Мониторинг Равновесие Изменения в структуре РНК "Peroxidative» и «Окислительный" гидроксильных радикалов Footprinting

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы выяснить, как молекулы РНК сворачиваются с использованием отпечатка гидроксильных радикалов. Это достигается путем мечения концов, очистки геля и предварительного сворачивания РНК, что обеспечивает подтверждающую целостность РНК до того, как магниево-опосредованное сворачивание На следующем этапе реагенты Фентона смешивают для получения гидроксильных радикалов, которые впоследствии могут расщеплять остов РНК в соответствии с его доступностью для растворителей. Затем продукты расщепления РНК отделяются с помощью денатурирующего электрофореза полиакриламидным гелем и визуализируются с помощью авторентгенографии.

Интегралы полос количественно оцениваются с помощью полуавтоматического программного обеспечения для анализа посадочных зон. Конечная цель состоит в том, чтобы получить фолдинговые изотермы, отражающие третичное структурообразование РНК. Это достигается путем масштабирования нормализованных интегралов по полосам до дробного насыщения.

Изотермы впоследствии могут быть подогнаны к уравнению холма. Основное преимущество гидроксислединга заключается в том, что вы получаете третичную информацию о структуре РНК с использованием недорогих химикатов, поскольку благодаря более высокой активности гидроксирадикалов малого размера являются идеальными зондами для различения доступных растворителей и скрытых нуклеотидов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области структурной биологии РНК.

Например, как рибосомы используют ионы металлов для достижения своего активного подтверждения? След гидроксирадикала может быть использован для понимания основ специфичности и распознавания РНК. Помимо получения информации о третичной структуре РНК, этот метод может быть использован для определения точных сайтов связывания белков в РНК или в молекулах ДНК.

Основными задачами этого метода являются предотвращение деградации образца рибонуклеазой и оптимизация концентрации железа для получения нужного количества расщепления РНК. Кроме того, детальный анализ интервалов полос может быть довольно сложным. Основное преимущество этого видео заключается в том, что оно помогает аудитории понять этапы планирования и успешного проведения эксперимента с гидроксирадикальным следом Перед началом этого протокола подготовьте весь след в реагентах, как описано в письменном протоколе.

В этом видео показано, что РНК может быть продуцирована четырьмя связанными и помеченными концами, как описано здесь. Очистите радиоактивно меченую РНК с помощью электрофереза с денатурирующим гелем. Восстановите очищенную РНК путем двух последовательных экстракций гелем с использованием 0,3 моляра ацетата натрия.

Затем осадите РНК, смешав 0,5 миллилитра водного раствора с одним миллилитром этанола. Выдержите смесь в течение одной минуты на сухом льду После вращения образца выбросьте супинат. Промойте гранулу РНК с 70% этанолом.

После дополнительного центрифугирования снимите супинат и высушите гранулу в вакууме. Затем растворите очищенные образцы РНК, меченные P 32. В 330 микролитров одноразового реакционного буфера пипеткой вносите 30 микролитров раствора РНК в новую реакционную пробирку.

Осаждение РНК с помощью этанола и затем сушка гранулы в вакууме после высыхания, эта гранула может быть использована для создания контрольной лестницы, как описано в письменной методике, для получения оставшегося буферного раствора РНК путем нагревания при температуре 95 градусов Цельсия в течение двух минут. Нагрейте образцы до комнатной температуры в течение 15 минут, а затем быстро открутите, чтобы вернуть конденсат в раствор. Чтобы начать эксперимент с опорным следом, установите 27 реакционных пробирок для достаточного количества образцов, чтобы заполнить 30-луночный гель для электрофореза.

После включения лестниц и расщепленного контроля определите конечные концентрации магния и железа так, чтобы они были равномерно распределены по логарифмической шкале на несколько порядков вокруг титрования. Инкубируйте растворы РНК и ионов магния при температуре 50 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем смешайте 10 микролитров раствора РНК с 90 микролитрами соответствующего количества раствора магния и железа.

Чтобы достичь конечного объема в 100 микролитров, инкубируйте каждую смесь в течение 30 минут при температуре 50 градусов Цельсия. Затем дайте растворам уравновеситься при температуре 25 градусов Цельсия в течение одного часа, пока не произойдет сворачивание РНК. В то же время, непосредственно перед началом действия гидроксильного радикала в реакции, приготовьте фантомную реакционную смесь, как описано в письменном протоколе.

Приготовьте реакцию перекисного окисления путем пипетирования двух микролитровых капель железа ЭДТА, аскорбата натрия и перекиси водорода в верхней части реакционной пробирки, содержащей раствор РНК, чтобы капли не соприкасались. Запустите реакцию следа путем энергичного перемешивания. Через 15 секунд остановите реакцию, добавив 300 микролитров чистого холодного этанола.

Поверните трубки от трех до пяти раз. Наконец, осадите, промойте и высушите гранулу, как это было сделано ранее в качестве альтернативы окислительной реакции, окислительная гидроксильная реакция будет осуществляться путем добавления пяти микролитров свежеприготовленной реакционной смеси Фентона к образцам. Инкубируйте окислительную реакцию в течение 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия.

Затем добавьте 300 микролитров чистого холодного этанола, чтобы погасить реакцию, и перемешайте, переворачивая трубки. Еще раз выпасаем в осадок. Вымойте и высушите гранулу по завершении окислительной или окислительной реакции.

Растворите высушенные гранулы РНК в восьми микролитрах геля с загрузкой красителя двумя. Подтвердите, что меченая P 32 РНК ресуспендирована, с помощью счетчика Гира приготовьте денатурирующий 8%-ный полиакриламидный секвенирующий гель в соответствии со стандартными протоколами. С помощью 30 лунок гребня загружают образцы, включая два эталона и расщепленный контроль.

Отделите фрагменты РНК при мощности от 60 до 75 Вт в течение двух с половиной часов. Поместите высушенный гель на экран фосфофона для хранения на ночь. Отсканируйте фосфоэкран с помощью системы визуализации для беспленочной авторентгенографии.

Затем передайте файл изображения геля на компьютер для анализа. Чтобы начать анализ данных, откройте Safa и программное обеспечение с открытым исходным кодом для однополосной подгонки и количественной оценки. Загрузите последовательность РНК в виде файла dot TXT, а затем изображение геля в виде файла с точечным гелем.

Определите полосы движения и отрегулируйте интенсивность полос. Затем выбирают якорную полосу и выполняют выравнивание геля по назначению полос нуклеотидам по отношению к лестнице расщепления РНК T one. Количественно оцените интенсивности каналов и используйте функцию цветного графика с косой чертой нормализации для нормализации и назначения потенциально инвариантных остатков.

Сохраните выходные данные в виде txt-файла. SFA выводит электронную таблицу, содержащую столбцы, представляющие полосы на геле, и строки, представляющие отдельные интегралы зоны, соответствующие фрагменту РНК. Во-первых, участки защиты, которые демонстрируют заметное изменение доступности растворителя, должны быть идентифицированы путем сравнения профиля защиты, полученного из образца без ионов магния, с профилем конечной концентрации ионов магния.

Чем ниже значение, тем более защищен нуклеотид от атаки гидроксильных радикалов и наоборот. Затем создайте переходные кривые полосы, интенсивности отдельных или групп нуклеотидов в зависимости от концентрации магния-железа с использованием формата электронной таблицы, индивидуально масштабируйте эти переходы до функции дробного насыщения, как описано в текстовой части этого протокола. В качестве последнего шага подгоните данные под уравнение холма.

Этот анализ масштабирует переход до фракционной сатурации, определяет среднюю точку перехода и обеспечивает феноменологическую проверку того, показан ли переход сигмоидальным. Вот репрезентативные результаты экспериментов по исследованию следа гидроксильных радикалов P четыре, P six. Изотермы были получены из гелей секвенирования, проанализированных Safa, а затем подогнаны, как описано в разделе анализа.

Изображение геля указывает на то, что фоновое расщепление минимально и что назначение одного нуклеотида возможно благодаря четко определенным полосам в одной полосе T. Индуцированная гидроксильными радикалами фрагментация РНК значительно выше фоновой. Переход от низких к высоким ионам магния избирательно связан с уменьшением интенсивности отдельных и групп полос, указывающих на образование РНК.

Третичная структурная защита относится к отдельным или группам смежных нуклеотидов, интенсивность расщепления которых изменяется одновременно, интенсивность полос количественно определяется и нормализуется с помощью саффер-анализа. На выходе получается тепловизионный график, визуализирующий степень защиты от гидроксильных радикалов. Цветовой переход описывает изменение доступности при добавлении магниевого железа: белый к красному показывает более доступные нуклеотиды, тогда как белый к синему показывает более защищенные нуклеотиды.

Каждая степень затенения связана с числовым значением, которое может быть построено в виде кривой защиты и проанализировано с помощью модели привязки, такой как уравнение холма. В этом примере константа равновесной диссоциации, связанная с защитой 1 5 3 по 1 5 5, примерно в два раза больше соответствующего значения защиты 1 6 3 по 1 6 4. Этот эксперимент с гидроксирадикалами может быть проведен за полтора дня, если он выполнен правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать надевать перчатки и лабораторный халат, чтобы избежать загрязнения РНК. Кроме того, конечная концентрация железа зависит от экспериментальной системы. Поэтому мы рекомендуем провести эксперимент с реакцией на дозу перед нанесением отпечатков после этой процедуры.

Другие методы, такие как определение отпечатка гидроксирадикала с временным разрешением, могут быть выполнены для ответа на дополнительные вопросы. Например, в какой критический момент времени молекулы РНК достигают неправильно свернутого или активного подтверждения после своего развития? Этот метод проложил путь исследователям в области структурной биологии к изучению международных, а также промежуточных молекулярных третичных взаимодействий нуклеиновых кислот.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить третичное структурообразование молекул РНК. Не забывайте, что каат и фосфор второй стадии являются опасными мерами предосторожности, такими как ношение перчаток и защитных очков, а также использование экранирования из оргстекла рекомендуется во время выполнения этой процедуры.