Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации связывания внешнего мембранного белка на поверхности мембраны нанодиска с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием в качестве первого шага к определению структуры белка с высоким разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в нескольких областях исследований, касающихся активности белков, происходящих внутри и на клеточных мембранах. Основным преимуществом этой методики являются характерные стеки нанодисковых форм, если белок не может связываться с мембранами.

Эти стеки хорошо видны с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Применение этого метода распространяется и на разработку лекарств, поскольку соединения могут быть легко проверены на способность блокировать или активировать мембранные белковые взаимодействия. Хотя этот метод может дать представление об оптимальных условиях для связывания монотопного белка с мембраной, он также обеспечивает структуру белкового нанодиска с низким разрешением.

Чтобы начать процедуру, сцедите и очистите мембранный каркасный белок, такой как MSP1E3D1. Далее с помощью стеклянного шприца с металлической иглой дозируйте 305 микролитров 25 миллиграммов на миллилитр POPC в хлороформе в стеклянную колбу с круглым дном. Выпарить хлороформ под слабой струей газообразного азота в вытяжном шкафу.

Высушите оставшиеся липиды в течение ночи в вакуумном эксикаторе. Затем растворить высушенный липидный жмых в 200 микролитрах стандартного буфера MSP, обогащенного 100 миллимолярным холатом натрия в качестве моющего средства. Вортексируйте смесь до прозрачности до получения суспензии 50 миллимоляров POPC в буфере.

Затем промойте пять граммов гидрофобных шариков 30 миллилитрами 100% метанола, затем 40 миллилитрами сверхчистой воды и, наконец, 10 миллилитрами стандартного буфера MSP. Храните шарики под 15 миллилитров стандартного буфера при температуре четыре градуса Цельсия. Затем соедините 190 микролитров 0,124 миллимолярного раствора MSP1E3D1 и 61,5 микролитров 50 миллимолярной суспензии POPC в буфере, в результате чего получится соотношение MSP к POPC один к 130 молярам и концентрация холата натрия 25 миллимоляров.

Идеальное соотношение липидов на MSP варьируется в зависимости от типа липидов и линз MSP и должно быть оптимизировано для получения однородного препарата нанодисков. Выдерживайте смесь на влажном льду в течение одного часа. Затем добавьте раствор в пробирку, содержащую 0,5 грамма промытых гидрофобных бобов на миллилитр восстановительной смеси, чтобы инициировать самосборку нанодиска.

Инкубируйте смесь при температуре четыре градуса Цельсия в течение 16 часов при семи-восьми оборотах в минуту. После инкубации дайте бусинам осесть под действием силы тяжести. Извлеките надосадочную жидкость и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к проведению эксклюзионной хроматографии.

Перед эксклюзионной хроматографией смесь центрифугируют при 13 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость и выбросьте гранулы. Уравновесьте колонку эксклюзионной хроматографии с помощью стандартного буфера MSP до тех пор, пока базовая линия на 280 нанометрах не станет стабильной.

Введите надосадочную жидкость на колонку и соберите продукт в фракции по 0,5 миллилитра. Измерьте поглощение фракций на глубине 280 нанометров с помощью УФ-видимого спектрофотометра. Рассчитайте концентрацию нанодисков с использованием молярного коэффициента экстинкции для выбранного MSP.

Чтобы провести электрофорез с неденатурирующим гелем, сначала смешайте 15 микролитров образца с пятью микролитрами соответствующего загрузочного буфера. Заполните бак катода с легким катодным буфером, а бак с анодом с бегущим буфером. Загрузите образец на гель Bis-Tris от четырех до 16% и начните прогон.

Окрасьте гель в соответствии с инструкциями производителя геля. Чтобы начать приготовление нанодискового монотопного белкового комплекса с пятью липоксигеназами в качестве белка, готовят партию стандартного буфера MSP, обогащенного 1,5 миллимоляром хлорида кальция. Экспрессируйте и очищайте белок 5LO.

Немедленно приготовьте смесь 100 микролитров 0,8 микромолярного нанодиска 5LO и 0,8 микромолярного нанодиска в стандартном буфере MSP, обогащенном кальцием. Наш пример монотопной протеиназы 5 липоксигеназы зависит от количества кальция, связывающегося с мембраной. 5LO обладает высокой чувствительностью и должен быть использован в течение нескольких часов после приготовления.

Выдержать смесь на льду в течение 10 минут. Храните полученный образец белкового комплекса нанодиска при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного месяца. Чтобы начать подготовку к анализу ПЭМ, растворите один грамм натриевой соли фосфовольфраграта в 50 миллилитрах сверхчистой воды комнатной температуры.

Отрегулируйте pH раствора до 7,4 с помощью одномолярного раствора гидроксида натрия. Отфильтруйте раствор фосфовольфрамата натрия через шприцевой фильтр 0,22 микрометра и храните раствор при комнатной температуре. Затем тлеющий разряд медной сетки с углеродным покрытием 400 меш в течение 20 секунд при 30 миллиамперах, чтобы сделать поверхность сетки гидрофильной.

Поместите от 2,5 до 5 микролитров образца монотопного белкового комплекса нанодиска на сетку и дайте образцу постоять в течение 30 секунд. Затем с помощью фильтровальной бумаги промокните излишки раствора от сетки. Немедленно нанесите каплю раствора фосфовольфрамата натрия и дайте раствору настояться в течение 30 секунд.

Промокните излишки раствора и дайте сетке высохнуть на воздухе. Выполняют просвечивающую электронную микроскопию с ускоренным напряжением от 120 до 200 киловольт. Исключите изображения с длинными стеками из последующей обработки изображений.

Для выбранных изображений используйте стандартные методы обработки для определения средних классов и создания 3D-модели монотопного белка нанодиска с низким разрешением. С помощью этого метода получали пустые нанодиски с соотношением белков мембранного каркаса к липидам один к 130. Только один основной пик наблюдался во время эксклюзионной хроматографии и только одна полоса наблюдалась при электрофорезе с синим нативным гелем.

Когда пустые нанодиски обрабатываются раствором соли фосфовольфрамата, происходит укладывание. Эти длинные стеки затем можно наблюдать с помощью ПЭМ. Это накопление не было нарушено включением ионов кальция в раствор нанодиска перед применением раствора фосфовольфрамата натрия.

Когда монотопный белок, такой как пять липоксигеназа, связывается с поверхностью нанодиска, накопление затрудняется стеариновой обструкцией белка. Обе стороны нанодиска доступны для связывания, что позволяет формировать комплексы нанодисков 5LO один к одному и два к одному. Образец из двух к одному комплексов нанодисков 5LO показал меньшую укладку, чем образец один к одному.

Связывание 5LO требует присутствия ионов кальция. Это было подтверждено наблюдением укладки в смеси 5LO и нанодисков без кальция, что указывало на то, что 5LO не связывался с мембранными поверхностями. После того, как монотопный белок и нанодиски подготовлены, оценка связывания белка с мембраной может быть проведена во второй половине дня, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно оценить площадь белка на нанодиске, чтобы выбрать правильную длину MSP. Для хорошо подобранных размеров, максимум два внешних белка могут связываться по одному с каждой стороны диска. Также важно, что для обеспечения максимальной укладки для обеспечения максимальной укладки используется натриевая соль фософовольфрама, так как связывание подтверждается сравнением отсутствия стопок с длинными стеками образца без монотопного белка.

Использование нанодисков вместо липосом позволяет использовать динамическое рассеяние света, малоугловое рассеяние рентгеновских лучей для ответа на дополнительные вопросы об однородности образца, размере или молекулярной структуре. Трехмерная структура с низким разрешением монотопного мембранного белка, связанного с нанодиском, может стать легко доступным первым шагом на пути к структуре с высоким разрешением этих связанных белков.