Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

Общая цель эксперимента — оценить временной ход выведения глутамата из астроцитарных мембран после его высвобождения из возбуждающих синапсов. Первым шагом в этом процессе является регистрация возникновения синаптически активированного транспорта глутамата из астроцитов в острых срезах мозга в отсутствие и в присутствии субнасыщающей концентрации антагониста переносчика глутамата широкого спектра действия, TBOA. Второй шаг заключается в анализе записей с целью выделения синаптически активированных потоков переносчика глутамата от всех других компонентов вызванной реакции.

Затем временной ход фильтра оценивается путем анализа потоков переноса, зарегистрированных в присутствии TBOA, путем de с участием фильтра от события переноса, зарегистрированного в контролируемых условиях. Получен временной ход клиренса глутамата из астроцитарных мембран. Результаты показывают, что в гиппокампе мыши астроцитам требуется всего несколько миллисекунд для удаления синаптически высвобождаемого глутамата из внеклеточной пространственной базы.

Этот подход обеспечивает чувствительный инструмент для обнаружения изменений способности астроцитов к поглощению в различных областях мозга при физиологических и патологических состояниях. Основное преимущество этого подхода перед другими методами, основанными, например, на анализе смещения быстро диссоциирующих антагонистов глутаматных рецепторов на флуоресцентных индикаторах глутамата или на компьютерном моделировании диффузионных реакций, заключается в том, что он обеспечивает высокое временное разрешение, прямое экспериментальное считывание клиренса глутамата из астроцитов. Этот метод позволяет нам понять пространственную и временную динамику синаптической передачи в мозге.

Это может помочь нам интерпретировать патофизиологические изменения глутамата, диффузии и поглощения, которые могут произойти при определенных неврологических расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера. Начните эту процедуру с того, что сделайте пять надрезов на рассеченном мозге мыши скальпелем. Во-первых, удалите обонятельные луковицы и лобную кору.

Во-вторых, удалите мозжечок. Далее удалите левую и правую височные доли. Затем разделите два полушария мозга с помощью сагиттального разреза.

Далее приклейте боковую поверхность каждого участка мозга к холодной плите основания вибрама. Тыльная сторона мозга должна быть обращена к лезвию вибрама, а вентральная сторона мозга должна соприкасаться с агаровым блоком вдали от лезвия вибрато. Затем закрепите опорную пластину вибрато в камере для препарирования.

Установите толщину ломтика на 250 микрометров и отрегулируйте ширину лезвия перед нарезкой. После того, как лезвие пройдет через кору головного мозга и гиппокамп, используйте скальпель, чтобы отрезать кору гиппокампа от среднего мозга. Затем поместите ломтик в камеру погружения при температуре 34 градуса Цельсия после того, как ломтики будут храниться при температуре 34 градуса Цельсия в течение 30 минут.

Дайте им остыть до комнатной температуры в течение 30 минут, прежде чем использовать их для электрофизиологической записи в этой процедуре, перенесите срез в записывающую камеру. Визуально осмотрите срез под точечной подсветкой или I-R-D-I-C. Астроциты можно идентифицировать по их маленькому клеточному телу и выступающему ядру для синаптической стимуляции.

Поместите биполярный электрод из нержавеющей стали на расстоянии около 100 микрометров от астроцита, который вы планируете залатать. Заплатите астроцит и нарушите всю конфигурацию клетки, применив очень мягкую аспирацию. Затем чередуйте одиночные и парные стимулы каждые 10-20 секунд, чтобы изолировать облегченные части синаптически активированного транспортного явления.

Сначала в среднем получено не менее 20 разверток при парной стимуляции в контролируемых условиях и в присутствии 10 микромолярного антагониста глутаматного транспортера широкого спектра действия. Затем TBOA усредняет идентичное количество разверток, полученных при одиночных стимуляциях в контрольных условиях, и в 10 микромолярных TBOA вычитает среднюю кривую, полученную при одиночных стимуляциях, из средней кривой, полученной при парной стимуляции. Этот шаг позволяет изолировать геометрический STO и устойчивый ток калия, вызванный вторым стимулом.

Следующий сдвиг средней кривой, полученной при одиночных стимуляциях, на интервал времени, который совпадает с интервалом PUL, используемым для доставки парных импульсов, вычитает смещенный по времени средний отклик, полученный при одиночных стимуляциях, из среднего ответа на второй стимул, полученный ранее. На этом этапе изолируется облегченная часть тока транспортера, вызванная вторым стимулом. В большинстве случаев этот шаг полностью устраняет устойчивый ток калия.

Если это так, выделение FSTC завершено, и вы можете приступить к анализу деконволюции и определить временной ход выведения глутамата из астроцитов. Однако в некоторых случаях небольшой устойчивый ток калия все еще присутствует, и требуется дальнейший анализ. Измерьте амплитуду постоянного калийного тока, оставшегося после выполнения.

В описанном ранее анализе амплитуда моноэкспоненциальной функции масштабировалась до амплитуды остаточного устойчивого калийного тока, устанавливая амплитуду измеренного устойчивого калийного тока в качестве a в этом уравнении. Но постоянная времени нарастания представляет собой среднее значение нарастания, оцененное в отдельных экспериментах, в которых выделяется устойчивый ток калия. Фармакологически используя высокую насыщающую концентрацию TBOA, затем вычтите результирующую моноэкспоненциальную функцию из FSTC и устойчивого тока калия.

Завершить изоляцию ФСТК. Для изоляции вспышки активируется транспортное явление. Усреднить не менее 20 разверток, полученных при открытом световом тракте в контрольных условиях и в 10 микромолярных TBOA, затем усреднить такое же количество разверток, полученных при закрытом световом тракте в контрольных условиях, и в 10 микромолярных TBOA вычесть среднюю трассировку, полученную при заблокированном световом тракте, из средней кривой, полученной при открытом световом тракте.

Этот шаг позволяет удалить артефакт стимула и изолировать FTC на этом шаге подогнать транспортный ток либо FSTC, либо FTC, зарегистрированный в контрольных условиях и в 10 микромолярных TBOA, и подогнать их с помощью мультиэкспоненциальной функции, создать мгновенно нарастающую функцию, которая затухает моноэкспоненциально в соответствии с этой функцией и которая лучше всего описывает фазу затухания транспортного тока, зарегистрированного на 10 микромолярных TBOA. Затем делегируем моноэкспоненциальную функцию из подгонки тока транспортера, зарегистрированного в 10 микромолярных TBOA, для получения фильтра. Затем отключите фильтр от подгонки транспортера тока в контролируемых условиях.

Чтобы получить количественную оценку общего временного хода клиренса глутамата, рассчитайте OID формы волны при попытке выполнить эту процедуру. Важно подтвердить, что случаи переноса регистрируются в экспериментальных условиях, когда фильтр работает в линейном режиме и вносит только линейные искажения переноса. Волна тока от них может быть выполнена путем проверки манипуляций, которые изменяют величину транспортного тока.

Не меняйте его курс штампа. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать астроцитарные записи для извлечения информации о глутамате, диффузии и поглощении в мозге.