JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Практический подход к генетического картирования Судьба индуцибельной: Путеводитель по Марку и Трек Клетки В Vivo

Full Text

17,086 Views

13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Генетические индуцибельной Судьба картирования (GIFM) знаки и треков клеток с тонкой пространственной и временной контроль

Transcript

Карты судьбы генерируются путем маркировки и отслеживания клеток in vivo, чтобы определить, какой вклад предшественники вносят в конкретные структуры и типы клеток в развивающихся и взрослых тканях. И прогрессом в этой концепции является генетическое индуцируемое картирование судьбы или GIFM, связывающее экспрессию генов сульфата и поведение клеток in vivo для создания карт судьбы на основе генетической родословной. Здравствуйте, меня зовут Дебора Эллисор из лаборатории Марка Сервисиза и кафедры молекулярной биологии, клеточной биологии и биохимии в Университете Брауна.

Сегодня мои коллеги Эшли Браун, Лиз Норман Нин Хаген, Стив Браун и я продемонстрируем процедуру генетического индуцируемого картирования судеб. Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения раннего развития мозга. Мы также можем применить этот метод к исследованиям инактивации генов и животным моделям заболеваний человека.

Итак, давайте начнем В X cre, E-R-M-G-F-P эмбрионах. MGFP LAE — репортерный аллель, присутствующий во всех клетках, представленный серыми овалами X cre, er, где X представляет регуляторные элементы генов. Контроль экспрессии C ER пространственно ограничен доменом экспрессии гена X, показанным синим цветом, а белок CRE ER секвестрируется в цитоплазме с помощью HSP 90.

При отсутствии тамоксифена репортер будет выключен. Введение тамоксифена приводит к картированию судьбы клеток в домене X, поскольку CER высвобождается из HSP 90, транслоцируется в ядро и удаляет стоп-кассету из аллеля репортера. Постоянная и наследственная рекомбинация гарантирует, что клетки конституционально экспрессируют MG FP LA Z. Комбинация репортерного аллеля CER и тамоксифена приводит к маркировке, когда клеточная популяция первоначально помечена в первичной области мозга эмбриона на основе экспрессии генов, эти картированные клетки отслеживаются даже после того, как первоначальная экспрессия генов, используемая для управления CER, гаснет.

Таким образом. Окончательное распределение и конечная судьба генетически определенной клеточной линии могут быть идентифицированы у взрослого человека. Эта процедура начинается с приготовления раствора тамоксифена в соотношении 20 мг на миллилитр стебля: растворите 200 мг тамоксифена в 10 миллилитрах довоенного кукурузного масла в стеклянном флаконе для ингаляций.

Затем инкубируйте раствор при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов на вихре Tator. Раствор периодически защищают приготовленный стоковый раствор Тамоксифена от света, обернув флакон фольгой и храня при температуре четыре градуса Цельсия. Запас можно использовать до одного месяца.

Для экспериментов по картированию судеб создайте размножающуюся пару, состоящую из самки дикого типа Swiss Webster и самца, несущих как ген-специфичный аллель CreER, так и репортерный аллель. Для целей этой демонстрации мы будем использовать выигрыш для одного самца CreER MG FP. Каждое утро проверяйте швейцарку Webster на наличие вагинальной пробки.

Обозначьте утро дня вагинальной пробки как 0,5 дня после введения тамоксифена, и рассчитайте дату введения тамоксифена. Исходя из этой отправной точки в данном эксперименте, тамоксифен будет введен на эмбриональный день 8,5. С помощью одномиллилитрового шприца с иглой для кормления животных наберите 200 микролитров раствора для стеблей Тамоксифена.

Крепко зафиксируйте беременную суку швейцарского Вебстера, взявшись за затылок за шею и спину, чтобы обездвижить голову и перевернуть мышь так, чтобы брюшная сторона была обращена вверх. Держите хвост между свободными пальцами, чтобы тело держалось на прямой линии. Затем поместите иглу для кормления в уголок рта и аккуратно направляйте иглу параллельно нёбу до тех пор, пока кончик иглы для кормления не окажется примерно в положении глаза.

Аккуратно откиньте голову назад, чтобы получить доступ к пищеводу. Проведите иглу мимо надгортанника вниз по пищеводу к желудку. Будьте осторожны, чтобы не попасть в трахею.

Как только питательная игла окажется в желудке, введите тамоксифен и удалите иглу. Затем верните самку в ее домашнюю клетку до даты вскрытия. В день вскрытия эмбрионы E 12.5 от беременной самки свободно рассекаются, а затем оцениваются на маркировку GFP.

У GFP-положительного эмбриона мы наблюдаем, что нейроны, производные от одного из них, вносят свой вклад в средний мозг, задний мозг и спинной мозг. Репортер MG FP маркирует аксональные проекции, которые также можно увидеть: перенос эмбрионов с GFP-положительным путем домашнего монтажа в чашку Петри, содержащую PPS, и фотографирование их с помощью фоторамки После того, как эмбрионы были сфотографированы, с помощью щипцов отщипните небольшой кусочек хвоста от каждого эмбриона и поместите каждый кусочек в пробирку для ПЦР. Ткани будут генотипированы с помощью ПЦР для обоих аллелей, чтобы подтвердить результаты, полученные с помощью анализа всей монтировки.

Следующие процедуры позволяют нам проанализировать, как помеченные клетки, полученные из эмбриональных областей, заселяют мозг взрослого человека до начала трепанации черепа. Подтверждено ущипыванием пальца ноги, что мышь полностью внушена. Пациенты с нембуталом выполняют разрезы, чтобы получить доступ к сердцу через грудную клетку.

Затем поместите иглу-бабочку в верхушку или левый желудочек сердца и закрепите зажимом C. Создайте с помощью ножниц место выхода жидкости в правом предсердии, затем профузьте 10-15 миллилитров ледяного физиологического раствора, пока жидкость не станет прозрачной. Далее следует от 20 до 25 миллилитров 4%-ного параформного альдегида.

Когда внутрисердечная пропитка будет завершена, удалите голову ножницами, разрезав позвоночный столб чуть выше плеч. Проведите скальпелем по дорсальной средней линии головы, ростраль де коттль, чтобы разрезать кожу головы и обнажить S череп. С помощью скальпеля соскребите лишнюю ткань или мышцу вдоль боковой и задней части черепа.

С помощью щипцов проколите череп по средней линии, просто рострально к обонятельным луковицам и создайте небольшое отверстие для размещения кончиков тонких ножниц. Вставьте в это отверстие тонкие ножницы и сделайте два двусторонних разреза от средней линии по длине обонятельных луковиц. Этот разрез сломает череп на пересечении носовой кости и лобной кости и обеспечит хороший доступ для ножниц.

Разрежьте вдоль сагиттальных швов в черепе, стараясь держать кончики ножниц под углом от мозга, чтобы не повредить подлежащие ткани. Затем аккуратно обхватите череп щипцами и отклейте кость вдоль медиального разреза, чтобы обнажить мозг. Череп может откалываться небольшими частями или откалываться более крупными частями.

Продолжайте с помощью щипцов удалить все лобные теменные, межтеменные и затылочные кости. Освободите para oculi, расположенные вдоль боковых краев мозга на уровне мозжечка, аккуратно защипнув сферические кости с каждой стороны. С помощью ножниц аккуратно разрежьте тыльную часть кости, которая окружает ствол мозга.

Вставьте одну сторону ножниц прямо под тыльный край кости, начиная с того места, где был разрезан спинной мозг, и продолжая по направлению к мозжечку. Освободить ствол мозга и мозжечок. Удалите оставшуюся кость вокруг ствола мозга с помощью щипцов.

Аккуратно оторвите кости, поверните голову спинной стороной вниз и с помощью щипцов перережьте черепные нервы и освободите мозг от черепа. Поместите мозг в чашку Петри со льдом. Холодный PPS Оцените мозг взрослого человека на предмет маркировки GFP с помощью флуоресцентного препарирующего эндоскопа и сфотографируйте с помощью фоторамки.

В этом примере средний мозг помечен GFP в дополнение к его использованию для анализа родословной во время эмбриогенеза, а у взрослых GIFM может быть объединен с другими приложениями, обычно используемыми в биологии развития, такими как микродиссекция и эксперименты по эксплантации тканей. Например, вентральный мезенцефалон является зоной-предшественником для развития дофаминовых нейронов, экспрессирующих ген ветра. Таким образом, выделение вентрального мезенцефалона с помощью микродиссекции позволяет установить условия in vitro для дальнейшего исследования его развития.

Это лишь один из примеров использования GIFM для выделения зоны интереса предшественника, определенной генетической историей. Чтобы начать эту процедуру, перенесите ранее идентифицированные GFP-положительные эмбрионы в ледяную стерильную PBS в чашке для клеточных культур с помощью тонких ножниц. Удалите головную часть эмбриона, разрезав поперек избалованного до ромми.

Одним из следующих удаляем ростральную часть головы с коронковым разрезом через головной мозг. При этом обнажается трубчатая структура, в которой четвертый желудочек через мезоцефальный везикул образует канал между дорсальной и вентральной тканями. Осторожно введите кончики ножниц в четвертый желудочек и отрежьте вдоль дорсальной средней линии избалованную до ростраль полностью открывая трубку, создавая открытую книгу подготовки.

Теперь вентральный мезенцефалон будет обнажен медиально. В то время как две дорсальные половины мезенцефалона будут располагаться латерально, может потребоваться удаление любой оставшейся ненервной ткани под вентральным мезенцефалоном. Для того чтобы эксплан лежал ровно, он должен теперь напоминать бабочку, у которой спинной мозг представляет крылья, а тромбо — только хвост.

Чтобы дополнительно изолировать вентральный мезенцефалон для факсимильного анализа или экспериментов с клеточными культурами, удалите боковые стороны ткани. Теперь мы покажем некоторые репрезентативные результаты GIFM. В этом эксперименте визуализируются клетки, экспрессирующие WINT one, помеченные как E 8.5, чтобы определить, какой вклад прямые клетки WINT One вносят в нейронные структуры на протяжении всего развития.

Например, у одного эмбриона C EER MG FP при E 12,5 флуоресценция GFP проявляется преимущественно в среднем мозге, задней части заднего мозга и спинном мозге при большом увеличении, при этом наблюдаются иннервирующие проекции тонких нейронов. Помеченные клетки стенки среднего мозга, тела, конечностей и черепно-лицевой области также могут быть визуализированы и проанализированы на клеточном уровне с помощью иммуногистохимии. Как показано на этом оптическом срезе эмбриона E 12.5 толщиной в один микрометр, помеченного введением тамоксифена в ядерном точке E 8.5, мечение бета-галактоантител красным цветом и мечение антител GFP зеленым цветом указывает на судьбу картированных клеток, показанных в вентральном среднем мозге.

Здесь мы объединили клетки с двойным положительным результатом из-за природы условного репортера MGFP в мозге взрослого человека. Плотность зрелой ткани может скрывать флуоресценцию GFP, исходящую от внутренних структур мозга. Таким образом, флуоресцентная микроскопия всего монта выявляет лишь слабую флуоресценцию GFP в верхнем CUI взрослого человека, оценивающего победу.

Одна линия, отмеченная на уровне E 8.5 на срезах взрослого человека с помощью микроскопии с малым увеличением, показывает, что WIN one line дает начало структурам среднего мозга, включая верхнюю и нижнюю cui. На этом изображении с большим увеличением, полученном из вентрального среднего мозга в непосредственной близости от дофаминергических нейронов, можно увидеть ядерные бета-кал-положительные клетки и богатое GFP-положительное аксональное сплетение, при этом можно увидеть контрастную маркировку при E 9,5, что приводит к существенной маркировке GFP, которая легко наблюдается в нижней части среднего мозга при всей флуоресценции. Линия WINT one, отмеченная на уровне E 9,5 на срезах взрослых, сосредоточена в нижней части каулу, что видно при микроскопии с малым увеличением.

На этом изображении с большим увеличением, полученном из вентрального среднего мозга в дофаминергических нейронах, можно увидеть ядерные бета-гель-положительные клетки и богатое GFP-положительное аксональное сплетение. Таким образом, в то время как производные нейроны, помеченные как E 8.5 по сравнению с E 9.5, постепенно ограничиваются от участия в дорсальном среднем мозге. Линия WIN one продолжает вносить свой вклад в вентральный средний мозг.

Мы только что показали вам процедуру генетического индуцируемого картирования судьбы для маркировки и отслеживания клеточных линий in vivo. Это позволяет нам маркировать клетки на основе их генетической линии и отслеживать их с течением времени даже после того, как экспрессия генов была подавлена. С помощью тамоксифена, введенного в восемь с половиной лет, мы показали, что одна область остроты вносит свой вклад в развитие среднего мозга в дополнение ко всему среднему мозгу у взрослого человека.

Напротив, введение тамоксифена в 9 с половиной дозах, когда ум в одной области становится ограниченным, приводит к более ограниченному вкладу в развитие среднего мозга во время эмбриогенеза, который сохраняется и у взрослого человека. При выполнении этой процедуры важно учитывать, что система маркирует клетки мозаично, и поэтому не каждая клетка в определенной структуре может быть помечена. Вероятно, это связано с используемой линией CRE er или условным репортерным аллелем.

Важно отметить, что, несмотря на то, что маркировка клеток является мозаичной, структура и распределение марочных клеток хорошо воспроизводимы. Мы обнаружили, что введение тамоксифена через полость рта является более предпочтительным по сравнению с введением через межбрюшинную инъекцию, поскольку оно сводит к минимуму воспаление в межбрюшинном пространстве, а также механическое повреждение эмбрионов. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

Explore More Videos

Биология развития выпуск 34 нервной системы генетика генетического картирования судьба индуцибельной (GIFM) иммунной мышь эмбрион GIFM родословная трассирующими судьба отображение