RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы подавить экспрессию эндогенных генов путем введения эмбрионам дрозофилы двухцепочечной РНК для идентификации генов, необходимых для развития органа. Это достигается путем предварительного сбора и выстраивания эмбрионов по прямой линии. Затем подготавливаются иглы, которые используются для введения двухцепочечной РНК эмбрионам.

Наконец, эмбрионы помещаются во влажную камеру для развития. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают дефекты в слиянии трахеальных ветвей дрозофилы путем окрашивания антителами эмбрионов на поздних стадиях или путем наблюдения за личинками под светлопольным микроскопом. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как прямой генетический скрининг для идентификации генов, необходимых для развития органов, заключается в том, что это относительно простой и быстрый обратный генетический подход к анализу функций генов до того, как мутант станет доступен для этого гена.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как идентификация критических генов, необходимых для развития системы D. tracheal. Это отличная модель для изучения морфогенеза органов млекопитающих, таких как дыхательные пути позвоночных, кровеносная система, почечные протоки и исследовательский эпителиальный. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что требуется время, чтобы изучить такие методы, как выравнивание эмбрионов, поломка игл и введение трудноизвлекаемой РНК в эмбрионы.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы включают в себя количество двухцепочечных. Вводимая РНК варьируется от эмбриона к эмбриону, и письменная демонстрация того, как выглядят синцитиальные, бластодермальные эмбрионы, может быть затруднительной. Эти шаги трудно освоить, потому что введение подходящего количества двухцепочечной РНК в синцитиальные бластоэмбрионы является очень важным шагом для эффективного подавления экспрессии эндогенных генов.

Для начала установите клетки при температуре 25 градусов по Цельсию с использованием двух-четырехдневного возраста W 1 1 1 8 мухи меняют пластины с виноградным соком каждый час в течение дня, чтобы синхронизировать сбор яиц в течение одного-двух дней. Перед сбором. Соберите эмбрионы syn city или blaster derm в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия, прямоугольный кусок агара из виноградного сока, затем слегка отрежьте линию в середине агара лезвием бритвы.

С помощью металлического зонда перенесите эмбрионы с пластины с виноградным соком на кусочек виноградного сока. Агар. Выстройте около 50 эмбрионов по прямой линии с эмбрионами, более длинными осями под углом 45 градусов к линии в середине агара. Следите за тем, чтобы все эмбрионы были направлены в одном направлении, а их задние концы были направлены в сторону от линии.

Отрежьте прямоугольный кусок двустороннего скотча и наклейте его на покровный лист размером 18 на 18 миллиметров. Подхватите эмбрионы с помощью ленты на покровном листе. Поместите крышку на предметное стекло.

Слегка прижмите эмбрионы к двусторонней ленте и дайте эмбрионам высохнуть на воздухе в течение примерно 10 минут. Покройте эмбрионы тонким слоем углеродного масла толщиной 700 гало. Подождите около 10 минут, пока эмбрионы не станут прозрачными под микроскопом.

Иглы подготавливаются к микроинъекциям путем вытягивания стеклянных капиллярных трубок. В настройках программы мы используем иглосъемник от World Precision Instruments. Нагрейте одну задержку четыре назад.

Загрузите в иглу два микролитра двухцепочечной РНК с помощью пипетки Einor P 20 с наконечниками микрозагрузчика Einor. Подготовьте горку с чистой крышкой, наденьте на нее сверху и скрепите их скотчем. Поднесите заполненную иглу к краю покровного стекла, создав острое острие.

Двухцепочечная РНК вытекает из кончика иглы. Когда ножная педаль пиконасоса будет нажата, подготовьте горку с каплей масла посередине. Вставьте иглу в масляную каплю.

Отрегулируйте настройку пико-насоса таким образом, чтобы при нажатии на ножную педаль вытеснялось от 100 до 200 пиколитров двухцепочечной РНК. Двухцепочечный. РНК можно рассматривать как положение небольшой капли.

Кончик иглы в задней части первого эмбриона нажимает на ножную педаль пиконасоса. Двухцепочечная РНК будет выглядеть как маленькая. в месте инъекции.

Завершите введение двухцепочечной РНК в эмбрионы на предметном стекле. Убейте все небластерные эмбрионы. Поместите крышку в закрытую влажную камеру, например, в пластиковую чашку Петри при температуре 18 градусов Цельсия, пока эмбрионы не разовьются до желаемой эмбриональной или личиночной стадии.

Для эмбрионов, которые развились до желаемой эмбриональной стадии, используйте зонд, чтобы извлечь эмбрионы из двустороннего скотча и прижать их к краю покровного стекла. Смойте зародыши гептаном в коллекцию с капроновой сеткой на дне. Промойте эмбрионы три раза PB в 50% отбеливателе в течение пяти минут и снова промойте эмбрионы три раза PBT.

Перенесите эмбрионы из флакона для сбора на кусок капроновой сетки с помощью пипетки, окуните кусочек капроновой сетки в фиксирующий раствор. Зафиксируйте эмбрионы на 30 минут. Снимите нижний слой фиксирующего раствора.

Затем их переносят метанолом, эмбрионы переносят в пробирку Эппендорфа и окрашивают их двумя А-12 и диффузионными антителами с использованием стандартных протоколов окрашивания антителами для эмбрионов, развившихся до желаемой личиночной стадии. Подготовьте горку с каплей гало-углерода, 700 маслом посередине и двумя маленькими покровными стеклами с каждой стороны масляной капли. Перенесите одну личинку на предметное стекло, а затем нанесите сверху масляную каплю на крышку.

Понаблюдайте за личинками под светлопольным микроскопом. Репрезентативные результаты как диффузионной двухцепочечной РНК, так и двухцепочечной GFP. Инъекции РНК показаны здесь.

GFP двухцепочечный. Введенные эмбрионы РНК демонстрируют нормальное слияние трахеи, а в слитых клетках присутствует диффузионный белок. Стрелки указывают на клетки положительного слияния боковой диффузии ствола, а звездочка указывает на место нормального слияния.

Тем не менее, диффузионные эмбрионы с двухцепочечной РНК показывают неудачное слияние ветвей, и диффузионные белки не присутствуют в слитых клетках. Треугольником обозначено место неудачного слияния ветвей, когда двухцепочечные РНК инъецировали эмбрионы, развившиеся до личиночной стадии. Личинки G-F-P-R-N AI демонстрируют нормальное сращение трахеальных ветвей, обозначенное звездочкой.

С другой стороны, личинки диффузионного RN AI продемонстрировали неудачное слияние ветвей, обозначенное треугольниками. Эти результаты показывают эффект подавления экспрессии эндогенных генов диффузии путем введения двухцепочечной РНК в эмбрионы дрозофилы. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно убить все эмбрионы бластера после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области биологии развития к изучению функции новых генов для развития органов у дрозофилы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сбивать эндогенные гены путем введения двухцепочечной РНК в эмбрионы дрозофилы.