Оптические карты потенциалов действия и кальция Переходные процессы в сердце мыши

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном оптическом картировании трансмембранного потенциала и внутриклеточного транзиента кальция в интактных изолированных сердцах мышей, перфузируемых ЛОР. Это достигается путем сначала иссечения неповрежденного сердца мыши, затем канюлирования аорты и начала перфузии ЛОР. Следующим шагом является иммобилизация сердца путем загрузки возбуждающего сокращения на соединитель и последующего прикрепления сердца к перфузионной камере.

Заключительными этапами являются загрузка оптических красителей и подготовка к уменьшению артефактов движения во время эксперимента. Оптические изображения получаются путем сбора света, излучаемого сердцем, с помощью камер Ultima LC Moss. Эй, меня зовут ди.

Я учусь в аспирантуре Вашингтонского университета. Основное преимущество этой методики перед существующим методом, таким как микроэлектрод, заключается в том, что оптическое картирование позволяет получить большее пространственное разрешение по всей поверхности сердца. Привет, меня зовут Мэтт Салкин.

Я учусь в аспирантуре Вашингтонского университета. Этот метод, если он выполнен правильно, может помочь ответить на многие вопросы в электрофизиологии сердца, такие как основы аритмогенеза. Начните с настройки одного перистальтического насоса для циркуляции растворов со скоростью 40 миллилитров в минуту.

Затем установите второй перистальтический насос на 80 миллилитров в минуту. Этот насос возвращает Perfuse eight обратно в резервуар для хранения и насыщения кислородом. Включите насосы и промойте систему одним литром 70% этанола в течение 30 минут с рециркуляцией.

После этого промойте двумя литрами деионизированной воды без рециркуляции. После того, как вода будет откачана, налейте два литра раствора Tyro и пропустите его через пятимикронный фильтр. Нагрейте перфузу до восьми-37 градусов Цельсия с помощью водяной рубашки и пузырькового газа циркулятора добавьте в раствор.

Отрегулируйте скорость барботирования газа, чтобы поддерживать pH на уровне 7,35 плюс-минус 0,05. Контролируйте как pH, так и температуру во время эксперимента. Двойной оптический картографический аппарат состоит из двух высокоскоростных камер C moss, которые могут захватывать изображение размером 100 на 100 пикселей со скоростью 3000 кадров в секунду.

Прикрепите полосовой фильтр к камере визуализации кальция и прикрепите фильтр длинного пропускания к камере визуализации напряжения на держателе двойной камеры. Прикрепите зеркало и линзу так, чтобы свет, исходящий от сердца, фокусировался на зеркале линзой. Кроме того, прикрепите к держателю две камеры и расположите их так, чтобы они были перпендикулярны друг другу.

Далее установите лампочку возбуждения. Свет генерируется галогенной лампой и направляется через гибкий световод. Пропустите свет через тепловой фильтр, затвор для ограничения экспозиции и фильтр с полосой возбуждения.

Наконец, подготовьте электроды из серебра и хлорида серебра, установив их в камеру. После двойной проверки и регулировки уровней на усилителях и фильтрах настройка готова к сердцу. Используйте коктейль из кетамина и ксилазина со 100 единицами гепарина, чтобы обезболить мышь, прежде чем продолжить.

Убедиться в отсутствии болевого рефлекса у животного можно с помощью щипки на пальце ноги. После выполнения разреза на средней части грудины быстро удалите сердце и окружающие ткани. Затем с помощью препарирующего микроскопа быстро определите аорту и сделайте чистый разрез поперек восходящей аорты ниже правой подключичной артерии.

Теперь прикрепите короткий участок аорты к изготовленной на заказ канюле 21 калибра с помощью четырех черных плетеных шелковых швов После канюляции ретро значительно перфу и супер слияние сердца. С помощью раствора Tyro отрегулируйте скорость потока, чтобы давление в аорте колебалось от 60 до 80 миллиметров. Ртуть, измеренная с помощью датчика давления.

Теперь рассеките и удалите окружающие легкие вилочковую железу и жировую ткань. Теперь вставьте силиконовую трубку в левый желудочек через легочные вены. Пришить трубку к близлежащей соединительной ткани.

Этот очень важный шаг предотвращает застой и закисление перфузии восьмерки, застрявшей в левом желудочке, особенно после подавления желудочковых сокращений. Чтобы предотвратить перфузные восемь индуцированных сердечных движений, прикрепите сердце к нижней части перфузионной камеры, покрытой защитой порога, на ее вершине. Кроме того, растяните и прижмите правый и левый придатки предсердия, чтобы увеличить площадь поверхности предсердий в вертикальном положении.

Это позволит максимально увеличить площадь поверхности записи. Чтобы провести стимуляцию стимуляции, прикрепите к поверхности сердца специально изготовленный электрод. Чтобы уменьшить артефакты движения, закрепите небольшое покровное стекло над сердцем на поверхности раствора.

Для этого заклинив стекло между несколькими штифтами. В качестве заключительных приготовлений сфокусируйте возбуждающий свет на сердце и расположите камеры так, чтобы получить оптическое изображение, затем начните загрузку красителя во время загрузки матриц. Непрерывно контролируйте записи ЭКГ, чтобы обеспечить нормальную электрическую функцию сердца.

Начните с прогрева статинов BLEs до комнатной температуры. Затем смешайте полмиллилитра статина BLEs с обильными восемью в резервуаре для хранения и разведите оставшийся 10-й миллилитр статина BLEs в одном миллилитре раствора Tyros. В течение следующих 20 минут медленно вводите статин BLEs в тирос через порт для лекарств рядом с канюлей.

Статин BLEs будет постепенно уменьшать артефакт движения. Затем разведите 30 микролитров чувствительного к напряжению красителя в одном миллилитре раствора тиро и медленно вводите эту смесь в течение пяти-семи минут в тот же порт для лекарства. Затем снова сделайте ту же смесь.

На этот раз, добавив дополнительно 30 микролитров показателя кальция. Медленно наносите эту смесь в течение пяти-10 минут через тот же порт. После введения индикатора кальция подождите еще пять-10 минут, пока статины BLEs полностью подавят движение, а красители попадут в клетки, прежде чем приступать к эксперименту.

Эта сердечная подготовка была сделана. Согласно протоколу, сигналы ЭКГ регистрировались во время стимуляции желудочков от стимуляции S one S one. Потенциалы действия и переходные сигналы кальция регистрировались из предсердий слева и желудочков справа.

Стрелка показывает, где произошло рассеяние сигнала от желудочков путем объединения записей с камеры в единицы три пикселя на три пикселя, массив кальциевых переходных процессов и потенциалов действия может быть отображен из данных массива. Можно построить рисунок, показывающий потенциал проводимости действия. Данные из трех последовательных точек на поперечной и продольной оси показывают изменение амплитуды с распространением потенциала действия по поверхности желудочка.

Аналогичным образом, можно построить рисунок, показывающий потенциал действия и продолжительность переходных процессов кальция. Это показывает условие управления слева справа. В сердце вводили изопротеренол, что явно сокращает продолжительность как переходных процессов кальция, так и потенциалов действия.

После освоения этой техники ее можно завершить за два-три часа после этой процедуры. Другие методы, такие как протокол стимуляции, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о рефрактерном периоде AV-узла.