Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Общая цель данного эксперимента заключается в количественном измерении субнуклеарной организации в клетках дрожжей и изучении того, как на неё влияют изменения условий роста или мутации. Для этого клетки дрожжей выращивают до логарифмической фазы в условиях, минимизирующих автофлуоресценцию. Затем клетки помещают в камеру для выращивания для последующего наблюдения под микроскопом.

Затем делают снимки для измерения расстояния между различными флуоресцентно-меченными структурами в клетке. Полученные результаты демонстрируют различия в внеядерной организации, которая зависит от изменения условий питания при выращивании культуры дрожжей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики о взаимодействии между субъядерной организацией хроматина и регуляцией генов.

Для работы с рыбой и дрожжами сначала готовят эдинбургскую минимальную среду (EMM) или EMM с добавлением хлорида аммония для снижения автофлуоресценции вместо автоклавирования. Раствор глюкозы стерилизуют через фильтр с порами 0,2 мкм и добавляют в автоклавированную среду. В 30-мл пробирки с 3 мл среды EMM инокулируют клетки рыбы и дрожжей.

После выращивания на чашке с агаром в богатой среде YEA, слегка прикройте пробирки крышками и инкубируйте клетки в шейкере при 225 RPM и 30 °C. Поддерживайте клетки в логарифмической фазе роста в течение двух дней, подсчитывая их с помощью камеры Бурка каждое утро и вечер и разбавляя их до нужной плотности. В день проведения эксперимента.

Клетки должны находиться в ранней логарифмической фазе роста. Следуя процедуре, описанной в письменном протоколе, соберите клетки в один осадок на дне центрифужной пробирки объемом 1,5 мл (типа Eppendorf), центрифугируя при максимальном значении 1,5 RCF сначала в течение двух минут, затем перевернув пробирку на 180 градусов и центрифугируя еще две минуты. Удалите весь супернатант, оставив 10–15 µL, и ресуспендируйте клетки в оставшейся среде, добавив аликвот лектина, стерилизованного фильтрованием, в концентрации 1 mg/mL.

Добавьте 5 µL раствора лектина в угол покровного стекла, затем добавьте 5 µL культуры в каплю лектина. Для создания камеры роста базовых клеток S. pom пипеткой нанесите 5 µL EMM на чистый предметное стекло, затем под углом 70° переверните покровное стекло с культурой над средой и опустите его сверху на EMM, загерметизировав края силиконовой смазкой. Отрежьте широкий конец наконечника на 200 µL и закрепите узкий конец на шприце объемом 2 mL.

Заполните шприц примерно одним миллилитром силиконовой смазки. Нанесите тонкую линию силикона по краям покровного стекла, осторожно нажимая на поршень шприца, чтобы сформировать камеру для выращивания. Начните с использования метода светлого поля, чтобы обнаружить клетки и приступить к исследованию.

Получите четкое изображение для конфокальной микроскопии. Мы используем лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 700 с планарным апохроматическим иммерсионным объективом 63x и настройкой усреднения плоскостного сканирования по 16 линиям. Установите единицы области на 1 к 1,1, чтобы получить оптический срез толщиной 0,8 µm.

Просканируйте клетки с помощью лазеров, детектирующих Alexa 488 и mCherry или GFP. Запишите достаточное количество изображений, чтобы провести измерения в 60 клетках для каждого стока. Перейдите к новой камере выращивания со свежими клетками.

После 60 минут визуализации откройте изображение в программе Zeen Light Edition, чтобы измерить расстояние между сигналами различных флуорофоров в одной и той же фокальной плоскости. Откройте инструмент измерения и отрегулируйте интенсивность света и контрастность, чтобы определить центр каждого флуоресцентного сигнала, например, тельца полюса веретена и ядерной мембраны, и измерьте расстояние между ними. Перенесите данные в блокнот.

Сравните средние или медианные субклеточные расстояния между различными штаммами и вариантами обработки с помощью статистического программного обеспечения или таких тестов, как T-критерий или критерий Манна — Уитни. В данном примере штамм PJ 1 18 5 выращивали в EMM, после чего образец поместили в камеру для визуализации. Затем взяли аликвоту PJ 1 18 5.

Культуру переносили в среду EMMN и инкубировали в течение 15 минут, после чего образец помещали в камеру роста для визуализации. С помощью измерительного инструмента определяли расстояние от локуса до тельца веретена деления, а также от локуса до ядерной мембраны. Как показано здесь, в клетках, находившихся в условиях азотного голодания, наблюдалось статистически значимое увеличение расстояния при перемещении генного кластера от ядерной мембраны в сторону тельца веретена деления по сравнению с клетками, выращенными на среде с азотом.

Данные измерений расстояния между GFP и SBP имели нормальное распределение, поэтому средние расстояния сравнивали с помощью T-критерия. Между двумя средними значениями была обнаружена значимая разница. Данные измерений расстояния между GFP и NM не имели нормального распределения, поэтому медианные расстояния сравнивали с помощью U-критерия Манна-Уитни.

После выполнения данной процедуры было выявлено значимое различие между двумя медианными значениями. Для получения ответов на дополнительные вопросы о том, как уровень экспрессии генов коррелирует с изменениями в субъядерной организации, можно использовать другие методы, такие как ПЦР в реальном времени.