Каково значение митохондриальных белков в нейронах?

Митохондриальные белки необходимы для производства энергии и клеточного метаболизма, влияя на здоровье и функционирование нейронов.

Как работает проточная цитометрия в этом контексте?

Проточная цитометрия анализирует физические и химические характеристики клеток, пропуская их через лазер и обнаруживая излучаемую флуоресценцию.

Каковы основные трудности при маркировке митохондриальных белков?

Основные трудности включают предотвращение неспецифической связи и обеспечение адекватного проникновения антител в митохондриальные мембраны.

Можно ли использовать этот метод для других типов клеток?

Да, протокол может быть адаптирован для различных типов клеток, требующих анализа митохондрий.

Какие применения этого исследования?

Применения включают исследования нейродегенеративных заболеваний, метаболических расстройств и митохондриальных дисфункций.

Как можно интерпретировать результаты?

Результаты могут указывать на здоровье митохондрий и их роль в функционировании нейронов и заболеваниях.

Измерение множественных митохондриальных параметров в нейронах с помощью проточной цитометрии

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:09 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возьмите неподвижные и пермеабилизированные нейроны в трубке.

Добавьте блокирующий буфер для предотвращения связывания неспецифических антител.

Центрифугируйте суспензию и удалите надосадочную жидкость. Затем восстановите нейроны в буфере.

Равномерно перенесите суспензию в пробирки, содержащие первичные антитела, не помеченные и помеченные флуорофорами.

Инкубация, позволяющая антителам специфически связываться с митохондриальной дыхательной цепью или субъединицами комплекса MRC, белком, связанным с митохондриальной ДНК, и белком внешней мембраны митохондрий внутри нейронов.

Удалите все несвязанные антитела.

Инкубируйте с меченными флуорофорами вторичными антителами, которые связываются с немеченными первичными антителами.

Центрифугируйте смесь и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте нейроны в буфере и перенесите их в микроцентрифужные пробирки.

Проточную цитометрию проводят для обнаружения флуоресцентных сигналов на меченых нейронах, соответствующих уровням экспрессии субъединиц комплекса MRC и измерению относительных уровней митохондриальной ДНК.

Заблокируйте образцы в 1 миллилитре блокирующего буфера и промойте клетки центрифугированием с PBS, как показано на рисунке. Чтобы обнаружить различные митохондриальные комплексы и субъединицы, инкубируйте клетки в течение 30 минут с соответствующими первичными антителами, описанными в рукописи текста. После однократной промывки клеток PBS инкубируйте клетки со вторичными антителами в течение 30 минут.

В конце инкубации промойте и повторно суспендируйте клетки в PBS, как показано на рисунке. Переложите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, храните в темноте, на льду. Затем проанализируйте клетки на проточном цитометре, обнажите сигналы и отфильтруйте один из них с помощью полосового фильтра 530/30.