HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

Общая цель этой процедуры заключается в использовании искусственных антигенпрезентирующих клеток или А-ПК для ex vivo расширения человеческого антиген-специфического CTL для потенциального использования в адоптивной иммунотерапии. Это достигается путем сперва конъюгации HLA A two IG и моноклонального антитела против человека CD 28 с магнитными гранулами дины для получения A A PC. Вторым этапом процедуры является выполнение контроля качества и пептидной загрузки A A PC. Третьим этапом процедуры является выделение CD восьми положительных Т-клеток периферической крови человека. Заключительным этапом процедуры является инкубация восьми положительных Т-клеток CD с помощью ПК А в течение недели.

Затем CTL собирают и характеризуют перед использованием или повторно стимулируют в течение еще одной недели для достижения желаемого уровня их специфичности и расширения. В конечном счете, можно получить результаты ТЛ или окрашивания, которые показывают, что CTL, которые расширяются в присутствии A A PC, имеют повышенную антигенную специфичность. Сегодня я покажу вам систему на основе HI IG A PC и как использовать эту систему для эффективного расширения CTL человека по сравнению с другими существующими методами.

Наша технология A A PC имеет несколько важных преимуществ. Он доступен в готовом виде, его количество неограниченно, и, скажем, компьютер можно использовать для всех двух положительных доноров HRAA. Хорошо, давайте начнем Переложите один миллилитр М четыре 50 эпоксидных шариков из запаса примерно 400 миллионов шариков в стерильную запорную стеклянную пилку.

Промойте бусины один раз, добавив один миллилитр буфера boid, а затем поместите стеклянный флакон против красителя с магнитом NBC, пока бусины приклеиваются к боковой стороне флакона. Удалите сныть с помощью аспирации Resus. Суспендируйте шарики в смеси боидного буфера HLA A two IG димера и моноклонального антитела против человека CD 28.

Затем, чтобы облегчить конъюгацию белка с бусинами, вращайте стеклянный флакон на вращателе при температуре четыре градуса Цельсия в течение 24 часов. Далее поместите трубку в ПДК с одним магнитом и удалите весь боратный буфер. После того, как буфер будет удален, дважды промойте шарики одним миллилитром буфера для промывки шариков.

Теперь инкубируйте шарики в одном миллилитре буфера для промывки шариков и вращайте флакон при температуре четыре градуса Цельсия еще 24 часа, чтобы заблокировать остаточные места связывания белка на бусинах. Затем снимите буфер со стеклянного флакона и замените его одним миллилитром буфера для промывки свежих шариков. Перелейте 100 микролитров буфера для промывки факса в трубки для факса, а затем добавьте пять раз по 10 к пятым бусинам.

Окрасьте бусины одним микролитром антимузного IgG, одним ПЭ и одним микролитром антимузного IgG двумя микролитрами после окрашивания в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. По три миллилитра факса промывочный буфер к каждому из окрашиваемых образцов. Затем гранулируйте ПК, расходуя при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Ройс подвешивает ПК в свежем буфере факса и немедленно считывает результат окрашивания с помощью проточного цитометра. Дважды вымойте бусины стерильным PBS, как и раньше. Далее загрузите в бусины 10 микролитров пептида ЦМВ.

Подсчитайте бусины с помощью гемоцитометра, а затем пометьте их датой и концентрацией бусин. В виде бусин на миллилитр. Инкубируйте A A PC с пептидом в течение не менее трех дней при четырех градусах Цельсия, центрифугируйте примерно 100 миллилитров свежей периферической крови от HLA A 2 положительного донора в 10 пробирках с гепарином натрия при 300 G в течение 10 минут.

При комнатной температуре осторожно снимите верхний слой плазмы с помощью аспирации. Замените собранную плазму стерильным PBS и перелейте кровь в стерильную колбу для культуры T 75. Хорошо перемешайте кровь и PBS с помощью пипетирования после того, как вся кровь будет собрана, в 15 миллилитров флаконной упаковки плюс до четырех 50-миллилитровых конических пробирок.

Медленно нанесите от 30 до 35 миллилитров клеток крови на флакон в каждой пробирке. Сохраняя различие между ячейкой раздела между ячейкой и клетками крови, центрифугируйте градиент крови и ячейки при давлении 500 GS в течение 20 минут при комнатной температуре с разрывом и как можно меньшим ускорением, чтобы сохранить четкую границу раздела между слоями после того, как спин отсасывается от верхнего слоя плазмы, а затем используйте серологическую пипетку для осторожной аспирации слоя PBMC. Перенесите PBMC в свежую коническую пробирку объемом 50 миллилитров, когда все PBMC будут собраны по 30 миллилитров PBS в клетки, и центрифугируйте их.

Далее выбросьте супернат и промойте гранулы. Еще раз с помощью 30 миллилитров PBS для удаления остаточного fi-сигнала, а затем обогатите популяцию CD из восьми положительных Т-клеток с помощью набора для выделения восьми положительных Т-клеток Milton Human CD. Согласно протоколу производителя, подсчитайте CD восемь положительных Т-клеток и подтвердите чистоту с помощью факсимильного анализа.

Суспендируйте 1 миллион CTL в восьми миллилитрах фактора роста Т-клеток, два x питательной среды плюс восемь миллилитров полной среды RPMI и добавьте один раз в 10 из шести А PC смеси. Затем с помощью многоканальной пипетки поместите 160 микролитров клеток на лунку на 96-луночный U-образный планшет для культуры тканей. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение семи дней.

Подкармливайте клетки на четвертый день 80 микролитрами на лунку для роста Т-клеток. Фактор два x культуральная среда. Соберите ячейки на седьмой день, а затем поместите ячейки напротив магнита, чтобы удалить старый ПК, когда все шарики прилипнут к стенке флакона.

Соберите и перенесите клетки в другую коническую трубку объемом 50 миллилитров и подсчитайте количество клеток. Определить антигенную специфичность A A PC путем окрашивания тетрамером в соответствии с протоколом производителя. Повторите собранные клетки с новым ПК А А в тех же условиях, чтобы получить увеличенное количество клеток до антигенной специфичности.

Ниже приведен репрезентативный результат окрашивания тетрамером специфичного для ЦМВ CTL, полученного A A PC после одной недели посева. Показан репрезентативный результат внутриклеточного окрашивания цитокинов специфичным для ЦМВ CTL, полученным на основе специфичности A-A-P-C-C-M-V, составил 61% при окрашивании тетрамером. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области Т-клеток, например, как мы можем определить оптимальные условия культивирования и требования к функциональной модуляции Т-клеток.

Скромный метод позволил получить представление о лечении вирусных заболеваний. Он также может быть применен в других областях, таких как рак.