Эластомерные PGS Строительные леса в Артериальная тканевой инженерии

В этом видео показано, как изготавливать пористые трубчатые каркасы и подвергать их динамическому механическому кондиционированию для инженерии артериальных тканей. Это достигается путем предварительного изготовления скаффолдов с использованием биоразлагаемого эластомера и штурмового метода плавления. Затем каркасы подготавливаются к заселению клеток и собираются в систему биореактора.

В биореакторе гладкомышечные клетки сосудов засевают каркасы и культивируются. Через несколько недель ткань собирают и анализируют с помощью сканирующей электронной микроскопии, h- и e-окрашивания и автофлуоресценции эластина. Полученная гладкая мускулатура является как многослойной, так и перпендикулярно ориентированной.

Основным преимуществом такой существующей методики, как и отбеливание частицами, является использование стеклянной формы для изготовления пористого трубчатого каркаса и гиалуроновой кислоты. По мере того, как форма удаляется, форма для строительных лесов готовится из куска стеклянной трубки. Поместите трубку в держатель и залейте в трубку приготовленный накануне раствор гиалуроновой кислоты.

Гиалуроновая кислота медленно стекает вниз по внутренней стенке. Когда он достигнет дна формы, переверните форму. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока внутренняя стенка формы не будет равномерно покрыта раствором.

После нанесения покрытия высушите все подготовленные стеклянные формы в вакуумной печи при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Как правило, четыре формы готовятся одновременно, пока стеклянные формы сохнут. Приготовьте насыпь из частиц соли, измельчите и измельчите частицы соли до 25-32 микрометров.

На следующий день соберите подготовленную оправку стеклянной формы, трубку из ПТФЭ, термоусадочную втулку и кольцо из ПТФЭ. Сначала загрузите оправку в 65-миллиметровые трубки из ПТФЭ и запекайте их при температуре 120 градусов Цельсия в течение пяти минут. Уменьшить ПТФЭ во время ожидания до войны гибридизационный инкубатор при 37 градусах Цельсия не менее 30 минут.

После того, как трубка охватит оправки, надавите на термоусадочную втулку на оправку, чтобы она свободно двигалась. Затем поместите оправку внутрь стеклянной формы и прикрепите кольцо A-P-T-F-E к нижней части оправки. Убедитесь, что кольцо из ПТФЭ плотно прилегает к дну стеклянной формы.

Далее с помощью шпателя и воронки из силиконовой резины добавьте в стеклянную форму крупицы соли. Затем аккуратно постучите по форме шпателем для равномерного распределения частиц и соскребите лишнюю соль. Теперь выключите прогретый инкубатор и быстро загрузите его Вместе с упакованными солью формочки соль будет плавиться в течение следующих 30 минут, после чего сушите формы в вакуумной печи при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.

На следующий день после остывания извлеките оправку из нержавеющей стали из форм, выдавливая ее наружу, фиксируя кольцо из ПТФЭ. При необходимости используйте плоскогубцы с игольчатым носом. Затем снимите кольцо из ПТФЭ со дна формы.

Далее выпекаем формочки, чтобы усадить рукав и вынуть сморщенные рукава из форм. Дайте формочкам остыть до тех пор, пока они не будут использованы, и храните их в сушильном отсеке в вытяжке. С помощью пипетки апо наклоните стеклянные формы под углом 45 градусов и капните раствор PGS в их внутренний просвет, медленно вращая форму.

Проверьте, стекает ли раствор PGS вниз по стенке формы. Если есть сухое пятно, добавьте больше PGS Теперь дайте ТГФ испариться в вытяжке не менее 30 минут. Как только ТГФ исчезнет, отверждайте формы в вакуумной печи.

После затвердевания в течение одного дня охладите формы до комнатной температуры и медленно, вертикально опустите их в деионизированную воду при температуре 24 градуса Цельсия. При слишком быстром их опрокидывании образуются пузырьки воздуха, которые разрывают строительные леса. Аккуратно переложите формочки на водяную баню.

Расположите их под углом с помощью силиконовой трубки и дайте гиалуроновой кислоте раствориться в течение часа. Если через час гиалуроновая кислота не вышла из формы, то когда форма все еще погружена, с помощью шпателя медленно оттолкните гиалуроновую кислоту с обоих концов, а затем медленно встряхните форму. Теперь убедитесь, что каркасы не переместились внутрь стеклянной формы, и если это так, медленно потяните каркас щипцами, чтобы освободить его от формы.

Затем выщелачивайте частицы соли, осторожно перенося хрупкие каркасы на деионизированную водяную баню с легким помешиванием. Это займет не менее трех дней и потребует ежедневной замены воды После того, как вся соль будет выщелачана, переложите каждый каркас в 15-миллилитровую центрифужную трубку, наполненную деионизированной водой, и заморозьте их в ящике с сухим льдом на час. Поместите замороженные пробирки центрифуги в лиофилизатор на три дня с открытыми крышками.

После сублимационной сушки храните скаффолды в влагопоглотителе до тех пор, пока они не будут использованы. Начните с резки лесов длиной от 25 до 30 миллиметров. Затем подготовьте две пробки из силиконового каучука, подав трубки из ПТФЭ через средние отверстия каждой пробки.

Затем отрежьте полтора миллиметра от hs кольца и наденьте отрезок на один конец каркаса. Вставьте одну трубку из ПТФЭ, прикрепленную к стопору, в тот же конец лесов с достаточным перекрытием под кольцом HS, чтобы надежно соединить каркас с трубкой, сожмите кольцо HS в печи и дайте сборке остыть до комнатной температуры. Теперь 50-миллиметровая поликарбонатная трубка, которая функционирует как камера биореактора, надевается на каркас и закрепляется на внутренней поверхности силиконовой резиновой пробки.

Так же, как и ранее, другая трубка из ПТФЭ и пробка закрепляются на другом конце каркаса с помощью hs-кольца для завершения камеры. Вторая пробка крепится к другому концу поликарбонатной трубки. Далее к наружным поверхностям стопоров крепятся две пластины из алюминиевого сплава.

Вставьте два резьбовых стержня в боковое отверстие на каждой пластине и закрепите пластины винтами с накатанной головкой. Прикрепите к биореактору каркас. Теперь измерьте видимую длину каждого каркаса, которая представляет собой расстояние между двумя кольцами hs, и вычислите площадь их внутренней поверхности.

Для посева клеток. В автоклаве стерилизуйте камеры, каждая из которых отдельно завернута в фольгу, вместе с каждой частью биореакторной установки. После стерилизации соберите биореактор внутри колпака для клеточных культур.

Предварительно обработайте и промойте каркас серией перфузии с помощью перистальтического насоса со скоростью один миллиметр в минуту в проточном контуре. Начните с полоскания 70% этанолом, 50% этанолом, а затем 25% этанолом в течение часа каждый. После трех полосканий этанолом прополощите PBS в течение двух часов.

Наконец, перфузируйте биореактор питательной средой SMC в течение 24 часов, после чего он готов к посеву клеток и экспериментам. Теперь, следуя инструкциям в сопроводительной рукописи, засейте биореактор 2 миллионами клеток на квадратный сантиметр и в течение следующего 21 дня замените трубчатую среду и отрегулируйте скорость насоса. Постепенно давление в конструкции будет увеличиваться с примерно четырех миллиметров ртутного столба в первый день культивирования до более чем 100 миллиметров ртутного столба после двух недель в культуре, после трех недель в культуре, сбора клеток и подготовки их к анализу, как указано в сопроводительной рукописи.

Эти трубчатые каркасы PGS были изготовлены методом плавления солей. Сканирующие электронные микрофотографии показали, что все скаффолды имеют однородную толщину стенок и частичные дефекты на их поперечных сечениях отсутствуют. На просветной поверхности всех скаффолдов наблюдались хаотично распределенные макро- и микропоры.

После культивирования клеток многослойные SMC выросли с перпендикулярной ориентацией к направлению потока. Кроме того, клетки и белки DCM полностью покрывали просвет всех конструкций PGS. Эластиновая автофлуоресценция также показала окружно организованные эластичные волокна на просветной поверхности конструкции.

Посмотрев это видео, вы должны иметь представление о том, как сделать пористый трубчатый каркас, увидеть клетки и культуру каркаса с помощью предварительно спроектированного биореактора.