Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

Общая цель эксперимента заключается в оценке временного хода клиренса глутамата с мембран астроцитов после его высвобождения из возбуждающих синапсов. Первый этап этого процесса состоит в регистрации синаптически активируемого транспорта глутамата астроцитами в острых срезах мозга в отсутствие и в присутствии субнасыщающей концентрации TBOA — антагониста транспортеров глутамата широкого спектра действия. Второй этап заключается в анализе записей для выделения токов синаптически активируемых транспортеров глутамата из всех остальных компонентов вызванного ответа.

Затем оценивается временная зависимость фильтрации путем анализа токов транспортеров, зарегистрированных в присутствии TBOA, путем вычитания фильтра из процесса транспорта, зафиксированного в контрольных условиях. Таким образом определяется временной ход клиренса глутамата из мембран астроцитов. Результаты показывают, что в гиппокампе мыши астроцитам требуется всего несколько миллисекунд, чтобы удалить синаптически высвобожденный глутамат из внеклеточного пространства.

Данный подход представляет собой чувствительный инструмент для обнаружения изменений способности астроцитов к поглощению в различных областях мозга при физиологических и патологических условиях. Главным преимуществом этого подхода перед другими методами, основанными, например, на анализе вытеснения быстро диссоциирующих антагонистов глутаматных рецепторов с флуоресцентных индикаторов глутамата или на компьютерном моделировании диффузионных реакций, является высокое временное разрешение и возможность прямого экспериментального считывания клиренса глутамата астроцитами. Этот метод позволяет понять пространственную и временную динамику синаптической передачи в головном мозге.

Это может помочь нам интерпретировать патофизиологические изменения уровней глутамата, его диффузии и поглощения, которые могут возникать при определенных неврологических расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера. Начните выполнение данной процедуры с нанесения пяти разрезов скальпелем на препарированный мозг мыши. Сначала удалите обонятельные луковицы и фронтальную кору.

Во-вторых, удалите мозжечок. Затем удалите левую и правую височные доли. После этого разделите два полушария головного мозга срезом по срединной сагиттальной плоскости.

Затем приклейте латеральную поверхность каждого среза мозга к охлаждаемой основанию вибротома. Дорсальная сторона мозга должна быть обращена к лезвию вибротома, а вентральная сторона должна соприкасаться с блоком агара, расположенным в стороне от лезвия. После этого закрепите основание вибротома в препарирующей камере.

Установите толщину среза 250 micrometers и отрегулируйте ширину лезвия перед началом нарезки. После того как лезвие пройдет через кору и гиппокамп, используя скальпель, отделите кору и гиппокамп от среднего мозга. Затем поместите срез в иммерсионную камеру при 34 degrees Celsius, предварительно выдержав срезы при 34 degrees Celsius в течение 30 минут.

Оставьте их охлаждаться при комнатной температуре в течение 30 минут перед началом электрофизиологических записей в данной процедуре, затем перенесите срез в регистрирующую камеру. Визуально осмотрите срез при точечном освещении или с помощью IR-DIC. Астроциты можно идентифицировать по небольшому телу клетки и выраженному ядру для синаптической стимуляции.

Поместите биполярный электрод из нержавеющей стали на расстоянии около 100 micrometers от астроцита, который вы планируете подвергнуть патч-клампированию. Выполните патч-клампирование астроцита и перейдите в конфигурацию целого This cell (whole cell), приложив очень осторожное всасывание. Затем через каждые 10–20 seconds чередуйте одиночные и парные стимулы, чтобы выделить облегченные порции синаптически активируемого транспорта.

Сначала усредните не менее 20 разрядов, полученных при парной стимуляции в контрольных условиях, а также в присутствии 10 micromolar антагониста глутаматных транспортеров широкого спектра TBOA. Затем усредните такое же количество разрядов, полученных при одиночной стимуляции в контрольных условиях и в присутствии 10 micromolar TBOA. Вычтите из усредненного следа, полученного при парной стимуляции, усредненный след, полученный при одиночной стимуляции. Этот шаг позволяет изолировать геометрическую составляющую STO и устойчивый калиевый ток, вызванный вторым стимулом.

Затем сдвиньте среднюю кривую, полученную при одиночных стимуляциях, по времени на интервал, соответствующий интервалу PUL, используемому для подачи парных импульсов, и вычтите этот сдвинутый по времени средний ответ, полученный при одиночных стимуляциях, из среднего ответа на второй стимул, полученного ранее. Этот этап позволяет выделить облегченную часть тока транспортера, вызванную вторым стимулом. В большинстве случаев на этом этапе устойчивый калиевый ток удаляется полностью.

Если это так, выделение FSTC завершено, и вы можете приступить к деконволюционному анализу, чтобы определить временную зависимость клиренса глутамата из астроцитов. Однако в некоторых случаях может сохраняться небольшой устойчивый калиевый ток, что потребует дальнейшего анализа. Измерьте амплитуду устойчивого калиевого тока, остающегося после выполнения процедуры.

В описанном ранее анализе амплитуда моноэкспоненциальной функции масштабируется до амплитуды остаточного стационарного калиевого тока путем задания амплитуды измеренного стационарного калиевого тока в качестве значения a в данном уравнении. При этом константа времени нарастания представляет собой среднее значение нарастания, определенное в отдельных экспериментах, в которых стационарный калиевый ток изолировался фармакологическим путем с использованием высокой насыщающей концентрации TBOA; затем полученная моноэкспоненциальная функция вычитается из FSTC и стационарного калиевого тока.

Для завершения изоляции FSTC. Для изоляции вспышкой-активируемого транспорта. Вычислите среднее значение как минимум для 20 разверток, полученных при открытом световом пути в контрольных условиях и при добавлении 10 micromolar TBOA, затем вычислите среднее значение для такого же количества разверток, полученных при закрытом световом пути в контрольных условиях и при добавлении 10 micromolar TBOA; вычтите средний след, полученный при заблокированном световом пути, из среднего следа, полученного при открытом световом пути.

Данный этап позволяет удалить артефакт стимуляции и изолировать FTC. На этом этапе аппроксимируйте транспортный ток (либо FSTC, либо FTC), зарегистрированный в контрольных условиях и при воздействии 10 µM TBOA, используя мультиэкспоненциальную функцию. Создайте функцию с мгновенным нарастанием и моноэкспоненциальным затуханием, которая наилучшим образом описывает фазу спада тока транспортера, зарегистрированного при 10 µM TBOA. Затем вычтите моноэкспоненциальную функцию, полученную при аппроксимации тока транспортера при 10 µM TBOA, чтобы вывести фильтр. После этого примените данный фильтр к результатам аппроксимации тока транспортера в контрольных условиях.

Для получения количественной оценки общего временного хода клиренса глутамата рассчитайте OID формы сигнала. При выполнении этой процедуры важно убедиться, что процессы транспорта регистрируются в экспериментальных условиях, при которых фильтр работает в линейном режиме и вносит только линейные искажения тока транспорта. Это можно сделать путем проверки манипуляций, изменяющих величину тока транспорта.

Не меняйте ход его хода. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать регистрацию активности астроцитов для извлечения информации о глутамате, его диффузии и поглощении в головном мозге.