HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

Общая цель данной процедуры заключается в использовании искусственных антигенпрезентирующих клеток (иАПК) для эксвиво-экспансии антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) человека для потенциального применения в адоптивной иммунотерапии. Это достигается путем первоначального конъюгирования HLA-A2 Ig и моноклонального антитела к человеческому CD28 с магнитными дина-бисерами для создания иАПК. Вторым этапом процедуры является контроль качества и нагрузка иАПК пептидами. Третьим этапом процедуры является изоляция CD8-положительных Т-клеток из периферической крови человека. Заключительный этап процедуры представляет собой инкубацию CD8-положительных Т-клеток с иАПК в течение одной недели.

Затем CTL собирают и характеризуют, после чего их либо используют, либо подвергают повторной стимуляции в течение еще одной недели для достижения желаемого уровня специфичности и экспансии. В конечном итоге можно получить результаты титрования или окрашивания, показывающие, что CTL, экспансированные в присутствии A A PC, обладают повышенной антигенной специфичностью. Сегодня я продемонстрирую вам систему A A PC на основе HI IG и то, как использовать эту систему для эффективной эксвиво-экспансии CMV-специфичных CTL человека по сравнению с другими существующими методами.

Наша технология A A PC обладает несколькими важными преимуществами. Она доступна в готовом виде, предоставляется в неограниченном количестве, и, скажем, A A PC может быть использована для всех доноров HRAA два положительных. Итак, начнем. Перенесите 1 mL M four 50 эпоксидных бусин из стока, содержащего примерно 400 миллионов бусин, в стерильный стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой.

Промойте гранулы один раз, добавив 1 мл буфера boid, затем приложите стеклянный флакон к магниту DynaDyne NBC 1, пока гранулы прикреплены к стенке флакона. Удалите супернатант с помощью аспирации. Ресуспендируйте гранулы в смеси буфера boid, HLA-A2 IG-димера и моноклональных антител к anti-human CD28.

Затем, чтобы облегчить конъюгацию белка с микросферами, поместите стеклянный флакон на ротатор и вращайте при температуре 4 °C в течение 24 часов. Далее поместите пробирку в магнитный сепаратор MPC One и удалите весь боратный буфер. После удаления буфера дважды промойте микросферы 1 мл буфера для промывки микросфер.

Теперь инкубируйте гранулы в 1 mL буфера для промывки гранул, вращая флакон при температуре 4 °C в течение еще 24 часов, чтобы заблокировать остаточные сайты связывания белков на гранулах. Затем удалите буфер из стеклянного флакона и замените его 1 mL свежего буфера для промывки гранул. Перенесите 100 µL промывочного буфера для FACS в пробирки для FACS, а затем добавьте 5 × 10⁵ гранул.

Окрасьте гранулы, добавив один µL анти-мышиных IgG 1 PE и один µL анти-мышиных IgG 2 A fite, после чего инкубируйте в течение 20 минут при 4 °C. Добавьте по 3 mL промывочного буфера FACS в каждый из окрашиваемых образцов. Затем осадите клетки, центрифугируя при 300 ×g в течение 5 минут при 4 °C.

Повторно суспендируйте A A PC в свежем буфере fax и немедленно считайте результат окрашивания с помощью проточного цитометра. Дважды промойте микросферы стерильным PBS, как и прежде. Затем добавьте к микросферам 10 µL пептида CMV.

Подсчитайте количество микросфер с помощью гемоцитометра, затем подпишите их, указав дату и концентрацию микросфер в количестве штук на мл. Инкубируйте A A PC с пептидом не менее трех дней при температуре 4 °C. Центрифугируйте примерно 100 мл свежей периферической крови донора, позитивного по HLA A2, в 10 пробирках Vacutainer с 10 единицами натриевого гепарина при 300 G в течение 10 минут.

При комнатной температуре осторожно удалите верхний слой плазмы путем аспирации. Замените собранную плазму стерильным PBS и перенесите кровь в стерильный культуральный флакон T 75. Тщательно перемешайте кровь и PBS путем пипетирования, когда вся кровь будет собрана в объемах 15 milliliters из флаконов fial pack плюс в четыре 50 milliliter конических пробирки.

Медленно нанесите от 30 до 35 миллилитров клеток крови поверх слоя Фикола в каждой пробирке. Сохраняя четкую границу раздела между Фиколом и клетками крови, центрифугируйте кровь и градиент Фикола при 500 g в течение 20 минут при комнатной температуре, установив торможение и ускорение на минимально возможные значения для сохранения четкой границы между слоями. После центрифугирования аспирируйте верхний слой плазмы, а затем с помощью серологической пипетки аккуратно аспирируйте слой PBMC. Перенесите PBMC в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. После сбора всех PBMC добавьте к клеткам 30 миллилитров PBS и центрифугируйте их.

Затем удалите супернатант и промойте осадок. Повторите процедуру еще раз с 30 миллилитрами PBS для удаления остатков фибриногена, после чего проведите обогащение популяцией CD8-положительных T-клеток, используя набор для изоляции CD8-положительных T-клеток человека от Milton. Согласно протоколу производителя, подсчитайте количество CD8-положительных T-клеток и подтвердите чистоту образца с помощью FACS-анализа.

Суспендируйте 1 миллион CTL в восьми миллилитрах культуральной среды для роста Т-клеток (2x) плюс восемь миллилитров полной среды RPMI и добавьте 1 × 10⁶ смеси AAPC. Затем с помощью многоканального дозатора распределите по 160 µL клеток в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета для культивирования тканей. Инкубируйте клетки при 37 °C в 5% CO2 в течение семи дней.

На четвертый день подкормите клетки, добавив в каждую лунку 80 µL среды для роста T-клеток с фактором 2. Соберите клетки на седьмой день, затем приложите пробирку к магниту для удаления старых A A PC, пока все магнитные частицы не прилипнут к стенке флакона.

Соберите клетки и перенесите их в другую коническую пробирку объемом 50 миллилитров, затем подсчитайте количество клеток. Определите антигенную специфичность A A PC с помощью окрашивания тетрамерами согласно протоколу производителя. Повторно культивируйте собранные клетки с новыми A A PC при тех же условиях для увеличения количества антигенспецифических клеток.

Ниже представлен репрезентативный результат окрашивания тетрамерами CTL, специфичных к CMV, полученных с помощью A A PC после одной недели культивирования. Здесь показан репрезентативный результат внутриклеточного окрашивания цитокинов CTL, специфичных к CMV, полученных с помощью A-A-P-C-C-M-V; специфика по результатам окрашивания тетрамерами составила 61%. Данный метод может быть использован для поиска ответов на ключевые вопросы в области изучения Т-клеток, такие как определение оптимальных условий культивирования и требований к функциональной модуляции Т-клеток.

Описанный метод позволил получить новые сведения о лечении вирусных заболеваний. Он также может быть применен в других областях, например, при лечении рака.