Методы «снизу вверх in vitro » для анализа ультраструктурной организации, изменения формы мембраны и чувствительности к кривизне септинов

Используя этот протокол, мы визуализировали организацию цитоскелетных нитевидных белков на субстратах паттернов, отображающих различные кривизны. Мы можем проверить чувствительность кривизны. Разрешение изображений сканирующего электронного микроскопа достаточно велико, чтобы визуализировались организации нанометрового масштаба.

Методы, которые мы используем для фиксации, достаточно мягкие, чтобы сохранить внутриструктурную организацию белка. Это остается в рамках фундаментальных исследований для понимания поведения цитоскелетных нитей. Начните с разработки волнистого оптического клея Norland, или реплики NOA, в чистой комнате из волнистых полидиметилсилоксановых волнистых узоров с амплитудой 250 нанометров и боковой периодичностью двух микрометров.

Для этого нанесите пять микролитров жидкого NOA на круглый стеклянный слип диаметром один сантиметр, а затем поместите шаблон PDMS на каплю. Обработайте сборку ультрафиолетовым светом на 320 нанометров в течение пяти минут, чтобы фотополимеризовать жидкое NOA в тонкую полимерную пленку. После этого аккуратно снимите шаблон PDMS со скользящей крышки со свежеполимеризованным NOA.

Обработайте пленку NOA с помощью воздушного плазменного очистителя в течение пяти минут, чтобы сделать поверхность гидрофильной. Готовят раствор небольших одноламеллярных пузырьков, или внедорожников, как описано в рукописи, и получают внедорожники путем повторного использования высушенной липидной пленки в буфере наблюдения под ультразвуком в звуковом аппарате ванны в течение пяти-10 минут, пока раствор не станет прозрачным. Позже вставьте покровные скольжения, поддерживающие паттерны NOA, в колодцы ящиков для клеточных культур и инкубируйте свежеснеленные разряженные узоры NOA со 100 микролитрами одного миллиграмма на миллилитр раствора внедорожника в течение 30 минут при комнатной температуре для получения поддерживаемого липидного бислоя.

Чтобы удалить несросшийся внедорожник, тщательно промойте бока шесть раз с помощью буфера с низким содержанием соли, не давая образцу полностью высохнуть между двумя промывками. Разбавляют раствор октомерного септина в септиновом низкосолевом буфере до конечных концентраций, варьирующихся от 10 до 100 наномоляров и объемов в один миллилитр. Затем инкубируют белковый раствор на слайдах в течение одного часа при комнатной температуре.

Промойте слайды NOA, содержащие слитые поддерживаемые липидные бислои и инкубационный белок с септином с низким солевым буфером. Замените низкосолевой буфер септина 2%-ным фиксирующим раствором глутаральдегида в 0,1-молярный буфер какодилата натрия, предварительно расплавленный при 37 градусах Цельсия, и дайте реакции продолжаться в течение 15 минут, и промыть неподвижный образец трижды, по пять минут каждый с 0,1 молярным какодилатом натрия. После промывки инкубируют образец в фиксаторном растворе тетроксида осмия, затем фильтрованную дубильную кислоту и, наконец, фильтрованный уранилацетат в течение 10 минут каждый.

Трижды промывайте образец в дистиллированной воде после каждого раствора. Инкубировать образец последовательно в растворах этанола начиная с 50% до 100% в течение двух-трех минут каждый. Переложите стеклянные горки внутрь сушилки критической точки, предварительно заполненной этанолом, и следуйте инструкциям производителя по сушке.

Поскольку высушенные образцы очень гидроскопичны, немедленно покройте их, прикрепив крышку к заглушкам. Затем добавьте полоску серебристой краски в верхнюю часть крышки, не создавая дегломератов краски. Убедитесь, что соединение с заглушкой является удовлетворительным.

Когда образец полностью испарится, используйте аппарат, оснащенный плазменной магнетронной напыляющей головкой и вращающейся планетарной ступенью, и следуйте стандартным протоколам, предоставленным производителем. Выполните предварительное напыление при 120 миллиамперах в течение 60 секунд, чтобы удалить оксидный слой на поверхности. Затем нанесите 1,5 нанометра вольфрама с монитором толщины пленки при 90 миллиамперах и рабочем расстоянии 50 миллилитров.

Позже храните образцы в вакууме, чтобы защитить их от окружающего воздуха до и во время анализа SEM. Для достижения высокой визуализации раствора путем обнаружения вторичных электронов с помощью внутреннего детектора установите ускоряющее напряжение на три киловольта, а ток пучка на апертуру 20 микрометров. Для наблюдений используйте разрешения в диапазоне от 21,25 нанометра на пиксель до 1,224 нанометра на пиксель.

Используйте разрешение 5,58 нанометра на пиксель для анализа данных. Установите рабочее расстояние от одного до двух миллиметров для наблюдения с высоким разрешением и около трех миллиметров, если требуется увеличенная глубина резкости. Непрерывная регулировка скорости сканирования и интеграции линий для обеспечения постоянного отношения сигнал/шум со временем захвата от 30 до 45 секунд на изображение.

Репрезентативный анализ иллюстрирует влияние материала, нанесенного на септиновые нити, на волнистые узоры PDMS с 1,5 нанометрами платины и 1,5 нанометрами вольфрама. Было замечено, что голые гигантские одноцветные везикулы, или ГУВ, были идеально сферическими. После деформации, вызванной септином, везикулы казались гранеными, а деформации оставались статичными и, следовательно, не колебались.

При более высоких концентрациях септинов наблюдались периодические деформации в везикулах. Самосборку нитей септина, связанных с большими одноламеллярными везикулами, или LUV, исследовали с помощью криоэлектронной микроскопии, а 3D-реконструкцию получали из наклонного ряда. Зависящее от кривизны расположение нитей септина визуализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии.

При малом увеличении был виден волнистый рисунок с периодичностью отрицательных и положительных кривизн. Ультраструктурная организация септиновых нитей рассматривалась при более высоком увеличении. NOA должен быть аккуратно отслоен, чтобы предотвратить деградацию.

После визуализации может быть выполнен некоторый анализ изображения для количественной оценки особенностей ультраструктуры, визуализируемых SCM, таких как расстояние между нитями и ориентация нити накала. Настоящий способ был применен к септинам, но он также может быть использован для других цитоскелетных белков или белков, которые организуются в виде длинных нитей и, таким образом, чувствительны к искривлению.