Количественная Частота опухолей, распространяющихся ячеек с использованием Ограничение трансплантации Разбавление сотовый в сингенных данио рерио

Анализ трансплантации клеток с предельным разведением является золотым стандартом для оценки потенциала самообновления в экспериментальных моделях на животных. В этой демонстрации сингенным эмбрионам данио-рерио на одной клеточной стадии вводят RAG 2 MIC и RAG 2 GFP для создания трансгенных рыбок данио, у которых разовьется флуоресцентно меченный Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз. К 60 дню жизни первичные клетки лейкемии выделяют из рыбок данио, а затем очищают с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток.

Далее клетки пересаживают при предельном разведении в брюшную полость взрослых рыбок данио, и рыб контролируют на предмет роста опухоли до 90 дней. Наконец, статистическая программа для анализа экстремальных предельных разведений используется для количественной оценки частоты распространения клеток лейкемии в исходной опухоли. Анализ трансплантации клеток с ограничением разведения позволяет исследователям точно оценить количество самообновляющихся клеток, содержащихся в основной массе опухоли.

Именно эти самообновляющиеся клетки стимулируют образование рака и в конечном итоге ответственны за рецидив. Основное преимущество проведения анализов трансплантации с ограничением разведения в модели рыб данио заключается в том, что для каждого эксперимента можно пересадить много рыб, что приводит к большей точности при определении частоты самообновляющихся клеток, размножающихся опухолями. Этот метод позволяет получить представление о клетках, размножающихся опухолями в Т-клетках, остром лимфобластном лейкозе.

Его также можно применять для понимания других моделей рака рыбок данио. Джессика Блэкберн, сотрудник лаборатории, и Салли Лю, талантливый техник, продемонстрируют вам процедуру сегодня: Чтобы линеаризировать Rag two CM и RAG two G-F-P-D-N-A Constructs расщепляют 10 микрограммов каждой плазмиды с ферментом рестрикции, а не один при 37 градусах Цельсия за ночь. После экстракции фенилхлороформа и осаждения этанола мы суспендируем каждую плазмиду в 20 микролитрах воды.

Определите концентрацию ДНК в 1%-ном агрогеле, проведя разведение каждой переваренной плазмиды один к одному, от одного до пяти и от одного до 10 с помощью 20 микролитров, 10 микролитров и пяти микролитров лестницы ДНК высокого диапазона. Теперь разбавьте ДНК до конечной концентрации 60 нанограмм на микролитр для введения в CG одного штамма сингена. Эмбрионы данио-рерио вводят 250 нанолитров по 30 нанограмм на микролитр тряпки, два СМ и 30 нанограммов на микролитр.

Вживите два GFP в одну клетку, тщательно нацеливаясь на ДНК непосредственно в клетку, а не в желток. Храните введенные эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия и удаляйте мертвые эмбрионы через 24 часа на пять дней жизни, переводите животных в большие резервуары примерно через 28 дней после инъекции. Обезболивание личинок данио-рерио путем добавления 200 микролитров четырех нанограммов на миллилитр трика S к 25 миллилитрам воды рыбной системы в чашке Петри.

Исследуйте личинки на предмет развития флуоресцентно меченного TALL с помощью эпифлуоресцентного микроскопа для определения флуоресценции GFP. Отделите опухолеположительные личинки от отрицательных, чтобы гарантировать, что ни одна лейкемическая рыба не будет пропущена при анализе. Отрицательные личинки могут быть исследованы позже, когда опухоли могут вырасти в размеры. Отслеживайте флуоресцентно меченых лейкозных рыб не реже одного раза в неделю, используя эпифлуоресцентный микроскоп для отслеживания роста опухоли.

Когда GFP-положительные лейкозные клетки охватили более 50% животного, добавьте один миллилитр четырех нанограммов на миллилитр. Трику S в чашку Петри, содержащую девять миллилитров воды рыбной системы, чтобы принести рыбу в жертву, поместить рыбу в новую чашку Петри, содержащую один миллилитр 5% фетальной бычьей сыворотки в 0,9 XPBS, размачивать рыбу бритвенным лезвием, пипеткой перемешать смесь для диссоциации крупных клеточных комков. Затем пропустите клетки через сетчатое ситечко 40 микрометров в пробирку объемом 50 миллилитров.

Пипеткой введите 500 микролитров клеток в четырехмиллилитровую полистирольную трубку. Добавьте один микролитр одного миллиграмма на миллилитр, йодид перидия, чтобы пометить мертвые клетки вихрем, затем держите клетки на льду. Также готовят дикий тип CG одну рыбу для сбора нормальных клеток крови, которые служат носителем для опухолевых клеток при пересадке по четыре миллилитра 5% FPS в 0,9 X PB S в 50 миллилитровую пробирку общим объемом пять миллилитров.

Подсчитайте нормальные клетки крови, разбавьте до трех умно-10 до пятой клетки на миллилитр в 5% FBS в 0,9 x pbs, затем пипеткой 100 микролитров на лунку 96-луночного планшета с помощью флуоресцентного сортировщика активированных клеток, отсортируйте GFP-положительные PI-отрицательные опухолевые клетки в 96-луночный планшет, содержащий клетки крови в указанных дозах. Кроме того, отсортируйте 10 000 клеток в лунку без нормальных клеток крови и повторно проанализируйте с использованием фактов для оценки чистоты и жизнеспособности центрифуги для сортировки клеток. На 96 лунках планшет при 2000 GS в течение 10 минут для гранулирования ячеек.

Удалите 95 микролитров сната и ресуспендируйте клетки в оставшихся пяти микролитрах. Введите клеточную суспензию в брюшную полость взрослых сингенных рыбок данио старше 60 дней с помощью микрошприца 26 с половиной калибра. Данио рерио не обязательно подвергать анестезии перед трансплантацией.

Пересадите 45 рыб с 10 клетками лейкемии, 20 рыб со 100 клетками, 7 рыб со 1000 клетками и 5 рыб с 10 000 TALL-клеток примерно через 28 дней после трансплантации. Исследовали рыбок-реципиентов данио-реципиент с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с использованием волны возбуждения 4 85 20 и эмиссионного фильтра 5 30 25. Для обнаружения флуоресценции GFP.

Запишите количество положительных рыб на общее количество введенных рыб. Повторно осматривайте рыбу каждые 14 дней до 90 особей и записывайте количество положительных рыб. При опухоли положительная рыба становится более обильной.

Принесите животное в жертву тройной передозировки УЗИ, введите результаты в таблицу и загрузите данные в веб-программное обеспечение для анализа экстремального предельного разведения для определения частоты самообновляющихся клеток лейкемии в пределах первичного штамма TALL CG эмбрионам одного штамма вводили RAG две cmic и RAG две личинки GFP проводили скрининг на первичный TALL Через 28 дней в соответствии с предыдущей работой. примерно 5% рыб, которым вводили инъекции, имеют GFP-положительные Т-клетки в тимусе, и у 100% этих рыб развивается лейкемия. Здесь флуоресцентно меченые клетки TALL были отсортированы у больных животных в возрасте 65 дней и использованы в анализе трансплантации клеток с предельным разведением. Сначала была нарисована походка для выбора одиночных клеток.

Затем были отобраны йодид-отрицательные клетки пропидия. И, наконец, была проведена походка, чтобы отобрать только GFP-положительные лейкозные клетки для сортировки. В этом примере трансплантированной рыбы TALL на 28-й день опухоли на ранних стадиях были видны как область GFP-положительных клеток рядом с местом инъекции.

В то время как некоторые TLS были более продвинутыми, расширившись для заполнения брюшной полости для этих экспериментов, было пересажено более 220 животных, что может быть легко выполнено одним человеком в течение нескольких часов. Анализ данных с использованием программного обеспечения elda показал, что в среднем одна из 135 Тл всех клеток была самообновляющимися клетками, размножающимися лейкемией. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как пересаживать опухолевые клетки при ограничении разведения в брюшную полость сингенетических рыбок данио, и как использовать полученные данные для определения частоты размножения опухолевых клеток в пределах данной опухоли.

Дальнейшие исследования с использованием генетически модифицированных животных могут помочь определить механизмы, управляющие самообновлением этих клеток, размножающихся опухолями.