Количественная оценка образования мембранного оборки с помощью сканирующей электронной микроскопии

Внешние стимуляторы активируют клетки и вызывают трехмерное выпячивание круговой мембраны, или образование мембранного выпячивания, необходимого для различных клеточных активностей.

Чтобы визуализировать образование оборки на мембране, начните с многолуночного планшета, содержащего покровное стекло в основании. В верхней части покровного стекла имеются культивированные макрофаги.

Обрабатывайте эти макрофаги молекулами-стимуляторами, которые активируют клетки, способствуя реорганизации цитоскелета и образованию протрузии мембраны. Наложите на клетки фиксирующий раствор, сшивая белки и сохраняя клеточную структуру.

Обрабатывайте фиксированные макрофаги возрастающими концентрациями спирта для полного обезвоживания. Высушите эти макрофаги с помощью сушилки для критических точек, удалив любые следы воды для лучшей визуализации.

Закрепите покровное стекло на держателе образца для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с помощью проводящей ленты. Покройте макрофагсодержащую покровную ленту тонким металлическим слоем, обеспечивающим хорошую электронную проводимость во время визуализации.

Поместите покровное стекло в камеру SEM. Сфокусируйте электронный луч на покровном листе. Электронный луч ударяется о мембрану макрофага, покрытого металлом, вызывая низкоэнергетическую генерацию вторичных электронов с поверхности мембраны.

Трехмерные выступы рассеивают электроны иначе, чем остальная часть мембраны, подчеркивая эти особенности на поверхности клетки. Детектор собирает рассеянные электроны из различных областей поверхности клетки, создавая контрастное изображение.

На СЭМ-изображении макрофаги кажутся более темными с яркими круглыми выступами на поверхности, что подтверждает образование оборки.

Начните с установки стерильных стеклянных покровных стекол в лунки 24-луночного планшета с помощью автоклавных щипцов. Затем высейте RAW 264,7 макрофагов на покровные стекла с плотностью 10-6 клеток на миллилитр, и инкубируйте планшет в течение ночи в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

На следующий день замените среду в каждой лунке 500 микролитрами свежей полной среды, затем предварительно обработайте макрофаги в течение 30 минут средством контроля, таким как ДМСО, или ингибитором макропиноцитоза, таким как EIPA. Затем, чтобы способствовать взъерошиванию мембраны, обрабатывайте клетки в течение 30 минут стимуляторами макропиноцитоза, такими как 1-микролярный раствор PMA или 100 нанограммов на миллилитр макрофагального колониестимулирующего фактора.

Чтобы зафиксировать ячейки для сканирующей электронной микроскопии, отсасывайте среду из лунок, а покровные стекла дважды промывайте ледяным PBS. Затем инкубируйте покровные стекла в фиксаторе в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего следует ночная инкубация при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день, не нарушая монослой клеток, аккуратно промыть, а затем инкубировать покровные стекла в 500 микролитрах 0,1 молярного какодилата натрия в течение 15 минут. После двух промывок 500 микролитрами дистиллированной воды дважды промойте покровные стекла в 500 микролитрах сортированного этанола с 10-минутной инкубацией при каждой промывке.

Чтобы выполнить сушку в критических точках, поместите покровные стекла в сушилку для критических точек и накройте их 100% этанолом, затем нажмите кнопку питания и откройте резервуар с углекислым газом. Нажмите кнопку «Охладить» и удерживайте ее в течение примерно 30 секунд, пока температура не снизится до 0 градусов по Цельсию. Затем нажимайте кнопку «Заполнить» до тех пор, пока в окне камеры не появится пузырь.

Далее нажимайте кнопку «Продувка» до тех пор, пока не исчезнет запах этанола из продувочного выхлопа. Затем снова нажмите кнопку «Охладить», пока температура не снизится до 0 градусов по Цельсию. Повторно нажмите кнопки «Заполнить» и «Очистить», чтобы выключить их. Затем закройте бак с углекислым газом. Повторно нажмите кнопку «Холод», чтобы выключить его, затем нажмите кнопку «Нагрев». Установите температуру на 42 градуса Цельсия и давление 1,200 фунтов на квадратный дюйм.

Как только давление и температура стабилизируются, нажмите кнопку «Сброс», чтобы давление медленно снижалось. Как только давление в камере достигнет 150 фунтов на квадратный дюйм, нажмите кнопку «Вентиляция» и подождите, пока давление не снизится до 0 фунтов на квадратный дюйм. Выключите сушилку для критических точек и снимите покровные крышки.

Затем с помощью вкладок Carbon Adhesive закрепите покровные стекла на алюминиевых креплениях для образцов для сканирующей электронной микроскопии. Затем приступайте к нанесению покрытия методом напыления с использованием золота или палладия в аппарате для нанесения покрытий методом напыления.

Включите кнопку питания на машине для нанесения покрытия. После того, как вакуум достигнет 30 миллиторров, промойте камеру для удаления влаги и воздуха, выключив газовый выключатель и повернув клапан тонкого газа против часовой стрелки. Как только вакуум увеличится до 200 миллиторров, выключите газовый выключатель и подождите, пока вакуум достигнет 30 миллиторров, затем снова промойте камеру, чтобы удалить влагу и воздух, как показано на рисунке. После трех промывок камеры нажмите кнопку таймера и отрегулируйте ручку напряжения до тех пор, пока манометр не покажет 10 миллиампер. Затем снимите покровные стекла с покрытием из камеры.

Чтобы визуализировать и количественно оценить оборки мембраны, вставьте покровные стекла образца в камеру сканирующего электронного микроскопа. Закройте дверцу и нажмите кнопку «Эвакуироваться». Откройте операционное программное обеспечение микроскопа и установите ускоряющее напряжение на 15 киловольт и рабочее расстояние на 10 миллиметров. Нажмите кнопку «Координаты» и перемещайтесь по контроллеру, пока ячейки не появятся в центре экрана наблюдения. Установите увеличение на 3500x и сфотографируйте образец, нажав кнопку «Фото».