Измерение множественных митохондриальных параметров в нейронах с помощью проточной цитометрии
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 2:09 мин • July 8th, 2025
Возьмите неподвижные и пермеабилизированные нейроны в трубке.
Добавьте блокирующий буфер для предотвращения связывания неспецифических антител.
Центрифугируйте суспензию и удалите надосадочную жидкость. Затем восстановите нейроны в буфере.
Равномерно перенесите суспензию в пробирки, содержащие первичные антитела, не помеченные и помеченные флуорофорами.
Инкубация, позволяющая антителам специфически связываться с митохондриальной дыхательной цепью или субъединицами комплекса MRC, белком, связанным с митохондриальной ДНК, и белком внешней мембраны митохондрий внутри нейронов.
Удалите все несвязанные антитела.
Инкубируйте с меченными флуорофорами вторичными антителами, которые связываются с немеченными первичными антителами.
Центрифугируйте смесь и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте нейроны в буфере и перенесите их в микроцентрифужные пробирки.
Проточную цитометрию проводят для обнаружения флуоресцентных сигналов на меченых нейронах, соответствующих уровням экспрессии субъединиц комплекса MRC и измерению относительных уровней митохондриальной ДНК.
Заблокируйте образцы в 1 миллилитре блокирующего буфера и промойте клетки центрифугированием с PBS, как показано на рисунке. Чтобы обнаружить различные митохондриальные комплексы и субъединицы, инкубируйте клетки в течение 30 минут с соответствующими первичными антителами, описанными в рукописи текста. После однократной промывки клеток PBS инкубируйте клетки со вторичными антителами в течение 30 минут.
В конце инкубации промойте и повторно суспендируйте клетки в PBS, как показано на рисунке. Переложите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, храните в темноте, на льду. Затем проанализируйте клетки на проточном цитометре, обнажите сигналы и отфильтруйте один из них с помощью полосового фильтра 530/30.
Обзор
В данной статье описывается протокол анализа субъединиц комплексов митохондриальной дыхательной цепи в фиксированных и пермеабилизированных нейронах с помощью проточной цитометрии. Метод основан на использовании антительного мечения для детекции специфических митохондриальных белков и оценки уровней митохондриальной ДНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология митохондрий
Теоретические основы
- Митохондрии играют ключевую роль в энергетическом метаболизме клеток.
- Понимание функций митохондрий необходимо для изучения нейродегенеративных заболеваний.
- Проточная цитометрия позволяет проводить количественный анализ специфических белков в клетках.
- Маркировка антителами является распространенным методом визуализации и измерения экспрессии белков.
Цель исследования
- Разработать надежный метод детектирования митохондриальных белков в нейронах.
- Измерить уровни экспрессии субъединиц комплексов митохондриальной дыхательной цепи.
- Оценить относительные уровни митохондриальной ДНК в образцах нейронов.
Используемые методы
- Подготовка фиксированных и пермеабилизированных нейронов.
- Блокирование неспецифического связывания антител с помощью блокирующего буфера.
- Инкубация со специфическими первичными антителами к митохондриальным белкам.
- Проточная цитометрия для детектирования флуоресцентных сигналов от меченых нейронов.
Основные результаты
- Успешное мечение субъединиц комплексов дыхательной цепи митохондрий.
- Количественное определение уровней митохондриальной ДНК в образцах нейронов.
- Демонстрация эффективности метода проточной цитометрии.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный подход к изучению функций митохондрий в нейронах.
- Проточная цитометрия является эффективным инструментом для анализа экспрессии белков в фиксированных клетках.
- Этот метод может быть применен в различных исследованиях, связанных с биологией митохондрий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет проводить количественную оценку экспрессии митохондриальных белков в нейронах, что способствует валидации мишеней при исследовании нейродегенеративных заболеваний. Измеряя субъединицы комплексов митохондриальной дыхательной цепи и относительные уровни митохондриальной ДНК, этот подход обеспечивает механистическое снижение рисков для терапевтических гипотез на ранних стадиях. Метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, обеспечивая воспроизводимые результаты с помощью проточной цитометрии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать экспрессию митохондриальных белков для валидации терапевтических мишеней при нейродегенерации.
- Практическая ценность: обеспечивает количественное определение на основе антител для функциональной оценки мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем установления связи между модуляцией мишени и функцией митохондрий.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных сигналов флуоресценции для субъединиц митохондриальных комплексов.
- Воспроизводимость: позволяет проводить согласованные измерения в образцах нейронов с использованием фиксированных и пермеабилизированных клеток.
- Масштабируемость: совместимость с высокопроизводительной проточной цитометрией для многопараметрического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: Применимо непосредственно к нейрональным моделям нейродегенеративных и метаболических расстройств.
- Трансляционная непрерывность: Обеспечивает переход от этапа валидации мишени на стадии поиска к доклинической оценке функций митохондрий.
- Решения с учетом рисков: Позволяет определить критерии принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе пороговых значений экспрессии митохондриальных белков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя измерять параметры митохондрий после взаимодействия с мишенью и до функциональной валидации.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез путем количественного определения уровней митохондриальных белков в ответ на возмущения.
- Скрининг: Обеспечивает получение количественных данных, готовых к анализу, для оценки влияния соединений на митохондриальные мишени.
- Аналитика: Предоставляет многопараметрические данные проточной цитометрии для сравнения условий обработки и оценки специфичности мишени.
- Трансляционные исследования: Связывает раннюю модуляцию мишени с состоянием митохондрий в нейронных системах, имеющих значение для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: Создает многоразовую платформу для профилирования митохондрий в различных моделях нейронных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет прямого измерения экспрессии митохондриальных белков.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам маркировки антителами и проточной цитометрии.
- Стратегическая ценность: улучшает приоритизацию портфеля за счет устранения механистической неопределенности в программах, направленных на митохондрии.
- Влияние на портфель: позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении на основе количественных митохондриальных биомаркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке, фиксации и пермеабилизации нейрональных клеток.
- Зависит от наличия проточного цитометра с соответствующими возможностями детектирования флуоресценции.
- Необходима валидация антител к конкретным митохондриальным мишеням для исключения перекрестной реактивности.
- Требуется оптимизация этапов инкубации антител и промывки для достижения оптимального соотношения сигнал/шум.
- Метод ограничен использованием фиксированных клеток; не подходит для изучения динамики митохондрий в живых клетках.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse
Похожие видео
0 Просмотры
Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии
Похожие видео
0 Просмотры
Проточный цитометрический анализ биомаркеров апоптоза в клетках рака шейки матки SiHa, обработанных актиномицином D
Похожие видео
0 Просмотры
Использование первичных фибробластов человека для мониторинга митохондриальной фенотипы в области болезни Паркинсона
Похожие видео
0 Просмотры
Иммунологический из белков наружной мембраны с помощью проточной цитометрии из изолированных митохондрий
Похожие видео
0 Просмотры
Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Улучшение точности потока цитометрической оценки митохондриальной Мембраны потенциал в гематопоитических стволовых и прародителей клеток через ингибирование Efflux насосов
Похожие видео
0 Просмотры
Одновременное циклометрическое использование потока нескольких типов клеток, извлеченных из мозга мыши / спинного мозга с помощью различных методов гомогенизации
Похожие видео
0 Просмотры
Измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала в гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках по цитометрии потока
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ митохондриального транспорта и морфологии в антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов в наследственной спастической параплегии
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026