RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы
11 апреля 2011 г.
РНК-интерференция была доказана очень эффективно анализировать функции генов в Drosophila Трахеи развития. Подробное протокол, используемый Цзян лаборатории, чтобы придать дсРНК в летают эмбрионов нокдауна экспрессии генов иллюстрируется. Эта технология обладает потенциалом для скрининга генов, необходимых для развития тканей и органов в Drosophila.
Общая цель данной процедуры — подавить экспрессию эндогенных генов путем введения двухцепочечной РНК в эмбрионы дрозофилы для идентификации генов, необходимых для развития органов. Это достигается путем сбора и расположения эмбрионов в прямую линию. Далее готовятся иглы и используются для введения двухцепочечной РНК в эмбрионы.
Наконец, эмбрионы помещаются в влажную камеру для развития. В конечном итоге, результаты могут показать дефекты фузии трахейных ветвей дрозофилы путем окрашивания поздних стадий эмбрионов антителами или путем наблюдения личинок под светлым полем микроскопа. Основное преимущество этой техники перед существующими методами, такими как прямой генетический скрининг для идентификации генов, необходимых для развития органов, заключается в том, что это относительно простая и быстрая обратная генетическая методика для анализа функций генов до того, как для этого гена будет доступна мутантная линия.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как идентификация критических генов, необходимых для развития трахейной системы D. Это отличная модель для изучения морфогенеза млекопитающих органов, таких как дыхательные пути позвоночных, система кровообращения, почечные протоки и эксплуатационный эпителий. Как правило, люди, недавно ознакомившиеся с этим методом, будут испытывать трудности, так как требуется время для освоения методов, таких как выравнивание эмбрионов, изгиб игл и введение одноцепочечной РНК в эмбрионы.
Визуальная демонстрация этого метода крайне важна, так как количество двухцепочечной РНК, вводимое в каждый эмбрион, различно, а описание того, как выглядят синцитиальные бластодермальные эмбрионы, может быть сложным. Эти шаги сложны для усвоения, поскольку введение подходящих количеств двухцепочечной РНК в синцитиальные бластодермальные эмбрионы является критическим шагом для эффективного подавления экспрессии эндогенных генов.
Для начала установите клетки при температуре 25 градусов Цельсия с помощью двух-четырехдневных мушек W 1 1 1 8, меняйте тарелки с виноградным соком каждый час днем, чтобы синхронизировать сбор яиц в течение одного-двух дней. Перед сбором. Собирайте синцитиальные или бластодермальные эмбрионы в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия, прямоугольный кусок желатинового агарового сока, затем легко разрежьте линию посередине агара с помощью бритвы.
Используйте металлический зонд для переноса эмбрионов с тарелки с виноградным соком на кусок желатинового агарового сока. Выровняйте около 50 эмбрионов прямой линией с эмбрионами, длинные оси которых находятся под углом 45 градусов к линии посередине агара. Убедитесь, что все эмбрионы направлены в одном направлении, их задние концы направлены от линии.
Вырежьте прямоугольный кусок двустороннего скотча и приклейте его на 18 на 18 миллиметровую крышку. Поднимите эмбрионы с помощью скотча на крышке. Поместите крышку на стеклянную пластинку.
Легко нажмите на эмбрионы на двусторонний скотч и дайте эмбрионам высохнуть на воздухе около 10 минут. Покройте эмбрионы тонким слоем 700 гало карбонного масла. Подождите около 10 минут, пока эмбрионы не станут прозрачными под микроскопом.
Иглы готовятся для микроинъекции путем тяги стеклянных капиллярных трубок. Мы используем вытяжку игл от World Precision Instruments под настройками программы. Нагрейте один задержка четыре назад.
Загрузите иглу с двумя микролитрами двухцепочечной РНК с помощью пипетки Einor P 20 с наконечниками einor micro loader. Подготовьте слайд с чистой крышкой наверху и закрепите их вместе. Поднесите заполненную иглу к краю крышки, создавая острую точку.
Двухцепочечная РНК вытекает из наконечника иглы. Когда педаль пико-помпы нажата, подготовьте слайд с каплей масла посередине. Вставьте иглу в масляную каплю.
Отрегулируйте настройку на пико-помпе для выталкивания 100 до 200 пиколитра двухцепочечной РНК, когда педаль пико-помпы нажата. Двухцепочечная. РНК видна как небольшая капелька позиции.
Наконечник иглы в задней части первого эмбриона нажмите на педаль пико-помпы. Двухцепочечная РНК появится как маленькая. в месте инъекции.
Закончите введение двухцепочечной РНК в эмбрионы на слайде. Убейте все небластодермальные эмбрионы. Поместите крышку в покрытую влажную камеру, такую как пластиковая чаша Петри при температуре 18 градусов Цельсия, пока эмбрионы не разовьются до желаемой эмбриональной или личиночной стадии.
Для эмбрионов, развившихся до желаемой эмбрион
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Overview
This article presents a protocol for knocking down gene expression in Drosophila embryos using double stranded RNA (dsRNA). The method enables researchers to identify genes essential for organ development, particularly in tracheal development.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Genetics
- Developmental Biology
Background
- RNA interference is a powerful tool for gene function analysis.
- Drosophila serves as a model organism for studying developmental processes.
- Understanding gene roles can aid in deciphering organ development mechanisms.
- This technique offers a rapid approach compared to traditional genetic screening methods.
Purpose of Study
- To knock down endogenous gene expression in Drosophila embryos.
- To identify genes required for organ development.
- To provide a straightforward method for gene function analysis.
Methods Used
- Collection and alignment of Drosophila embryos.
- Preparation of needles for dsRNA injection.
- Injection of dsRNA into embryos.
- Development of embryos in a moist chamber.
Main Results
- Defects in tracheal branch fusion observed through antibody staining.
- Larvae examined under a brightfield microscope for developmental analysis.
- Demonstrated effectiveness of the dsRNA injection technique.
- Provided insights into gene functions related to organ development.
Conclusions
- The dsRNA injection method is a quick and effective reverse genetic approach.
- This technique can facilitate the identification of essential genes in Drosophila.
- Results contribute to a better understanding of developmental biology.
