Визуализация внутриклеточного транспорта груза в культивируемых астроцитах

Начните с адгезивной культуры первичных астроцитов мыши на покровном листе в чашке для культивирования.

Инкубируйте с помощью флуоресцентного ацидотропного зонда, который пересекает неповрежденные клеточные мембраны для проникновения в астроциты.

Зонд избирательно накапливается внутри кислых эндолизосомальных везикул и флуоресцентно помечает везикулы для контроля их транспортировки.

Вымойте для удаления излишков щупа и добавьте свежую среду.

Поместите культуру под конфокальный микроскоп и сфокусируйтесь на одной клетке, чтобы выполнить покадровую визуализацию.

Визуализируйте маркированный груз в виде флуоресцентных точек, распределенных в перинуклеарной области,

цитозоля и астроцитарных процессов.

Захват нескольких фокальных плоскостей вдоль оси Z для визуализации груза по всему объему трехмерной ячейки.

Выполняйте визуализацию через определенные промежутки времени, чтобы отслеживать внутриклеточный транспорт груза на различных глубинах в астроцитах.

Проанализируйте движение груза, чтобы отличить неподвижный груз, груз, движущийся к периферии клетки, и груз, движущийся к ядру.

За 30 минут до визуализации разведите подходящий зонд лизосомального мечения в 200 микролитрах питательной среды астроцитов до рабочей концентрации 1 микромоляр и пометьте астроциты зондом в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте клетки один раз теплой средой для культивирования астроцитов и замените промывку средой для визуализации.

Сразу после маркировки зонда поместите контейнер для культивирования астроцитов в соответствующий адаптер на предметном столике микроскопа. И с помощью эпифлуоресцентного света найти клетки, которые экспрессируют флуоресцентные белки или зонд. Используйте цифровую камеру для регулировки освещенности флуоресцентного образца для визуализации выбранных ячеек, а также для регулировки фокуса и масштабирования в одной ячейке.

Затем используйте функции масштабирования и определенного фокуса, чтобы получить один ряд интервальной съемки C-стека с частотой один кадр каждые две секунды в интервалах времени от 300 до 500 секунд. Сохраняйте и экспортируйте покадровые изображения в виде файлов Avi или TIFF.