивающихся дофаминергических нейронов, экспрессирующих ген wind one. Таким образом, выделение вентрального отдела среднего мозга с помощью микродиссекции позволяет создать условия in vitro для дальнейшего изучения его развития.

Это лишь один из примеров использования GIFM для изоляции интересующей зоны предшественников, определенной на основе генетического анализа. Чтобы начать эту процедуру, с помощью тонких ножниц перенесите ранее идентифицированные GFP-положительные эмбрионы в стерильный ледяной PBS в чашку для культивирования клеток. Удалите головную часть эмбриона, выполнив поперечный разрез.

Затем удалите ростральную часть головы, сделав корональный разрез через цефалон. Это обнажит трубчатую структуру, в которой четвертый желудочек через мезоцефальный пузырь образует канал между дорсальными и вентральными тканями. Осторожно введите кончики ножниц в четвертый желудочек и сделайте разрез вдоль дорсальной срединной линии в ростральном направлении, полностью раскрыв трубку и создав препарат по принципу «открытой книги».

Теперь будет обеспечен медиальный доступ к вентральной части среднего мозга. В то время как две дорсальные половины среднего мозга будут располагаться латерально, может потребоваться удалить любые оставшиеся ненейронные ткани под вентральной частью среднего мозга. Чтобы эксплантат лежал плоско, он должен сейчас напоминать бабочку, в которой дорсальный средний мозг представляет собой крылья, а тромбомер 1 — хвост.

Для дальнейшей изоляции вентрального среднего мозга с целью проведения факс-анализа или экспериментов по культивированию клеток удалите латеральные области ткани. Теперь мы представим репрезентативные результаты GIFM. В данном эксперименте визуализируются экспрессирующие WNT1 клетки, маркированные к E 8.5, чтобы определить, как клетки, экспрессирующие WNT1, участвуют в формировании нейронных структур в процессе развития.

Например, эмбрионы C EER MG FP на стадии E 12.5 демонстрируют флуоресценцию GFP преимущественно в среднем мозге, задней части ромбоэнцефалона и спинном мозге; при большом увеличении видны тонкие нейронные проекции, инервирующие средний мозг, стенку тела, конечности и краниофациальную область. Маркированные клетки также могут быть визуализированы и проанализированы на клеточном уровне с помощью иммуногистохимии. Как показано на данном оптическом срезе толщиной 1 мкм эмбриона на стадии E 12.5, маркированного тамоксифеном на стадии E 8.5, окрашивание антителами к ядерной бета-галактозидазе (красный цвет) и антителами к GFP (зеленый цвет) указывает на клетки с картированным путем развития в вентральной части среднего мозга.

В данном случае клетки являются двойными положительными из-за особенностей условного репортера MGFP во взрослом мозге. Плотность зрелой ткани может маскировать флуоресценцию GFP, исходящую из внутренних структур мозга. Таким образом, флуоресцентная микроскопия целого препарата выявляет лишь слабую флуоресценцию GFP в верхней части CUI взрослого организма при оценке победы.

Одна линия клеток, маркированная на стадии E 8.5, на срезах взрослых особей при микроскопии с малым увеличением показывает, что линия WNT1 дает начало структурам среднего мозга, включая верхние и нижние холмики. На этом изображении с большим увеличением, полученном из вентральной части среднего мозга в области дофаминергических нейронов, видны клетки, положительные по бета-каталину, и густое сплетение GFP-положительных аксонов; напротив, маркирование на стадии E 9.5 приводит к существенному мечению GFP, которое легко наблюдается в нижних холмиках среднего мозга при флуоресцентной микроскопии целого препарата. Линия WNT1, маркированная на стадии E 9.5, на срезах взрослых особей сосредоточена в нижних холмиках, что видно при микроскопии с малым увеличением.

На этом снимке с большим увеличением, полученном из вентральной части среднего мозга, видны дофаминергические нейроны, клетки, положительные по ядерному бета-гелю, и развитое сплетение GFP-положительных аксонов. Таким образом, в то время как нейроны, полученные из Win-1, отмеченные на стадиях E 8.5 по сравнению с E 9.5, постепенно утрачивают способность участвовать в формировании дорсальной части среднего мозга, линия Win-1 продолжает участвовать в формировании вентральной части среднего мозга.

Мы только что продемонстрировали процедуру генетического индуцибельного картирования судьбы клеток для маркировки и отслеживания клеточных линий in vivo. Это позволяет нам маркировать клетки на основе их генетической линии и отслеживать их с течением времени даже после прекращения экспрессии гена. При введении тамоксифена на восьмом с половиной сроке мы показали, что домен wit 1 вносит вклад в развитие среднего мозга, помимо всего среднего мозга у взрослого организма.

Напротив, введение тамоксифена на девятом с половиной сроке, когда область экспрессии Wnt1 становится ограниченной, приводит к более ограниченному вкладу в развитие среднего мозга в ходе эмбриогенеза, что сохраняется и во взрослом состоянии. При выполнении этой процедуры важно учитывать, что система маркирует клетки мозаично, и поэтому не каждая клетка в конкретной структуре может быть меченой. Вероятно, это связано с линией CRE er или используемым условным репортерным аллелем.

Важно отметить, что, несмотря на мозаичность маркировки клеток, паттерн и распределение маркированных клеток высоковоспроизводимы. Мы обнаружили, что введение тамоксифена путем перорального зондирования является более предпочтительным по сравнению с внутрибрюшинным введением, поскольку это сводит к минимуму воспаление в брюшной полости, а также механические повреждения эмбрионов. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.