Биомолекулярных Обнаружение использованием интерферометрических датчиков изображения отражения (IRIS)

Общая цель следующего эксперимента заключается в количественном определении связывания антител с иммобилизованными на поверхности антигенами с помощью чувствительной сенсорной платформы без использования меток, называемой Iris. Это достигается путем предварительного создания массива тестовых и контрольных зондов на химически функционализированной однородной поверхности из диоксида кремния для захвата целевых белков из раствора. Иммобилизованными зондами могут быть антитела или антигены, ДНК или РНК, а также любые другие типы макромолекул, совместимые с функционализированными, полимерными или иными видами химии поверхности.

Подготовленный микрочип затем инкубируют с образцом, содержащим интересующие белки, что позволяет осуществить связывание в условиях, определенных исследователем. Затем все сенсорное устройство сканируют при различных длинах волн света. В системе IRIS интенсивность отраженного сигнала для каждого пикселя обрабатывается с помощью специально разработанных алгоритмов.

Для количественного определения количества биоматериала, связавшегося при каждом тестовом или контрольном условии, получают результаты после инкубации, которые демонстрируют эффективное обнаружение и абсолютное количественное определение антител в сложной смеси на основе интерферометрических безметочных измерений данной системы. Опираясь на более чем десятилетний опыт исследований и разработок в области оптической интерференции и устройств с полимерным резонатором, мы разработали этот новый метод, который позволяет преодолеть многие проблемы, с которыми мы сталкивались в наших предыдущих безметочных биосенсорных системах. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы сбора данных требуют правильной нормализации и соблюдения процедур контроля качества для обеспечения точного и воспроизводимого получения данных.

Чтобы покрыть подложки из диоксида кремния самоабсорбирующими сополимерами DMMA NAS, сначала приготовьте раствор полимера, добавив 100 milligrams полимера в 5 milliliters деионизированной воды. Затем добавьте 5 milliliters 40%-го насыщенного раствора сульфата аммония, чтобы конечная концентрация сульфата аммония составила 0.92 molar. Погрузите чипы в раствор полимера на 30 минут, поместив их на шейкер для инкубации.

Тщательно промойте чипы деионизированной водой, высушите их струей аргона или азота, а затем подвергните термической обработке при 80 °C в течение 15 минут. Храните чипы с полимерным покрытием в сухой среде, например в вакуумном эксикаторе, до двух-трех месяцев до начала процедуры нанесения зондов. Для разведения каждого зонда сначала определите необходимый объем стокового раствора зонда и буфера для достижения желаемой конечной концентрации.

В типичном эксперименте используют антиген или IgG в концентрации 0,5 mg/mL в фосфатно-солевом буферном растворе; рассчитанный объем каждого стокового раствора зонда добавляют в небольшие эппендорф-пробирки, содержащие необходимый объем PBS-буфера, и перемешивают растворы. Затем растворы зондов дозируют пипеткой в 96-луночный планшет с низкой сорбцией белков, который будет использоваться в качестве исходного планшета для споттера. Далее устанавливают параметры нанесения для печати микрочипа, определив количество повторностей для каждого условия на одну сетку.

Сетка определяет количество повторяющихся сеток и желаемое положение точек нанесения на чипе. Поместите подложку и исходный планшет в споттер, затем проверьте емкости для отходов и реагентов. Запустите процесс печати.

После завершения нанесения капель поместите подложку в среду с высокой влажностью на ночь, чтобы после инкубации прошли процессы иммобилизации и дезактивации. Промойте подложки при перемешивании, трижды помещая чип в PBS с 0,1% tween на три минуты. Затем проведите три трехминутные инкубации в PBS и далее в деионизированной воде.

При проведении сухого измерения тщательно просушите чип струей аргона. Дезактивируйте оставшиеся NHS-группы на поверхности сополимера, погрузив чипы в 50 мМ раствор этаноламина с pH 7,4 на 30 минут при перемешивании на шейкере. Перед началом процедуры инкубации тщательно промойте чипы от этаноламина, используя PBS, а затем деионизированную воду.

Для данной демонстрации приготовьте раствор целевого белка в PBS соответствующей концентрации. Используется 500 нанограмм на миллилитр антител к сывороточному альбумину человека; для инкубации отрицательного контроля включите эквивалентный объем буфера без целевого белка. Система Iris состоит из нескольких основных элементов, таких как источник освещения, оптические компоненты для надлежащего освещения массива сенсорных зондов, камера для регистрации интенсивности отраженного света и предметный столик, на который помещается образец для проведения измерений.

Начните со сканирования кремниевого зеркала чистого кремниевого чипа, чтобы нормализовать все данные, которые будут собираться в ходе последующего сканирования. Подготовьте систему ириса, настроив параметры для эксперимента. Это включает в себя измерение гистограммы интенсивностей света, регистрируемой камерой, и установку времени экспозиции для достижения оптимальных значений интенсивности.

После нормализационного сканирования поместите подготовленный массив зондов в систему IRIS и выполните настройку, как описано ранее, установив фокус для получения корректного изображения поверхности подложки. Убедитесь, что предметный столик расположен ровно, проверив записанные гистограммы интенсивности отраженного света. В завершение выберите имя файла для сохранения данных.

Запустите программное обеспечение для сканирования массива, при котором поверхность многократно освещается на разных длинах волн с последующим усреднением полученных изображений. Определяется исходная оптическая высота контрольной точки, что позволяет правильно проанализировать изменения массы на поверхности после инкубации. После первичного сканирования погрузите чип в подготовленный инкубационный раствор на один час, поместив его на шейкер-платформу. Время инкубации может значительно варьироваться в зависимости от степени вегетации, концентрации определяемой мишени и сродства пары «мишень-зонд».

После инкубации повторите процедуру промывки, выполненную ранее. Просканируйте тот же массив белков с помощью системы iris, чтобы получить изображения после инкубации для сравнения с изображениями до инкубации. При необходимости этот процесс можно повторять для различных этапов инкубации.

Например, в формате сэндвич-анализа с использованием вторичных антител, обработайте полученные изображения для каждого сканирования радужки с помощью коммерческого программного обеспечения, чтобы создать изображение зонда с формированием оптической толщины. Быстрый качественный анализ связывания можно провести путем вычитания изображений, полученных до и после инкубации. Связывание будет проявляться в виде изменения интенсивности в тех точках, где наблюдались изменения массы.

Для количественного анализа определите массовую плотность каждого пятна по сравнению с фоном, рассчитав среднее значение оптической плотности для каждого пикселя внутри пятна и для кольцевой области вокруг пятна. Затем проведите прямое сравнение этих двух областей, показанных здесь. В качестве примера приведена схема многослойной подложки из кремния и диоксида кремния с нанесенным на нее репрезентативным массивом антител.

Каждый набор антител наносится в повторностях с учетом специфичности к разным эпитопам, воздействуя на разные белки. В качестве примеров представлены два различных целых вируса и вирусный белок. Мишени. Антитела отрицательного контроля зависят от метода анализа и могут быть неспецифическими и/или специфичными к вирусу.

Ниже представлен пример качественных результатов связывания специфических антител к сывороточному альбумину человека с массивом нанесенных пятен HSA и контрольных пятен IgG кролика, как показано здесь. После аппроксимации и определения оптической толщины для изображений до и после инкубации можно создать разностное изображение массива связывания для быстрой оценки процесса связывания. Более точный количественный анализ показал, что при концентрации антител к HSA в ходе инкубации 500 ng/mL среднее изменение оптической высоты составило 2,05 нм для пятен HSA и 0,13 нм для пятен IgG кролика соответственно.

Эта столбчатая диаграмма представляет собой пример количественных данных, которые могут быть получены с помощью измерений на системе iris. В данном примере представлена зависимость связывания белков fur от концентрации белка и длины двухцепочечного лигамента. На этой диаграмме показаны абсолютные измерения оптической высоты для исходной высоты иммобилизованных зондов лигамента и после инкубации для связывания.

Увеличение концентрации белка Fur до 5, 100 и 200 нМ приводило к усилению связывания с ДНК-зондами. Здесь представлено расчетное связывание димеров белка Fur на один двухцепочечный лигамент ДНКА. Связывание димеров значительно увеличилось при концентрации белка Fur 200 нМ, что указывает на высокий уровень неспецифических взаимодействий по всему лигаменту или на иной механизм связывания белка Fur, например, агрегацию нескольких димеров.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использовать чистые однородные подложки с соответствующей толщиной слоя оксида, а также поддерживать чистоту образцов, осторожно перемещая их пинцетом. Также крайне важно использовать реагенты, которые хранились надлежащим образом и функциональность которых подтверждена. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять биомолекулярные взаимодействия без использования меток путем подготовки функциональных зондовых массивов на поверхности диоксида кремния, а также о методах сбора и анализа данных с помощью интерферометрического датчика отражательной способности (IRIS).