Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

Общая цель данного эксперимента заключается в количественной оценке экспрессии митоген-активированного белка на уровне отдельных клеток. Для достижения этой цели был получен штамм дрожжей, несущий флуоресцентную экспрессию четырехкратного Venus, контролируемого промотором STL one и специфичного для активации киназы hog one map. Экспрессия флуоресцентных белков может быть количественно определена либо с помощью микроскопии живых клеток, в которой клетки подвергаются стрессу непосредственно на микроскопе, чтобы облегчить видимость флуоресценции в режиме реального времени, либо с помощью проточной цитометрии, в этом случае клетки подвергаются стрессу в микропробирке, и синтез белка блокируется в определенный момент времени.

При добавлении cyclo heide только несколько клеток одновременно могут быть проанализированы с помощью микроскопии живых клеток, но судьба отдельных клеток может быть непосредственно наблюдаема и коррелировать с другими свойствами клеточной цитометрии, с другой стороны, также позволяет оценить экспрессию митоген-активированного белка на большом количестве клеток одновременно. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области передачи сигналов, например, какие белки участвуют в регуляции экспрессии генов. Хотя этот метод может дать представление о дрожжевом пути, он также может быть применен к другому сигнальному каскаду в зависимости от наличия надлежащей экспрессии. Докладчик.

Чтобы подготовить клетки к микроскопии живых клеток, начните с инокуляции пяти миллилитров синтетической среды дрожжами, а затем выращивайте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи. На следующее утро измерьте внешний диаметр 600 ночной культуры, а затем разведите ночную культуру в пяти миллилитрах синтетической среды до наружного диаметра 600 0,05. Выращивайте разведенную культуру при температуре 30 градусов Цельсия еще не менее четырех часов.

Далее отфильтруйте около 200 микролитров свежеприготовленного раствора конна. Через 30 минут достаньте из колодца раствор и добавьте в колодец 150 микролитров воды. Теперь удалите воду и дайте лунке высохнуть, пока клетки готовятся.

Снова измерьте наружный диаметр 600 клеточной культуры, а затем разбавьте клетки для получения 300 микролитров клеточной культуры с наружным диаметром 600 0,02 и микропробиркой объемом 1,5 миллилитров. Облучайте клетки ультразвуком на водяной бане в течение 45 секунд. Кратковременно сделайте вихревые обработки микротрубок, а затем снова обработайте клетки ультразвуком и вихревыми

Теперь добавьте 200 микролитров клеток в предметное стекло лунки, а затем, дав ячейке осесть на дно лунки около 30 минут, поместите предметное стекло на микроскоп. Затем выберите настройки освещенности для их флуоресцентного канала, который будет записываться, и для двух изображений яркого поля, отрегулировав одну из настроек яркого поля примерно на три микрона ниже фокальной плоскости, чтобы обеспечить правильную сегментацию клеток. Затем задайте временные интервалы для измерений интервальной съемки и выберите поля зрения для визуализации.

Теперь начните сбор данных на несколько кадров, а затем приостановите сбор данных, чтобы добавить 100 микролитров свежеприготовленной среды с содержанием 0,6 моляра хлорида натрия, и возобновите визуализацию, чтобы подготовить клетки к измерению с помощью проточной цитометрии. Начните с инокуляции дрожжей в пять миллилитров синтетической среды и выращивайте клетки в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия. На следующее утро измерьте внешний диаметр 600 ночной культуры, а затем разведите клеточную суспензию в пяти миллилитрах синтетической среды до наружного диаметра 600 0,1.

Выращивайте культуру не менее четырех часов при температуре 30 градусов Цельсия, чтобы достичь наружного диаметра 600 от 0,2 до 0,4. Затем добавьте 100 микролитров свежеприготовленного 0,6 моляра хлорида натрия в микропробирку объемом 1,5 миллилитра для каждой временной точки, которая должна быть измерена в нулевой момент времени. Добавьте по 200 микролитров клеток в каждую микропробирку и инкубируйте культуры при встряхивании при 30 градусах Цельсия.

Затем в каждую из экспериментальных временных точек добавляйте по 30 микролитров свежеприготовленного cyclo heide в одну из микропробирок. Во время инкубации микротрубок добавьте 400 микролитров PBS в одну соответствующую факсимильную трубку для каждой микротрубки. После инкубации кратковременно перебейте микротрубки, а затем обработайте клетки ультразвуком и добавьте водяную баню на одну минуту, как показано выше.

Затем добавьте 100 микролитров клеточной культуры из каждой микропробирки в соответствующую факсимильную трубку по потоку цитометра. Загрузите соответствующие настройки возбуждения и детектирования и проверьте неэкспрессирующие и полностью экспрессирующие образцы, чтобы убедиться, что они попадают в диапазон чувствительности детектора. Наконец, измерьте 10 000 клеток для каждого образца на этих изображениях, дрожжевые клетки, несущие экспрессию репортерного четырехвенозного белка под контролем промотора TL one и прикрепленные к дну предметного стекла лунки, стимулировались прямым вводом стрессовой среды.

Как только что было продемонстрировано, клетки контролировались в течение примерно двух часов с интервалом в 10 минут, а изображения были получены как до, так и после ввода стимула. Обратите внимание, что флуоресцентная экспрессия сообщает во время активации клеток. Чтобы извлечь количественную информацию, содержащуюся в этих изображениях, необходимо выполнить сложный процесс анализа изображений.

Показаны результаты, полученные с помощью платформы количественного анализа дрожжей. Каждый красный след представляет собой временную эволюцию средней интенсивности флуоресценции отдельной клетки. Синяя линия иллюстрирует медиану из более чем 500 клеток, которые были сегментированы и отслежены на протяжении 20 кадров пяти видеороликов, снятых с пяти разных полей зрения из одного и того же колодца; светло-голубая область представляет собой 25-й и 75-й процентиль всех интенсивностей, измеренных в данный момент времени для изучения динамики экспрессии одного и того же репортера: циклогексимид был добавлен к дрожжам Клеточные культуры в разные моменты времени с интервалом от пяти до 10 минут.

Препарат блокирует синтез новых белков, но созревание уже выраженного флуоресцентного белка не нарушается. Таким образом, экспрессия белка, визуализируемая смещением гистограммы вправо, может быть количественно определена во время издания цикла H, обходя проблемы, связанные с созреванием флуоресцентных белков. На этом графике сравнивается динамика экспрессии репортера, измеренная с помощью микроскопии или проточной цитометрии, в то время как флуоресцентный сигнал повышается через 30-40 минут после формирования стрессовой среды, измеренной с помощью микроскопии, измерения проточной цитометрии ясно указывают на то, что белки уже произведены через 10-15 минут после стимула, демонстрируя медленное созревание флуоресцентных белков.

Оба метода обеспечивают доступ к информации об отдельных клетках для этих простых экспериментов, вариабельность между тремя биологическими репликами мала по сравнению с большой вариабельностью, наблюдаемой в ответах отдельных клеток с помощью микроскопии или проточной цитометрии. После этих процедур могут быть выполнены другие методы, подобные измерениям реакции, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, например, какой порог для экспрессии генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять экспрессию белка на уровне отдельных клеток с помощью микроскопа проточной цитометрии.