Why measure mitochondrial respiratory chain subunits for target validation?

Quantifying mitochondrial respiratory chain complex subunits enables assessment of target engagement effects on neuronal energy metabolism, supporting mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.

How does isolating mitochondrial protein expression as an independent variable support discovery pipelines?

Isolating mitochondrial protein expression allows researchers to link specific targets or compounds to changes in energy metabolism, clarifying biological function in early discovery.

What do quantitative measurements of mitochondrial DNA levels enable in neuronal studies?

Quantitative mitochondrial DNA measurements provide a proxy for mitochondrial content and biogenesis, enabling normalization of functional readouts and assessment of organelle density.

Why are replication requirements important for cross-functional collaboration in mitochondrial profiling?

Replication ensures consistent, reproducible quantification of mitochondrial parameters across teams and sites, supporting reliable data transfer in target validation and assay development.

What statistical analysis capabilities are required before implementing this flow cytometry method?

Implementation requires the ability to analyze mean fluorescence intensity, calculate coefficients of variation, and apply statistical tests to compare mitochondrial protein expression across experimental conditions.

Измерение множественных митохондриальных параметров в нейронах с помощью проточной цитометрии

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:09 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возьмите неподвижные и пермеабилизированные нейроны в трубке.

Добавьте блокирующий буфер для предотвращения связывания неспецифических антител.

Центрифугируйте суспензию и удалите надосадочную жидкость. Затем восстановите нейроны в буфере.

Равномерно перенесите суспензию в пробирки, содержащие первичные антитела, не помеченные и помеченные флуорофорами.

Инкубация, позволяющая антителам специфически связываться с митохондриальной дыхательной цепью или субъединицами комплекса MRC, белком, связанным с митохондриальной ДНК, и белком внешней мембраны митохондрий внутри нейронов.

Удалите все несвязанные антитела.

Инкубируйте с меченными флуорофорами вторичными антителами, которые связываются с немеченными первичными антителами.

Центрифугируйте смесь и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте нейроны в буфере и перенесите их в микроцентрифужные пробирки.

Проточную цитометрию проводят для обнаружения флуоресцентных сигналов на меченых нейронах, соответствующих уровням экспрессии субъединиц комплекса MRC и измерению относительных уровней митохондриальной ДНК.

Заблокируйте образцы в 1 миллилитре блокирующего буфера и промойте клетки центрифугированием с PBS, как показано на рисунке. Чтобы обнаружить различные митохондриальные комплексы и субъединицы, инкубируйте клетки в течение 30 минут с соответствующими первичными антителами, описанными в рукописи текста. После однократной промывки клеток PBS инкубируйте клетки со вторичными антителами в течение 30 минут.

В конце инкубации промойте и повторно суспендируйте клетки в PBS, как показано на рисунке. Переложите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, храните в темноте, на льду. Затем проанализируйте клетки на проточном цитометре, обнажите сигналы и отфильтруйте один из них с помощью полосового фильтра 530/30.