Измерение активности протеасом в различных субклеточных компартментах мозга крысы

Начните с субклеточных ядерных и синаптических фракций, собранных из латеральной миндалины мозга крыс с контрольной обусловливанием и обусловленностью страха.

Каждая субклеточная фракция содержит различные концентрации 20S протеасом, каталитического ядра протеасомного комплекса, ответственного за деградацию нежелательных клеточных белков.

Добавьте в образцы буфер для анализа, содержащий АТФ, и субстрат из флуорогенных пептидов и инкубируйте.

В присутствии АТФ протеасома расщепляет флуорогенный пептид, высвобождая свободные флуорогенные молекулы.

С помощью планшетного ридера измеряйте интенсивность флуоресценции через равные промежутки времени.

Количественно оцените флуоресценцию, сравнив ее с известными стандартными концентрациями флуорогенной молекулы.

Интенсивность флуоресценции пропорциональна активности протеасом в образце.

Повышенная активность протеасом в ядерной фракции крыс с состоянием страха предполагает изменения в экспрессии генов, связанных с памятью, в то время как снижение активности в синаптической фракции указывает на изменения в экспрессии синаптических белков, необходимых для поддержания долговременной памяти.

Чтобы настроить пробу, предварительно прогрейте планшет до 37 градусов по Цельсию и продержите до конца прогона. Установите Возбуждение на 360 нанометров, а Излучение на 460 нанометров. Если используемая пластина с 96 лунками свободна, установите положение оптики в положение Bottom. Если используется темный 96-луночный планшет, установите положение оптики в положение Top. Запрограммируйте кинетический прогон со временем 2 часа, сканирование каждые 30 минут.

Восстановите 20s 10x пробирный буфер, входящий в комплект, с 13,5 миллилитрами сверхчистой воды. Добавьте 14 микролитров 100 миллимолярных АТФ в буфер теперь 1x. Это значительно повышает активность протеасом в образцах и повышает надежность анализа. Восстановите стандарт AMC, входящий в комплект, со 100 микролитрами ДМСО. Выполняйте действия с использованием стандарта AMC в темноте или в условиях низкой освещенности, так как стандарт является светочувствительным.

Создание стандартной кривой AMC из ряда концентраций AMC от высокой до низкой. Эта кривая будет использоваться для калибровки планшетов и анализа активности протеасом в гомогенизированных образцах. Восстановите субстрат протеасом, входящий в комплект, с 65 микролитрами ДМСО. Также выполняйте этот этап в темное время суток или в условиях низкой освещенности, так как подложка чувствительна к свету.

Затем создайте разведение субстрата протеасомы в соотношении 1:20 в новой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, используя буфер для анализа 20 S. Добавьте нормированное количество желаемых образцов в 96-луночный планшет. Запустите каждый образец в двух экземплярах. Количество необходимого образца варьируется в зависимости от подготовки ткани. Как правило, от 10 до 20 микрограммов достаточно для любой субклеточной фракции.

Доведите объем лунки с образцом до 80 микролитров с помощью сверхчистой воды. Добавляемое количество зависит от объема добавленного образца. В две отдельные лунки добавьте 80 микролитров воды в одиночку. Это и будут заготовки для пробы. Добавьте по 10 микролитров пробирного буфера 20 S в каждую лунку, включая пробирные заготовки. Используйте репитер или автоматизированную пипетку, чтобы обеспечить равномерный объем анализа в лунках.

Выключите свет или войдите в темную комнату. Добавьте все 100 микролитров разбавленных стандартов AMC в новую лунку, используя одну лунку для каждой нормы. В темное время суток используйте репитер или автоматизированную пипетку, чтобы добавить 10 микролитров разбавленного протеасомного субстрата в лунки, содержащие образцы и пробирные бланки, но не в соответствии со стандартом AMC. Поместите пластину в считыватель пластин и начните кинетический прогон.