RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Общая цель данной процедуры заключается в подавлении экспрессии эндогенных генов путем инъекции двухцепочечной РНК в эмбрионы дрозофилы для идентификации генов, необходимых для развития органов. Это достигается путем предварительного сбора эмбрионов и их выравнивания в одну линию. Затем подготавливаются иглы, которые используются для введения двухцепочечной РНК в эмбрионы.

В завершение эмбрионы помещают в увлажненную камеру для развития. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие дефекты слияния трахеальных ветвей drosophila, с помощью окрашивания антителами эмбрионов на поздних стадиях развития или путем наблюдения за личинками под светлопольным микроскопом. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как прямой генетический скрининг для идентификации генов, необходимых для развития органов, является то, что это относительно простой и быстрый метод обратной генетики для анализа функций генов до появления соответствующего мутанта.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, например, при идентификации критически важных генов, необходимых для развития трахеальной системы D. Это отличная модель для изучения морфогенеза органов млекопитающих, таких как дыхательные пути позвоночных, сердечно-сосудистая система, почечные протоки и исследуемый эпителий. Как правило, новичкам в этом методе бывает трудно, так как требуется время для освоения таких навыков, как выравнивание эмбрионов, отламывание игл и инъекция нитей РНК в эмбрионы.

Визуальная демонстрация этого метода имеет критическое значение, поскольку количество вводимой двухцепочечной РНК варьируется в зависимости от эмбриона, а текстовое описание внешнего вида эмбрионов на стадии синцитиального бластодерма может быть недостаточно наглядным. Эти этапы сложно освоить, так как введение подходящего количества двухцепочечной РНК в эмбрионы на стадии синцитиального бластодерма является критически важным шагом для эффективного нокдауна экспрессии эндогенных генов.

Для начала подготовьте клетки при температуре 25 °C, используя мух W 1 1 1 8 в возрасте от двух до четырех дней; меняйте среды с виноградным соком каждый час в течение дня, чтобы синхронизировать сбор яиц в течение одного-двух дней. Перед сбором соберите эмбрионы на стадии синцития или бластердермы в течение одного часа при температуре 25 °C на прямоугольный фрагмент агара с виноградным соком, затем аккуратно прорежьте лезвием линию посередине агара.

С помощью металлического зонда перенесите эмбрионы с чашки с виноградным соком на фрагмент агара с виноградным соком. Расположите около 50 эмбрионов в одну линию так, чтобы их длинные оси были направлены под углом 45 градусов к линии по центру агара. Убедитесь, что все эмбрионы ориентированы в одном направлении, а их задние концы направлены в сторону от линии.

Отрежьте прямоугольный кусочек двустороннего скотча и приклейте его на покровное стекло размером 18 на 18 миллиметров. С помощью скотча на покровном стекле захватите эмбрионы. Поместите покровное стекло на предметное стекло.

Слегка прижмите эмбрионы к двустороннему скотчу и дайте им высохнуть на воздухе в течение примерно 10 минут. Покройте эмбрионы тонким слоем галокарбонового масла 700. Подождите около 10 минут, пока эмбрионы не станут прозрачными при рассмотрении под микроскопом.

Иглы для микроинъекций изготавливают путем вытягивания стеклянных капиллярных трубок. Мы используем вытягиватель игл от World Precision Instruments со следующими настройками программы: Heat one delay four back.

Заполните иглу двумя µL двухцепочечной РНК, используя пипетку Einor P 20 с наконечниками einor micro loader. Подготовьте предметное стекло, накрыв его чистым покровным стеклом, и закрепите их вместе лентой. Прижмите заполненную иглу к краю покровного стекла, чтобы сформировать острый кончик.

Двуцепочечная РНК вытекает из кончика иглы. При нажатии на педаль пико-насоса подготовьте предметное стекло с каплей масла в центре. Погрузите иглу в каплю масла.

Настройте пико-насос таким образом, чтобы при нажатии на педаль выдавливалось от 100 до 200 пл двухцепочечной РНК. Двухцепочечная РНК должна быть видна в виде маленькой капли.

Когда кончик иглы находится в задней части первого эмбриона, нажмите педаль пико-насоса. Двуцепочечная РНК появится в виде маленькой капли в месте инъекции.

Завершите инъекции двухцепочечной РНК в эмбрионы на предметном стекле. Уничтожьте все эмбрионы, не достигшие стадии бластердермы. Поместите покровное стекло в закрытую влажную камеру, например, в пластическую чашку Петри, при температуре 18 °C до тех пор, пока эмбрионы не разовьются до нужной эмбриональной или личиночной стадии.

Для эмбрионов, достигших нужной стадии развития, используйте зонд, чтобы отделить их от двустороннего скотча и переместить к краю покровного стекла. Смойте эмбрионы гептаном в пробирку для сбора с нейлоновой сеткой на дне. Промойте эмбрионы трижды раствором PBT, затем выдержите их в 50% растворе гипохлорита натрия (Bleach) в течение пяти минут и снова промойте эмбрионы трижды раствором PBT.

Перенесите эмбрионы из пробирки для сбора на фрагмент нейлоновой сетки с помощью пипетки, затем погрузите фрагмент нейлоновой сетки в фиксирующий раствор. Фиксируйте эмбрионы в течение 30 минут. Удалите нижний слой фиксирующего раствора.

Затем эмбрионы фиксируют метанолом, переносят в пробирку типа «эппендорф» и подвергают иммуноокрашиванию с использованием антител к A 12 и диффузии согласно стандартным протоколам окрашивания антителами для эмбрионов, достигших нужной личиночной стадии. Подготовьте предметное стекло, поместив в центр каплю галоуглеродного масла 700, а по обе стороны от капли масла — по одному маленькому покровному стеклу. Перенесите одну личинку на предметное стекло, затем накройте каплю масла покровным стеклом.

Осмотрите личинок под микроскопом в светлом поле. Здесь представлены репрезентативные результаты инъекций как диффузионной двухцепочечной РНК, так и двухцепочечной РНК GFP.

Эмбрионы, в которых была введена двухцепочечная РНК GFP, демонстрируют нормальное слияние трахей, а диффузионный белок присутствует в клетках слияния. Стрелками указаны положительные по диффузии клетки слияния латерального ствола, а звездочкой отмечено место нормального слияния.

Однако в эмбрионах, в которые была введена двухцепочечная РНК против диффузина, наблюдается нарушение слияния ветвей, а белки диффузина в клетках слияния отсутствуют. Треугольником отмечено место неслияния ветвей трахей у эмбрионов, в которых была введена двухцепочечная РНК, при их развитии до личиночной стадии. Личинки G-F-P-R-N AI демонстрируют нормальное слияние ветвей трахей, отмеченное звездочкой.

С другой стороны, личинки RN AI с подавленным экспрессией гена diffusion продемонстрировали нарушение слияния ветвей, отмеченное треугольниками. Эти результаты показывают эффект нокдауна эндогенной экспрессии гена diffusion путем инъекции двухцепочечной РНК в эмбрионы drosophila. При выполнении данной процедуры важно не забыть уничтожить все эмбрионы enseal blaster после их развития.

Этот метод открыл исследователям в области биологии развития возможность изучать функцию новых генов, отвечающих за развитие органов у drosophila. После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как осуществлять нокдаун эндогенных генов путем инъекции двухцепочечной РНК в эмбрионы drosophila.