Выступ силовой микроскопии: Метод количественного определения сил, разработанный ячейки выступов

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке сил выпячивания с помощью атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем предварительной подготовки сетки с покрытием по формуле и измерения толщины этой пленки. Третий этап этого процесса заключается в рассаживании клеток на решетки и оставлении их прилипать.

Заключительным этапом процедуры является изображение пленки формы под клетками с помощью атомно-силовой микроскопии. При прилегании к субстрату микрофаги образуют субмикрометрические адгезионные структуры, называемые подосомами. В конечном счете, деформация пленки, используемая подосомами, будет количественно определена и преобразована в силы с помощью самодельной механической модели.

Поместите свет из чистого стекла этанола в устройство для литья пленки воронки и накройте верхнюю часть воронки. Вдавливайте раствор фомвара вверх в воронку до тех пор, пока уровень не достигнет двух третей горки. Оставьте его на одну минуту, затем слейте воду из раствора формвара равномерной струей.

Обратите внимание, что толщина пленки зависит как от скорости струи, так и от концентрации раствора формвара. Промокните этот огонек насухо и вырежьте прямоугольники острым лезвием бритвы. Опустите предметное стекло в стакан, наполненный дистиллированной водой, чтобы пленка фомвара всплыла на поверхность воды.

Аккуратно нанесите на пленки чистые ацетоновые сетки, блестящую лицевой стороной вверх с крышкой диаметром 12 миллиметров, наденьте поверх некоторых из них. Они будут использоваться для эксперимента по оценке толщины. В конце концов опустите предметное стекло, покрытое наклейкой, чтобы восстановить всю пленку и сетки.

Обведите обведенный стеклом лист пинцетом, чтобы вырезать формвар и отсоединить его от предметного стекла. Закрепите сетку под закрытым бланком, затем обведите сетку пинцетом, чтобы снять ее. Отверстие в созданной таким образом пленке фомвара будет визуализировано для измерения его толщины.

Установите силиконовую нитратную решетку в стеклянный блок AFM, убедившись, что золотая полоса не находится ниже кончика пружины. Установите стеклоблок на модуль АСМ, а затем поместите его на предметный столик микроскопа. Поместите защитный листок с фомварным покрытием на смотровую камеру с PBS сверху.

Отсканируйте границу между фомваром и стеклом в контактном режиме и с точкой 0,5 наноньютона. В программном обеспечении для обработки данных используйте поверхность стекла в качестве эталона высоты и измерьте толщину фомвара на поперечном сечении. Под стерильную капюшонку подберите 12-миллиметровую крышку и наклейте на нее полоску дырявого бокового скотча.

Наметьте намеченную фомавром сетку пинцетом и положите ее блестящей лицевой стороной вверх так, чтобы она только боковыми сторонами прикреплялась к клею. Это необходимо для того, чтобы предотвратить разрыв фомвара при снятии сетки с ленты. Поместите покровную полоску в стерильную шестилуночную пластину и нанесите 10-миллиметровую каплю питательной среды, не содержащей сыворотки.

Он должен содержать примерно 10 тысяч клеток и в данном случае это микрофаги, дифференцированные от моноцитов человека. Следите за тем, чтобы в процессе не задеть решетку наконечником пайпера, чтобы не повредить покрытие фомвара. Инкубируйте в течение получаса, чтобы клетки прилипли, затем заполните лунку средой, обогащенной сывороткой, и снова инкубируйте в течение двух часов, до наблюдения ОВМ.

Поместите две параллельные полоски двустороннего скотча на чашку Петри со стеклянным дном, убедившись, что ширина между ними немного меньше по сравнению с диаметром вашей сетки. Затем отсоедините предварительно засеянную клетками сетку и положите ее поверх двух полосок ленты клетками вниз. Закрепите сетку, положив две другие полоски поверх предыдущих.

Наполните посуду предварительно подогретой питательной средой с добавлением хепе. Поместите блюдо в нагреватель, предварительно установленный на 37 градусов Цельсия. Установите комплект на сцену АСМ.

Когда температура системы стабилизируется на уровне 37 градусов Цельсия, приступают к сканированию поверхности фомвара, которое должно быть выполнено в контактном режиме, с заданным значением 0,95 наноньютона и визуальными протозойными связанными деформациями на окне просмотра данных прогиба. Ниже приведены репрезентативные результаты и этапы обработки пластов с помощью АСМ для графических измерений. Как вы можете видеть на этом изображении, обнаруживаются выпуклости на поверхности фомвара.

Для того, чтобы перевести эту фотографическую информацию в силовые значения, необходимо сначала иметь доступ к локальной высокой разнице. Для этого полиномиальная аппроксимация третьей степени должна быть вычтена из его линии сканирования независимо друг от друга. Затем использование собственного специализированного алгоритма визуализации позволяет оценить значения силы выступа по карте высот АСМ и механической модели простейшего выступа, опосредованного простейшими.

Благодаря этой процедуре мы можем исследовать механизмы, участвующие в создании силы выпячивания у простейших. Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.