Оптические карты потенциалов действия и кальция Переходные процессы в сердце мыши
13 сентября 2011 г.
Эта статья подробно процедура вскрытия, инструментальная установка, и экспериментальных условиях при оптическом отображение трансмембранного потенциала (ВМ) и внутриклеточного кальция переходных (КПП) в интактных изолированных Langendorff перфузии мыши сердца.
Общая цель данной процедуры заключается в одновременном оптическом картировании трансмембранного потенциала и внутриклеточных транзиентов кальция в интактных изолированных перфузируемых сердцах мышей в режиме LOR. Это достигается путем первоначального извлечения интактного сердца мыши, последующей канюляции аорты и начала LOR-перфузии. Следующим этапом является иммобилизация сердца путем нагрузки устройства сопряжения возбуждения и сокращения, после чего сердце фиксируется булавками в перфузионной камере.
Заключительные этапы включают в себя введение оптических красителей и подготовку для уменьшения двигательных артефактов во время эксперимента. Оптические изображения получают путем сбора света, излучаемого сердцем, с помощью камер my cam Ultima LC Moss. Привет, меня зовут ди.
Я аспирант Вашингтонского университета. Главное преимущество этого метода по сравнению с существующими, такими как использование микроэлектродов, заключается в том, что оптическое картирование обеспечивает более высокое пространственное разрешение по всей поверхности сердца. Здравствуйте, меня зовут Мэтт Салкин.
Я аспирант Вашингтонского университета. Этот метод при правильном выполнении может помочь ответить на многие вопросы в области электрофизиологии сердца, такие как механизмы возникновения аритмогенеза. Начните с настройки одного перистальтического насоса для циркуляции растворов со скоростью 40 milliliters per minute.
Затем установите скорость второго перистальтического насоса на 80 milliliters per minute. Этот насос возвращает Perfuse eight обратно в резервуар для хранения и оксигенации. Включите насосы и промойте систему одним литром 70% ethanol в течение 30 minutes в режиме рециркуляции.
После этого промойте систему двумя литрами деионизированной воды без рециркуляции. После удаления воды прокачайте два литра раствора Тайро через фильтр с размером пор 5 мкм. Нагрейте перфузат до 37 °C с помощью водяной рубашки и циркулятора, а затем начните барботирование в раствор кислородсодержащего газа.
Отрегулируйте скорость барботирования газа, чтобы поддерживать pH на уровне 7,35 ± 0,05. В ходе эксперимента контролируйте как pH, так и температуру. Установка для двойного оптического картирования состоит из двух высокоскоростных CMOS-камер, способных захватывать изображение размером 100 на 100 пикселей с частотой 3000 кадров в секунду.
Установите полосовой фильтр на камеру для имиджинга кальция и длинноволновой фильтр на камеру для имиджинга напряжения на двойном держателе для камер. Установите дихроичное зеркало и линзу таким образом, чтобы линза фокусировала эмиссионный свет, исходящий от сердца, на зеркало. Также закрепите две камеры в держателе и расположите их перпендикулярно друг другу.
Затем настройте источник возбуждающего света. Свет генерируется галогенной лампой и направляется через гибкий световод. Пропустите свет через тепловой фильтр, затвор для ограничения экспозиции и полосовой фильтр возбуждения.
Наконец, подготовьте электроды из серебра и хлорида серебра, установив их в камеру. После повторной проверки и настройки уровней на усилителях и фильтрах установка готова к работе с сердцем. Перед началом процедуры анестезируйте мышь, используя коктейль из кетамина и ксилазина с добавлением 100 единиц гепарина.
Убедитесь в отсутствии болевого рефлекса у животного, используя метод защемления пальца лапы. После выполнения срединного разреза грудины быстро извлеките сердце и окружающие его ткани. Затем, используя диссекционный микроскоп, оперативно идентифицируйте аорту и сделайте чистый разрез восходящей аорты ниже правой подключичной артерии.
Теперь прикрепите короткий участок аорты к специально изготовленной канюле 21G с помощью четырех плетеных шелковых нитей 4-0 черного цвета. После канюляции проведите ретроградную перфузию и суперфузию сердца раствором Тайро, регулируя скорость потока так, чтобы давление в аорте поддерживалось в пределах от 60 до 80 mm Hg, согласно показаниям датчика давления.
Теперь препарируйте и удалите окружающую ткань легких, тимус и жировую ткань. Введите силиконовую трубку в левый желудочек через легочные вены. Пришейте трубку к прилегающей соединительной ткани.
Этот крайне важный этап предотвращает застой и закисление Perfuse eight, скопившегося в левом желудочке, особенно после подавления сокращений желудочков. Чтобы избежать движений сердца, вызванных введением Perfuse eight, зафиксируйте сердце булавкой к дну перфузионной камеры с покрытием sill guard в области верхушки. Кроме того, растяните и закрепите булавками правое и левое ушка предсердий, чтобы увеличить площадь поверхности предсердий в вертикальном положении.
Это позволит максимально увеличить площадь регистрируемой поверхности. Для проведения стимулирующего воздействия прикрепите изготовленный по специальному заказу электрод к поверхности сердца. Чтобы уменьшить артефакты движения, зафиксируйте над сердцем на поверхности раствора небольшое покровное стекло.
Для этого зафиксируйте стекло, зажав его между несколькими булавками. В качестве завершающего этапа подготовки сфокусируйте свет возбуждения на сердце и установите камеры для получения оптического изображения, после чего приступите к введению красителя. Непрерывно контролируйте запись ЭКГ, чтобы убедиться в нормальном функционировании электрической системы сердца.
Начните с доведения BLEs statin до комнатной температуры. Затем смешайте 0,5 мл BLEs statin с объемом 8 мл в резервуаре для хранения и разведите оставшиеся 0,1 мл BLEs statin в 1 мл раствора Tyros. В течение следующих 20 минут медленно вводите BLEs statin в растворе tyros через порт для лекарственных средств рядом с канюлей.
Статин BLEs постепенно уменьшит двигательный артефакт. Затем разведите 30 µL вольт-чувствительного красителя в 1 mL раствора Тайро и медленно введите эту смесь в течение пяти-семи минут в тот же порт для подачи препаратов. После этого повторно приготовьте такую же смесь.
В этот раз добавьте еще 30 µL индикатора кальция. Медленно введите эту смесь через тот же порт в течение 5–10 минут. После инъекции индикатора кальция подождите еще 5–10 минут, чтобы статин BLE полностью подавил движение, а красители проникли в клетки, прежде чем приступать к эксперименту.
Был подготовлен данный препарат сердца. Согласно протоколу, сигналы ЭКГ регистрировали во время стимуляции желудочков в режиме S1-S1. Потенциалы действия и сигналы кальциевых транзиентов регистрировали в предсердиях слева и в желудочках справа.
Стрелка указывает место рассеивания сигнала из желудочков; путем объединения записей с камеры в блоки размером три на три пикселя на основе данных массива можно отобразить массив кальциевых транзиентов и потенциалов действия. Таким образом может быть построен график, демонстрирующий проведение потенциала действия. Данные из трех последовательных точек на поперечной и продольной осях показывают изменение амплитуды при распространении потенциала действия по поверхности желудочка.
Аналогичным образом может быть построен график, демонстрирующий продолжительность потенциала действия и кальциевых транзиентов. На нем слева представлено контрольное состояние, а справа — результат после введения в сердце изопротеренола, который отчетливо сокращает продолжительность как кальциевых транзиентов, так и потенциалов действия.
После освоения данную технику можно выполнить за два-три часа, следуя этой процедуре. Для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, касающиеся рефрактерного периода АВ-узла, могут быть применены другие методы, такие как протокол стимуляции.
Обзор
В данном исследовании представлен подробный протокол оптического картирования трансмембранного потенциала и внутриклеточных переходных процессов кальция в изолированных сердцах мышей, перфузируемых по методу Лангендорфа. Данный метод позволяет повысить пространственное разрешение по сравнению с традиционными методами, обеспечивая более глубокое понимание электрофизиологии сердца.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Электрофизиология сердца
- Методы оптического картирования
- Модели сердца мыши
Теоретические основы
- Оптическое картирование позволяет проводить одновременное измерение Vm и CaT.
- Традиционные методы, такие как использование микроэлектродов, имеют ограничения по пространственному разрешению.
- Данный метод может помочь в исследовании аритмогенеза.
- Перфузия Лангендорфа поддерживает жизнеспособность сердца для проведения экспериментов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод оптического картирования в сердцах мышей.
- Углубить понимание электрической активности сердца.
- Способствовать исследованию механизмов возникновения аритмий.
Используемые методы
- Извлечение и канюляция сердца мыши для перфузии.
- Использование высокоскоростных камер для получения оптических изображений.
- Введение оптических красителей для визуализации трансмембранного потенциала и кальциевых транзиентов.
- Мониторинг pH и температуры во время эксперимента.
Основные результаты
- Успешное оптическое картирование Vm и CaT в изолированном сердце.
- Продемонстрировано снижение артефактов движения при применении красителя.
- Эффективная запись потенциалов действия и сигналов кальциевых транзиентов.
- Метод валидирован для дальнейших электрофизиологических исследований.
Выводы
- Метод оптического картирования обеспечивает высокое пространственное разрешение.
- Данный метод может способствовать развитию исследований в области электрофизиологии сердца.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для изучения механизмов аритмогенеза.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Оптическое картирование трансмембранного потенциала и кальциевых транзиентов в сердцах мышей предоставляет пространственные и временные данные высокого разрешения, которые имеют решающее значение для механистического снижения рисков при валидации сердечно-сосудистых мишеней. Данный подход позволяет проводить количественную оценку электрофизиологических фенотипов, что повышает прогностическую достоверность доклинических моделей аритмии и сердечной недостаточности. За счет одновременной регистрации динамики Vm и CaT этот метод связывает фундаментальные биологические исследования с подбором трансляционных биомаркеров в системах, релевантных для данных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования динамики потенциалов действия и транзиентов кальция в сердечной ткани.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет одновременной визуализации параметров сопряжения возбуждения и сокращения.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени путем установления связи между молекулярными изменениями и функциональными электрофизиологическими показателями.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующей оценки соединений с помощью стандартизированного сбора оптических сигналов.
- Количественные показатели: Получение воспроизводимых измерений длительности потенциала действия, скорости проведения и амплитуды кальциевого транзиента.
- Масштабируемость: Обеспечение возможности повторного использования платформы для различных моделей сердечных заболеваний благодаря единообразным протоколам перфузии по Лангендорфу и загрузки красителя.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: применимо к исследованиям сердечной недостаточности, аритмий и метаболических заболеваний с использованием генетически модифицированных моделей мышей.
- Трансляционная преемственность: позволяет связать механизмы, выявленные на этапе открытия, с доклинической валидацией благодаря сохранению архитектуры тканей и физиологической перфузии.
- Принятие решений с учетом рисков: определяет критерии дальнейшего продвижения препарата путем количественной оценки электрофизиологических рисков на ранних этапах разработки.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки: от проверки гипотез относительно мишеней и идентификации ведущих соединений до оценки доклинической эффективности, что позволяет итеративно совершенствовать кардиоваскулярные кандидаты на основе функциональных электрофизиологических показателей.
- Биология открытий: способствует уточнению сигнальных путей и снижению рисков при изучении механизмов путем корреляции генетических или фармакологических воздействий с пространственными электрофизиологическими паттернами.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию анализа и получение количественных данных, необходимых для надежного скрининга соединений при поиске ионных каналов и их модуляторов.
- Аналитика: предоставляет пространственно-временные измерения Vm и CaT, позволяющие проводить сравнительный анализ различных экспериментальных условий и генотипов.
- Трансляционные исследования: поддерживают физиологическую релевантность благодаря перфузии по Лангендорфу, что позволяет экстраполировать данные на ответы целого органа.
- Корпоративное повторное использование: создает базу для многократного использования возможностей электрофизиологического фенотипирования в рамках различных сердечно-сосудистых проектов и классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в электрофизиологии сердца.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря четко определенным параметрам перфузии, загрузки красителя и визуализации.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») путем выявления электрофизиологических рисков до осуществления значительных инвестиций.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе количественных профилей потенциала действия и кальциевых транзиентов.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в области диссекции сердца, перфузии по Лангендорфу и использования систем оптической визуализации.
- Метод зависит от наличия высокоскоростных CMOS-камер, источников возбуждающего света и наборов оптических фильтров для двухканального детектирования.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов введения красителя и стратегий снижения артефактов движения.
- Требуется адаптация метода при переходе на другие линии мышей или модели заболеваний с измененной физиологией сердца.
- Существуют практические ограничения, такие как токсичность красителя, фотовыгорание и необходимость тщательного подавления движений для поддержания качества данных.
