Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы количественно измерить субядерную организацию в дрожжевых клетках и то, как на нее влияют изменения условий роста или мутации. Это достигается за счет выращивания дрожжевых клеток до логарифмической фазы в условиях, которые сведут к минимуму автофлуоресценцию. Далее клетки помещают в ростовую камеру для просмотра под микроскопом.

Затем делаются изображения для измерения расстояния между различными флуоресцентно помеченными структурами в клетке. Получены результаты, показывающие различия в безъядерной организации, которая зависит от изменения условий питания в процессе роста дрожжевой культуры. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпи о взаимодействии между субарной организацией или хроматином и регуляцией генов.

Тоульская рыба и дрожжи начинают с приготовления эдинбургской минимальной среды или EMM и EMM с также хлоридом аммония для снижения автофлуоресценции, а не автоклава. Используйте фильтр 0,2 микрона для стерилизации раствора глюкозы и добавьте его в среду автоклава. Введите три миллилитра ЭММ в 30-миллилитровые пробирки с рыбьими и дрожжевыми клетками.

Свежевыращенные на агаровой тарелке в богатой среде, YEA слегка закрывают пробирки и инкубируют клетки в шейкере при 225 об/мин и 30 градусах Цельсия. Держите клетки в логарифмической фазе в течение двух дней, подсчитывая их с помощью камеры бирки каждое утро и вечер и разбавляя до соответствующей плотности. В день проведения эксперимента.

Ячейки должны быть ранней фазой логарифма для азотного персонала. Клетки относятся к процедуре, описанной в письменном протоколе, чтобы собрать клетки в одну гранулу на дно пробирочной центрифуги, 1,5 миллилитра клеток в пробирку при максимальной давлении 1,5 RCF путем сначала вращения пробирки в течение двух минут, а затем поворота ее на 180 градусов для дополнительного двухминутного вращения. Удалите все, кроме 10-15 микролитров надосадочной жидкости, и повторно суспендируйте клетки в оставшейся среде, в соотношении один миллиграмм на миллилитр стерилизованного лектина.

Добавьте пять микролитров раствора лектина в угол покровного стекла и добавьте пять микролитров культуры в лектиновую каплю. Чтобы создать ростовую камеру из базовых клеток S-помпона, нанесите пять микролитров ЕММ на чистое предметное стекло и переверните покровное стекло с культурой под углом 70 градусов над средой и опустите его сверху вниз на ЕММ, чтобы запечатать края силиконовой смазкой. Отрежьте широкий конец кончика объемом 200 микролитров и прикрепите узкий конец к двухмиллилитровому шприцу.

Наполните шприц примерно одним миллилитром силиконовой смазки. Нанесите тонкую линию силикона на края покровного стекла, осторожно надавливая на поршень шприца, чтобы отобразить камеру роста. Начните с использования Brightfield Imaging для определения местоположения клеток и копания.

Получите четкую картинку для конфокальной микроскопии. Мы используем лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 700 с плановым апочным хроматом, в 63 раза превышающим масляный объектив, и настройкой сканирования в средней плоскости 16 строк. Установите единицы измерения площади от одного до 1,1, чтобы получить оптический срез размером 0,8 микрона.

Отсканируйте клетки с помощью лазеров, которые обнаруживают Alexa 4 88 и mCherry или GFP. Запишите достаточное количество изображений, чтобы провести измерения в 60 ячейках для каждого дренажа. Переключитесь на новую камеру роста со свежими ячейками.

После 60 минут визуализации откройте изображение в программе Zeen Light Edition, чтобы измерить расстояние между сигналами разных флуорофоров в одной фокальной плоскости. Откройте инструмент измерений и отрегулируйте интенсивность света и контрастность, чтобы определить центр каждого флуоресцентного сигнала, например, корпус полюса шпинделя и ядерную мембрану, и измерьте расстояние между ними. Перенесите данные на лист в блокноте.

Сравните средние или медианные субклеточные расстояния между различными штаммами и методами лечения с помощью статистического программного обеспечения или тестов, таких как Т-критерий или тест ранга Мана Уитни. В этом примере штамма PJ 1 18 5 выращивали в ЭММ и помещали образец в камеру роста для визуализации. Затем аликвота PJ 1 18 5.

Культуру переносили в EMMN и инкубировали в течение 15 минут, прежде чем образец помещали в ростовую камеру для визуализации. Измерительный прибор использовался для измерения расстояния между локусом и телом полюса веретена, а также между локусом и ядерной мембраной. Как показано на рисунке, в клетках, испытывающих дефицит азота, наблюдалась статистически значимая разница в расстоянии кластера генов, удаляющегося от ядерной мембраны к телу полюса веретена, по сравнению с клетками, выращенными в азоте.

Данные, измеряющие расстояние между GFP и SBP, имели нормальное распределение, и, следовательно, средние расстояния можно было сравнить с помощью T-критерия. Между двумя средними значениями наблюдалась значительная разница. Данные, измеряющие расстояние между GFP и NM, не имели нормального распределения, и, следовательно, медианные расстояния сравнивались с помощью теста Уитни

После этой процедуры наблюдалась значительная разница между двумя медианными значениями. Другие методы, такие как ПЦР в реальном времени, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как уровень экспрессии генов коррелирует с изменениями в субъядерной организации.