Мониторинг изменений в внутриклеточной концентрации кальция и синаптической эффективности в Моллюск Aplysia

Внутриклеточный кальций считается важной частью нескольких механизмов синаптической пластичности. Эти идеи могут быть проверены путем одновременного мониторинга изменений кальция и изменений в синаптической эффективности. Здесь мы демонстрируем, как это достигается путем объединения визуализации кальция с внутриклеточной записью.

Наши эксперименты проводятся с ганглием моллюска Aplysia Cahora. Этот препарат имеет ряд преимуществ, таких как большие идентифицированные нейроны, низкие температуры, которые являются естественными для apia, медленные сигналы и облегчение визуализации, но общие методы, которые мы демонстрируем, легко переносятся на другие системы. Здравствуйте, меня зовут Колин Эванс, я работаю в лаборатории Элизабет Кроппер на факультете неврологии Фишбурга и в Институте мозга Фридмана при Медицинской школе Маунт-Синай в Нью-Йорке.

Сегодня мы продемонстрируем одновременную визуализацию изменений внутриклеточной концентрации кальция и синаптической эффективности в буккальном ганглии моллюска Aplysia cahora. Чтобы обнаружить внутриклеточный кальций, мы введем пресинаптический нейрон с клеткой IMP перминированного индикатора кальция красителем кальциевого оранжевого цвета. Затем препарат перемещают под микроскопом, а пре- и постсинаптические нейроны прокалывают острыми электродами.

Повторная пресинаптическая стимуляция приводит к усилению постсинаптического ответа, который проявляется в увеличении постсинаптического потенциала или амплитуды PSP. Измерение флуоресцентного сигнала индикаторного красителя кальция позволит обнаружить одновременные изменения пресинаптического внутриклеточного кальция. Для начала обезболивания взрослого животного весом около 150 граммов путем введения 75 мил изотонического раствора хлорида магния, приколите обезболенного животного к посуде, покрытой воском, затем с помощью грубых щипцов и ножниц сделайте разрез на ноге животного и обнажите буккальное образование.

Буккальный ганглий лежит на вентральной стороне щечного массива и состоит из двух соединенных между собой полуганглий. Он содержит несколько сотен нейронов, которые вместе с нейронами в других ганглиях участвуют в формировании и контроле пищевого поведения животного. Осторожно освободите ганглий, разрезав тонкими ножницами все застегнутые нервы, и снимите его с животного.

Затем приколите освобожденный ганглий к основанию посуды, покрытой силовой защитой, наполненной искусственной морской водой. Ганглий обернут оболочкой из соединительной ткани, которая должна быть удалена, чтобы обнажить отдельные нейроны. Используйте проверяющие щипцы, ножницы для радужной оболочки глаза и особую осторожность, чтобы отрезать эту оболочку.

Чтобы избежать повреждения нейронов, стабилизируйте ганглий оболочки с помощью примерно 15-минутных штифтов, так как любое движение будет проблематичным во время визуализации. Чтобы подготовить острые электроды для внутриклеточной регистрации и введения красителя, протяните капиллярную трубку с помощью микроэлектродного съемника. Мы используем тонкостенное силикатное стекло боа с наружным диаметром один миллиметр.

Регистрирующие электроды должны иметь сопротивление около 10 мега при заполнении трехмолярным ацетатом калия, поэтому мы соответствующим образом настраиваем съемник для заполнения D-электродов. Окуните заднюю часть вытянутого электрода в 10 миллимолярный раствор кальциево-оранжевого красителя капиллярного действия вдоль стеклянной нити внутри электрода, который втянет краситель в наконечник, затем заполните электрод 200 миллимолярным хлоридом калия, чтобы обеспечить хороший электрический контакт. Мы используем специально изготовленный Bela для улучшения свойств электродов и снижения сопротивления записывающего электрода примерно до пяти мега

Электрод удерживается под углом 45 градусов в потоке суспензии оксида алюминия. Подмешивание хлорида натрия в суспензию и подключение измерителя позволяет контролировать сопротивление электрода. В процессе снятия фаски мы переносим чашку, содержащую обманутые ганглии пряжки, в электрофизиологическую установку и находим интересующие нейроны, прокалывая их электродами и проверяя их идентичность.

Чтобы подготовить нейрон к визуализации кальция, мы сначала вставляем электрод, наполненный красителем, в клетку и теоретически загружаем электрод красителя 30 минутами гиперполяризующих импульсов тока с силой тока 15 наноампер. Когда оранжевый кальций D попадает в клетку, СОР приобретает слабый розовый цвет. Затем мы осторожно втягиваем записывающие электроды и оставляем препарат как минимум на 30 минут, чтобы краситель мог диффундировать в мелкие процессы нейрона.

Далее перенесите блюдо с заготовкой в флуоресцентный микроскоп. Мы используем 10-кратную линзу погружения в воду NA 0,3 на вертикальном стационарном микроскопе, который фокусируется путем перемещения линзы, а не предметного столика. Это облегчает монтаж манипуляторов.

Для записывающих электродов выберите подходящий фильтрующий блок. Блок из трех фильтров системы СИ обеспечит правильные фильтры возбуждения и излучения для кальциевого оранжевого цвета, отрегулирует параметры камеры и интенсивность освещения с помощью фильтров нейтральной плотности и полевой апертуры. Большее количество света приведет к уменьшению шума, но потенциально может привести к отбеливанию препарата.

Крутая ПЗС-камера может захватывать поле 500 на 300 пикселей с частотой кадров около 30 кадров в секунду и хорошим соотношением сигнал/шум. Сведите к минимуму освещение фил-нейронов, по возможности держа затвор источника света закрытым. В программном обеспечении для обработки изображений выберите области интереса или R ois.

Эти области определяют, где программное обеспечение будет проводить измерения интенсивности. Обычно мы визуализируем первичные, вторичные и третичные ветви пресинаптического нейрона. Поместите дополнительный ROI рядом с дифинейроном, чтобы получить фоновое значение, которое позже будет вычтено из всех остальных точек данных.

Внутриклеточные записывающие электроды в пре- и постсинаптических нейронах используются для индуцирования и мониторинга синаптической передачи. Вы можете обеспечить синхронизацию между электрофизиологическим сбором данных и получением изображений, если используете триггерный сигнал камеры для запуска программного обеспечения для сбора данных. Еще один способ обеспечить синхронизацию — вмонтировать светодиод внутрь порта камеры.

Этот светодиод кратковременно включается в начале сеанса записи, и тем самым обеспечивает метку синхронизации. Во время типичного эксперимента вы запускаете потенциалы действия в пресинаптическом нейроне путем инъекции коротких импульсов тока. В этом примере мы демонстрируем всплеск спайков и соответствующее увеличение сигнала кальция для проверки конкретных гипотез.

Кальциевым сигналом можно манипулировать и определять влияние на синаптическую передачу. Например, такие препараты, как хелататор кальция EGTA, могут вводиться пресинаптически или применяться через систему перфузии. Данные анализируются путем их экспорта из программного обеспечения для визуализации в текстовый файл, а затем в программное обеспечение, которое использовалось для получения электрофизиологических данных, которое в нашем случае является вторым спайком от Cambridge Electronic Design.

Мы используем специально написанный скрипт для построения графиков значений интенсивности ROI и соответствующих изменений мембранного потенциала, количественно оцениваем изменения в сигнале кальция путем вычитания фонового сигнала, полученного из фонового ROI, и расчета относительного изменения с помощью показанного уравнения. F zero — флуоресценция непосредственно перед стимуляцией, а F — флуоресценция во время стимуляции. Здесь мы показываем результаты эксперимента, в котором мы визуализировали изменения флуоресценции кальция в идентифицированном нейроне B 21.

Область, которую мы визуализировали, обозначена в А, в единице В мы индуцировали всплеск спайков в В 21, который индуцировал постсинаптические потенциалы в В 8 и изменение кальциевого сигнала. В два показан эффект от инъекции хелатора кальция. Всплески EGTA в B 21 больше не вызывают повсеместного увеличения флуоресценции кальция, а амплитуда постсинаптического потенциала уменьшается.

В заключение мы продемонстрировали методики, которые могут быть использованы для одновременного мониторинга внутриклеточной концентрации кальция и оценки эффективности синаптической передачи. Эти методы требуют лишь скромного оборудования по сравнению с большинством функциональных методов визуализации, и их легко и быстро освоить.